Küçük Ölçekli Hücre İşleme için Otomatik Karşı Akım Santrifüj Sistemi
Summary
Otomasyon, hücre üretiminde yükseltme ve maliyet yönetiminin anahtarıdır. Bu el yazması, küçük ölçekli biyoişleme için arabellek değişimi ve hücre konsantrasyonu adımlarını otomatikleştirmek için bir karşı akış santrifüj hücre işleme cihazının kullanımını açıklar.
Abstract
Gen ve hücre bazlı tedavilerin başarılı bir şekilde ticarileştirilmesi, uygun maliyetli ve ölçeklenebilir üretim süreçleri gerektirir. Tampon değişimi ve ürün konsantrasyonu çoğu üretim süreci için gerekli bileşenlerdir. Ancak, ürün geliştirmenin erken aşamalarında, bu adımlar genellikle el ile gerçekleştirilir. Tampon değişimi için manuel çıkmaz santrifüj emek yoğun, pahalı ve ölçeklenebilir değildir. Kapalı otomatik bir sistem bu zahmetli adımı etkili bir şekilde ortadan kaldırabilir, ancak uygulama zor olabilir. Burada, küçük ve orta ölçekli hücre işleme için uygun olan ve manuel işleme ve büyük ölçekli otomasyon arasındaki boşluğu kapatmayı amaçlayan yeni geliştirilmiş bir hücre işleme cihazını tanımlıyoruz. Bu protokol, akış hızı ve santrifüj hızını değiştirerek çeşitli hücre tiplerine ve süreçlerine kolayca uygulanabilir. Protokolümüz, manuel işlemle karşılaştırıldığında daha kısa işlem süreleriyle yüksek hücre kurtarmasını gösterdi. Otomatik işlemden kurtarılan hücreler de çoğalma oranlarını korudu. Cihaz, arabellek değişimi, hücre formülasyonu ve kriyopreservation gibi adımları karşılamak için kapalı bir üretim sürecinde modüler bir bileşen olarak uygulanabilir.
Introduction
Modern tıbbın manzarası gen ve hücre temelli tedavilerdeki (GCT) son gelişmelerle hızla değişmiştir. Çeviri araştırmalarında en hızlı büyüyen alanlardan biri olan GCT sektörü, benzersiz ve eşi görülmemiş zorluklarla da karşı karşıyadır. Sağlam klinik sonuçlara ek olarak, verimli ve uygun maliyetli üretim süreçleri GCT ticari başarı için gereklidir, özellikle küçük ölçekli üretim elde etmek zordur1. Zaman maliyeti, işçilik, ve kalite güvenceleri hücrelerin her toplu sadece yüz veya binlerce yerine bir hasta için birkaç doz üretir büyütülür. Üretim süreçlerinin antikor ve rekombinant protein üretimine daha çok benzediği allojen hücre tedavilerinden farklı olarak, otolog hücre tedavileri genellikle küçük ölçeklioperasyonlar1 olarak üretilmektedir. Biyofarmasötik üretiminde nispeten yeni bir fenomen olarak2, küçük ölçekli hücre işleme seçenekleri şu anda oldukça sınırlıdır.
Arabellek değişimi hücre üretimi için gereklidir. Hücrelerin kültür medyasından çıkarıldığı ve kriyopreservation veya infüzyonu için yoğunlaştığı alt akım süreçlerinden biridir. Şu anda, küçük ölçekli hücre üretimi genellikle akademik araştırma ortamında benzer süreçler uygular ve sterilite korumak için özel temiz odalar güvenir3. Manuel downstream süreçleri genellikle hacim azaltma ve tampon değişimi için pelet ve yeniden hücreleri askıya benchtop santrifüjler kullanın. Bu açık süreçler pahalı (yani, işçilik ve temiz oda bakımı) ve ticari üretim için ideal olmayan sınırlı üretim kapasitesine sahip2,3.
Otomasyonun uygulanması, üretim verimliliğini artırmak ve ticari ölçekli üretimlere ulaşmak için bir çözüm olarak önerilmiştir2. Gama ışınlaması veya terminal uç filtrasyon gibi biyolojik yöntemlerle hücre bazlı ürünlerde sterilite elde edilemez. Bunun yerine, kontaminasyon risklerini azaltmak için otomatik kapalı bir sistem kurulur ve operatörler sterilite4korumak için temiz odalara güvenerek. Proses otomasyonu, aynı zamanda birden fazla sistem paralel çalışan (ölçeklendirme) ya da sırayla operatörler arasındaki değişkenliği en aza indirir bireysel bir cihazın işleme kapasitesini (ölçeklendirme) artırarak ölçeklenebilirlik sorunu giderir. Ayrıca, otolog tedavilerin maliyet modelleme analizi otomasyon üretim maliyetini azaltabilir düşündürmektedir5,6. Ancak, otomatik bir üretim platformu7kullanılan bir otolog kök hücre klinik çalışmada hiçbir maliyet avantajı bulundu 7 , otomasyon maliyet yararı bireysel üretim sürecine bağlı olabileceğini düşündürmektedir.
Otomasyonun mevcut bir üretim sürecine dahil edilebildiği farklı stratejiler vardır. Bu, tam entegre bir platform veya modüler tabanlı bir işlem zinciri uygulanarak elde edilebilir. CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Oktan Biotech) ve Quantum (Terumo BCT) gibi otolog hücre üretimi için ticari olarak kullanılabilen birkaç tam entegre platform bulunmaktadır. Genellikle “GMP-in-a-box” olarak tanımlanan bu entegre platformlar, altyapı konusunda düşük taleplere sahiptir ve kullanımı kolaydır. Ancak, tam entegre bir kurulumun üretim kapasitesi sisteme bağlı kuluçka makinesi ile sınırlandırılabilir. Örneğin, Prodigy’nin kültür kapasitesi 400 mL haznesi8 ile sınırlıdır ve Quantum kartuşunun 2,1 m2 (120 T175 şişeye eşdeğer)olarakayarlanmış sınırlayıcı bir yüzey alanı vardır 7 , daha yüksek hücre dozları gerektiren hastalar için yeterli olmayabilir9,10. Ayrıca, Prodigy ve Quantum kullanımlarını sınırlayan ortak bir özelliğe sahiptir: operasyonel birim hücre genişletme dönemi boyunca tek bir hücre grubu tarafından işgal edilir, böylece her birim11tarafından imal edilebilen toplu iş sayısını sınırlandırır. Otomasyon için modüler yaklaşım ticari üretim süreci 12 simüle birden fazla modüler birimleri ile bir üretim zinciri oluşturmaktır12,13. Kültür cihazını hücre yıkama cihazından ayıran bu yaklaşım, böylece üretim verimliliğini en üst düzeye çıkarabilir. İdeal bir işleme cihazı uyarlanabilir ve üretim ihtiyacı12ölçeklenebilir biri olacaktır.
1970’li yıllara dayanan karşı akış santrifüj (CFC) teknolojisi, hücre işleme de uzun bir geçmişe sahip14. Santrifüj kuvvetini bir karşı akış kuvvetiyle dengeleyerek hücre konsantrasyonu ve ayrıştırma sağlar. Tipik olarak, bir hücre süspansiyonu bir hücre odasının dar ucundan sabit bir akış hızı altında bir santrifüj kuvvete maruz kalırken girer (Şekil 1A). Sıvının akışı santrifüj kuvvetine ters yönde yapılır. Buna, hücre odası içinde bir degrade oluşturan karşı akış kuvveti denir. Hücre odası koni şeklindeki hücre odasının ucundan genişledikçe karşı akış kuvveti azalır. Daha yüksek yoğunluklu ve daha büyük çapı olan hücreler daha yüksek bir sedimantasyon hızına sahiptir ler ve böylece koni şeklindeki hücre odasının ucuna doğru kuvvet dengesine ulaşırlar. Küçük parçacıklar haznetabanına doğru dengeye ulaşabilir veya haznede tutulamayacak kadar küçük olabilir ve yıkanır. CFC teknolojisi çoğunlukla dendritik hücre tedavileri için monosit izole gibi kan aferez ürünleri işleme uygulaması için bilinir15,16. Tampon değişimi açısından, CFC teknolojisi sadece büyük ölçekli üretim17 uygulanmıştır ve otolog hücre tedavileri küçük ölçekli üretim için henüz kullanılmak üzere.
Küçük ölçekli hücre üretimi için uygun bir cihaz ihtiyacını gidermek için, otomatik bir CFC cihazı (Malzemeler Tablosubakınız), son zamanlardageliştirilmiştir 18. Otomatik hücre işleme cihazı hücre enkaz kaldırmak ve tampon değişimi kolaylaştırmak için karşı akış santrifüj teknolojisini kullanır. Cihaz, hücrelerin steril, kapalı bir sistem içinde işlenmesini sağlayan hücre aktarım torbasına steril bağlanabilen tek kullanımlık bir kit ile tampon değişimi gerçekleştirir. Burada, otomatik protokollerde memeli hücre kültürlerinde tampon değişimi gerçekleştirmek için bir karşı akım santrifüj cihazının kullanımını araştırıyoruz. Bu çalışmada, nonadherent ve yapışık hücre tiplerini modellemek için Jurkat hücreleri ve mezenkimal stromal hücreleri (MSCs) kullanarak tampon değişim protokolünü test ettik. Jurkat hücreleri genellikle akut T hücreli lösemi19,20çalışma için kullanılan T hücreleri ölümsüzleştirilmiş vardır. MSC’ler, çok çeşitli hastalıklar için insan klinik çalışmalarında çalışılan yetişkin kök hücrelerdir9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan otomatik arabellek değiştirme protokolü basit ve kullanıcı dostudur. Yine de, bu protokolde kritik ve özellikle dikkat gerektiren birkaç önemli adım vardır. Deneyimlerimize göre, MSC’ler (ortalama çap 10-15 μm) gibi daha büyük hücreleri işlerken her çalışmada en az 1 x 107 hücre içermelidir(Şekil 4B). Jurkat hücreleri (ortalama ~10 μm çap) gibi daha küçük hücrelerin işlenmesi, kararlı bir akışkan hücre yatağı elde e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Viktorya Hükümeti’nin Operasyonel Altyapı Destek Programı ve Ekonomik Kalkınma, İşler, Ulaştırma ve Kaynaklar Bakanlığı tarafından sağlanan Viktorya Hükümeti Teknoloji Fişi tarafından desteklenir. RL Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Kariyer Geliştirme Bursu alıcıdır. AL, Avustralya Lisansüstü Ödülü’nü kazanmıştır.
Materials
| 20 ml Luer lock syringes | BD | 302830 |
| 20% Human serum albumin (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma-Aldrich | 156477-25g |
| 500ml IV saline bag | Fresenius Kabi | K690521 |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240112 |
| Automated cell counter (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A |
| Cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 |
| Cell stimulation cocktail (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 |
| Cell transfer bags | Terumo | T1BBT060CBB |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| DMEM: F12 media | Thermo Fisher Scientific | 11320082 |
| EnVision plate Reader | Perkin Elmer | N/A |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 |
| Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C |
| Luer (female) fittings | CPC | LF41 |
| PC laptop or PC tablet device | ASUS | N/A |
| Plate reader (SpectraMax i3) | Molecular Device | N/A |
| Recombinant Human IFN-γ | PeproTech | 300-02 |
| Rotea counterflow centrifuge cell processing device | Scinogy | N/A |
| Rotea single-use processing kit | Scinogy | N/A |
| RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 |
| Surgical scissors | ProSciTech | 420SS |
| Trichloroacetic acide | Sigma-Aldrich | T6399-250g |
| Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 |
| Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
References
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1. BioProcess International. 16 (3), (2018).
- Hampson, B., Ceccarelli, J. Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here?. BioProcess International. 14 (4), (2016).
- Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. Mapping success for commercial cell therapy manufacturing. BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).
- Heathman, T. R., et al. The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges. Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).
- Lipsitz, Y. Y., et al. A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products. Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2. BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).
- Hanley, P. J., et al. Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System. Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).
- Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like?. Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).
- Galipeau, J., Sensebe, L. Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities. Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).
- Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy – Moving Target for Industry?. Pharmaceutical Research. 35 (8), 152 (2018).
- James, D. How short-term gain can lead to long-term pain. Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).
- Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies. Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).
- Rafiq, Q. A. Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture. Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).
- Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE). Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).
- Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra™) for clinical-scale generation of dendritic cells. Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).
- Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study. Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).
- Whitford, W. G., Subramanian, G. . Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing. , (2014).
- . SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH & CONCENTRATION Available from: https://www.scinogy.com/projects (2019)
- Yu, D., et al. Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule. Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).
- Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways. Journal of Cancer. 8 (19), 4124 (2017).
- Ling, W., et al. Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment. Cancer Research. 74 (5), 1576-1587 (2014).
- Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Zhu, F., et al. Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products. Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).
- Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch. Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).
- Stroncek, D. F., et al. Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies. Journal of Translational Medicine. 12, 241 (2014).
- Mfarrej, B., et al. Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts. Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).
- Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation. Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn’s disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).
- Lim, R., et al. First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study. Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).
