Summary
الاتمته هي المفتاح للارتقاء وأداره التكاليف في تصنيع الخلايا. تصف هذه المخطوطة استخدام جهاز معالجه الخلايا الطرد المركزي المضاد للتدفق لاتمته خطوات التبادل المؤقت وتركيز الخلية للمعالجة الحيوية الصغيرة النطاق.
Abstract
ويتطلب التسويق الناجح للعلاجات الجينية والقائمة علي الخلايا عمليات تصنيع فعاله من حيث التكلفة وقابله للتطوير. تبادل المخزن المؤقت وتركيز المنتج هي مكونات أساسيه لمعظم عمليات التصنيع. ومع ذلك ، في المراحل المبكرة من تطوير المنتج ، غالبا ما يتم تنفيذ هذه الخطوات يدويا. الطرد اليدوية الميتة لتبادل العازلة كثيفه العمالة ومكلفه وغير قابله للتطوير. ويمكن للنظام المؤتمت المغلق ان يزيل هذه الخطوة المضنية بشكل فعال ، ولكن التنفيذ يمكن ان يكون صعبا. هنا ، ونحن وصف جهاز معالجه الخلايا المطورة حديثا التي هي مناسبه لتجهيز الخلايا الصغيرة والمتوسطة الحجم ، ويهدف إلى سد الفجوة بين المعالجة اليدوية والاتمته علي نطاق واسع. يمكن تطبيق هذا البروتوكول بسهوله علي أنواع الخلايا المختلفة والعمليات عن طريق تعديل معدل التدفق وسرعه الطرد. وقد اظهر بروتوكولنا انتعاش الخلايا العالية مع فترات معالجه أقصر بالمقارنة مع العملية اليدوية. كما حافظت الخلايا المستعادة من العملية المؤتمتة علي معدلات انتشارها. يمكن تطبيق الجهاز كمكون وحدات في عمليه تصنيع مغلقه لاستيعاب الخطوات مثل تبادل المخزن المؤقت ، وصياغة الخلية ، والحفظ بالتبريد.
Introduction
وقد تحولت المناظر الطبيعية للطب الحديث بسرعة من خلال التطورات الاخيره في الجينات والعلاجات القائمة علي الخلايا (GCT). باعتبارها واحده من أسرع المجالات نموا في البحوث الانتقالية ، وقطاع GCT يواجه أيضا تحديات فريدة من نوعها وغير مسبوقة. الاضافه إلى النتائج السريرية القوية ، فان عمليات التصنيع الكفؤه والفعالة من حيث التكلفة ضرورية للنجاح التجاري لهذه العملية ، وهو أمر يصعب تحقيقه بشكل خاص في الصناعات التحويلية الصغيرة الحجم1. يتم تضخيم تكلفه الوقت والعمل وضمانات الجودة عندما تنتج كل دفعه من الخلايا فقط جرعات قليله لمريض واحد بدلا من مئات أو آلاف. علي عكس العلاجات الخلوية الخيفيه التي تكون فيها عمليات التصنيع أقرب إلى إنتاج الأجسام المضادة والبروتينات المؤتلفة ، يتم عاده إنتاج العلاجات الذاتية للخلايا كعمليات صغيره الحجم1. كظاهره جديده نسبيا في تصنيع ادويه2، خيارات لمعالجه الخلايا الصغيرة الحجم حاليا محدوده جدا.
تبادل المخزن المؤقت ضروري لتصنيع الخلايا. وهي واحده من العمليات المصب حيث يتم أزاله الخلايا من وسائل الاعلام الثقافية وتتركز للحجز بالتبريد أو التسريب. وفي الوقت الراهن ، غالبا ما يطبق تصنيع الخلايا الصغيرة عمليات مماثله لتلك الموجودة في اعداد البحوث الاكاديميه ويعتمد علي غرف نظيفه متخصصة للمحافظة علي العقم3. العمليات اليدوية المصب غالبا ما تستخدم أجهزه الطرد المركزي العلوية لبيليه وأعاده تعليق الخلايا للحد من حجم وتبادل العازلة. هذه العمليات المفتوحة مكلفه (اي العمل وصيانة الغرف النظيفة) ولها قدره تصنيع محدوده ، والتي ليست مثاليه للإنتاج التجاري2،3.
وقد اقترح تنفيذ الاتمته كحل لتحسين كفاءه التصنيع وتحقيق الإنتاج علي نطاق تجاري2. لا يمكن تحقيق العقم في المنتجات القائمة علي الخلايا من خلال الأساليب التقليدية المستخدمة في البيولوجية ، مثل إشعاع جاما أو الترشيح نهاية المحطة الطرفية. وبدلا من ذلك ، يتم نشر نظام أوتوماتيكي مغلق للحد من مخاطر التلوث والمشغلين الذين يعتمدون علي غرف نظيفه للحفاظ علي العقم4. كما تعالج أتمته العمليات مساله قابليه التحجيم اما بوجود أنظمه متعددة تعمل بالتوازي (التحجيم) أو بزيادة قدره المعالجة لجهاز فردي (توسيع النطاق) ، مما يقلل بدوره من التباين بين المشغلين. وعلاوة علي ذلك ، فان تحليل نمذجة التكلفة للعلاجات الذاتية يوحي بان الاتمته قد تقلل من تكلفه التصنيع5،6. ومع ذلك ، لم يتم العثور علي فائده التكلفة في التجربة السريرية للخلايا الجذعية الذاتية حيث تم استخدام منصة التصنيع الألى7، مما يوحي بان فائده التكلفة من الاتمته قد تعتمد علي عمليه التصنيع الفردية.
هناك استراتيجيات مختلفه في الاتمته التي يمكن إدخالها في عمليه التصنيع القائمة. ويمكن تحقيق ذلك اما عن طريق تنفيذ منصة متكاملة تماما أو سلسله تجهيز تستند إلى وحدات. هناك عده منصات متكاملة بالبالكامل متاحه تجاريا لتصنيع الخلايا الذاتية ، مثل كليمياكس المعجزة (Miltenyi بيوتيك) ، شرنقة (اوكتان التكنولوجيا الحيوية) ، والكم (Terumo BCT). هذه المنصات المتكاملة ، والتي غالبا ما توصف بأنها "GMP في مربع" ، لديها طلبات منخفضه علي البنية التحتية وسهله التشغيل. ومع ذلك ، فان القدرة التصنيعية لاعداد متكامل تماما قد تكون مقيده من قبل الحاضنة الملحقة بالنظام. علي سبيل المثال ، ويقتصر القدرة علي الخياطة معجزه لها 400 مل غرفه8 وخرطوشه الكم لديها مساحة الحد السطحية تعيين إلى 2.1 m2 (ما يعادل 120 T175 قوارير)7، والتي قد لا تكون كافيه للمرضي الذين يحتاجون إلى جرعات اعلي الخلية9،10. بالاضافه إلى ذلك ، معجزه والكم لديها سمه مشتركه التي تحد من استخدامها: الوحدة التشغيلية مشغولة بدفعه واحده من الخلايا طوال فتره توسيع الخلية ، التالي الحد من عدد الدفعات التي يمكن تصنيعها من قبل كل وحده11. نهج وحدات لاتمته هو إنشاء سلسله التصنيع مع وحدات متعددة وحدات التي تحاكي عمليه التصنيع التجاري12,13. هذا النهج ، الذي يفصل جهاز الثقافة من جهاز غسل الخلية ، التالي يمكن تعظيم كفاءه التصنيع. سيكون جهاز تجهيز مثاليه واحده التي هي قابله للتكيف وقابله للتطوير لاحتياجات التصنيع12.
وكان لتكنولوجيا طرد المضادة للتدفق (CFC) ، التي تعود إلى السبعينات ، تاريخ طويل في معالجه الخلايا14. فانه يحقق تركيز الخلية والانفصال عن طريق موازنة قوه الطرد المركزي مع قوه مضاده للتدفق. عاده ، يدخل تعليق الخلية من النهاية الضيقة للغرفة الخلية تحت معدل تدفق ثابت اثناء الخضوع لقوه الطرد المركزي (الشكل 1ا). ويمارس تدفق السائل في الاتجاه المعاكس لقوه الطرد المركزي. ويشار إلى ذلك بالقوة المضادة للتدفق ، التي تشكل تدرجا داخل الغرفة الخلوية. ثم تنخفض قوه التدفق المضاد حيث تتوسع الغرفة الخلوية بعيدا عن طرف غرفه الخلية المخروطية الشكل. الخلايا ذات الكثافة العالية والقطر الأكبر لديها معدل ترسيب اعلي ، التالي فانها تصل إلى قوه التوازن نحو غيض من المخروط علي شكل غرفه الخلية. الجزيئات الصغيرة قد تصل إلى التوازن نحو قاعده الغرفة أو تكون صغيره جدا للاحتفاظ بها في الغرفة سيتم غسلها بعيدا. ومن المعروف في الغالب تكنولوجيا CFC لتطبيقه في معالجه المنتجات الفصاده الدم ، مثل عزل الخلايا الاحاديه لعلاجات الخلايا الجذعية15،16. وفيما يتعلق بالتبادل الاحتياطي ، فان تكنولوجيا مركبات الكربون الكلوريه فلورية لم تطبق الا في الصناعات التحويلية الكبيرة الحجم17 ولم تستخدم بعد في تصنيع العلاجات الخلوية الذاتية علي نطاق أصغر.
ولمعالجه الحاجة إلى جهاز مناسب لتصنيع الخلايا الصغيرة الحجم ، تم مؤخرا تطوير جهاز مركبات الكربون الكلوريه فلورية الألى (انظر جدول المواد) ،18. يستخدم الجهاز الألى لمعالجه الخلايا تقنيه طرد التدفق المضاد لأزاله الحطام الخلوي وتسهيل تبادل المخزن المؤقت. يقوم الجهاز باجراء تبادل المخزن المؤقت مع مجموعه الاستخدام المفرد التي يمكن ان تكون معقمه-متصلة بحقيبة نقل الخلايا ، والتي تسمح بمعالجه الخلايا داخل نظام معقم ومغلق. هنا ، نقوم بالتحقيق في استخدام جهاز طرد مركزي مضاد للتدفق لاجراء تبادل المخزن المؤقت في ثقافات خلايا الثدييات في البروتوكولات المؤتمتة. في هذه الدراسة ، اختبرنا بروتوكول تبادل العازلة باستخدام خلايا Jurkat والخلايا الجذعية اللحمية (MSCs) لنموذج أنواع الخلايا غير الملتصقة والملتصقة ، علي التوالي. خلايا jurkat هي خلايا الخلد التي غالبا ما تستخدم لدراسة ابيضاض الدم الحاد الخلايا التائية19,20. MSCs هي الخلايا الجذعية الكبار التي تم دراستها في التجارب السريرية البشرية لمجموعه واسعه من الامراض9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. اعداد الكواشف والخلايا لتبادل العازلة
- اعداد المخازن المؤقتة (انظر جدول المواد) في فئة 2 غطاء التدفق الصفحي. باستخدام حقنه والجمعية ابره ، أزاله 50 مل من محلول ملحي من كيس ملحي 500 mL. استبدال هذا مع 50 mL من الزلال المصل البشري 20 ٪ (HSA) لجعل 2 ٪ HSA في المحلول الملحي ، والتي ستكون بمثابه العازلة الغسيل.
- أزاله الخلايا من الاوعيه الثقافية واجراء عدد الخلايا لتحديد كميه الخلية البداية والقدرة علي البقاء من خلال الاستبعاد الأزرق التريان. تحميل الخلايا في حقيبة نقل.
ملاحظه: في هذا البروتوكول تم استزراع خلايا Jurkat في RPMI و MSCs تم استزراعها في DMEM: F12. واستكملت كل من وسائل الاعلام مع 10 ٪ مصل الأبقار الجنينية (الدم) و 1 ٪ محلول مضاد للمضادات الحيوية. تم استزراع الخلايا عند 37 درجه مئوية مع 5% CO2. بالنسبة للخلايا الملتصقة أو المنضمة ، أضف انزيم هضم (مثل التريبسين) إلى الاوعيه الثقافية من أجل فصل الخلايا ، وإرواء الوسائط الثقافية بمجرد فصل الخلايا. واستخدمت حقيبة نقل في هذا البروتوكول لأنه تم توسيع الخلايا في السفن الثقافية. ومع ذلك ، إذا تم استزراع الخلايا في كيس ثقافة الخلية ، فانه يمكن ان تكون متصلة مباشره إلى عده استخدام واحد عن طريق لحام أنبوب معقم. في هذا البروتوكول ، اما 3 × 107 jurkat الخلايا أو 1 × 107 mscs تم استخدامها لكل تشغيل ، حيث تم تعليق الخلايا في 40 mL من وسائل الاعلام الثقافة.- تحميل الخلايا في حقيبة نقل (انظر جدول المواد) باستخدام حقنه والجمعية ابره إذا كان لحام أنبوب معقمه متاحه لتوصيل حقيبة نقل إلى عده معالجه استخدام واحد.
- بدلا من ذلك ، استخدم زوج من مقص معقم لقطع أنبوب ربط مع حوالي 10 سم ريماينينينج تعلق علي حقيبة نقل وأضافه موصل Luer الإناث إلى نهاية الأنابيب. استخدم حقنه لشفط الخلايا والوسائط ، ثم قم بتوصيل الحقنه بموصل Luer وقم بتحميل الخلايا إلى حقيبة النقل.
- توصيل الحقيبة التي تحتوي علي الخلايا ، وغسل كيس العازلة التي تحتوي علي 500 mL من المخزن المؤقت غسل أعدت في الخطوة 1.1 ، كيس النفايات ، وجمع حقنه لمجموعه استخدام واحد (الشكل 1ب).
ملاحظه: يعتمد الموضع المتصل لكل حقيبة علي الإعدادات في البرنامج. في هذا البروتوكول ، قمنا بتوصيل كيس النفايات في الموقع A ، وغسل العازلة في موقف B ، كيس الخلية في المواقع D و F ، ومجموعه حقنه في الموقف H (الشكل 1ج).
2-برنامج البروتوكول الألى للتبادل المؤقت
- فتح واجهه المستخدم الرسوميه (GUI) من الجهاز واضغط علي زر "نجمهT" علي جهاز كمبيوتر محمول أو قرص. ثم "فتح" بروتوكول موجود أو اضغط "جديد" لإنشاء واحده جديده.
- استخدم زر "الامام" و "الخلف" للتنقل من خلال كل خطوه ، وحدد الصمامات التي سيتم فتحها/إغلاقها ، وسرعه الطرد المركزي ، وسرعه الضخ ، واتجاه المضخة ، ومشغلات العمل. يتم تلخيص إعدادات كل خطوه في الجدول 1. ثم احفظ البروتوكول.
3. اعداد الجهاز
- ضع عده المعالجة ذات الاستخدام المفرد علي الجهاز وشنق الحقائب المتصلة وفقا لذلك. اضغط علي الزر الأحمر "إيقاف/أعاده تعيين" لأعاده ضبط جميع الصمامات في الوضع الافتراضي المغلق.
ملاحظه: سيقوم الجهاز باجراء اختبار عند إغلاق الباب للتاكد من انه قد تم وضع الطقم بشكل صحيح وان جميع الصمامات تعمل علي نحو مناسب. - قم بتوصيل واجهه المستخدم الرسوميه بجهاز المعالجة واضغط علي زر "اتصال". ثم قم بتنزيل البرنامج المحفوظ. عندما يضيء زر "Play" الأخضر ، فانه يشير إلى ان البروتوكول جاهز للبدء.
- فتح المشابك اليدوية لنقل الأنابيب حقيبة.
ملاحظه: إذا نسي المشغل فتح المشابك ، سيتوقف الجهاز سيظهر تحذير مستشعر الضغط. اضغط علي زر "إيقاف" لأعاده تعيين الجهاز وفتح المشابك للبدء مره أخرى.
4-التبادل الألى للمخزن المؤقت
- اضغط علي "أبدا" لبدءتشغيلبرنامج تبادل المخزن المؤقت.
ملاحظه: لتغيير العملية التلقائية يدويا ، اضغط علي الزر "التالي" للانتقال إلى الخطوة التالية قبل الوصول إلى "المشغل" أو اضغط علي "إيقاف مؤقت" لوضع العملية قيد الانتظار. وهذا سوف يعيد توزيع الخلايا من خلال مجموعه مع الحفاظ علي الصمامات فقط J و K مفتوحة (الشكل 1ج). - في نهاية الاتمته الخطوة 6 (الجدول 1) ، سوف تتوقف العملية عندما الهواء في كيس أفرغت الآن مشغلات الاستشعار فقاعه. اضغط علي "التالي" لنقل العملية إلى الخطوة التالية إذا كانت الحقيبة فارغه بالفعل ، أو اضغط علي "إيقاف مؤقت" لاستئناف المعالجة إذا كان جهاز الاستشعار قد تم تشغيله بواسطة فقاعه في السطر.
5. جمع وأخذ العينات الخلايا
- عند الانتهاء من العملية المؤتمتة ، اغلق جميع المشابك الأنابيب. افتح الباب وخذ الطقم الأحادي الاستخدام من الجهاز. افصل الحقنه لجمع الخلايا للعمليات اللاحقة. أخذ عينه من الخلايا التي تم جمعها لعدد الخلايا والتحقق من الصلاحية (انظر الخطوة 6.2).
6. التحقق من صحة العملية
- اجراء تجارب التحكم باستخدام بروتوكول تبادل المخزن المؤقت اليدوي.
- تعليق خليه الطرد المركزي في 200 x g لمده 5 دقيقه. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق الخلايا مع 30 مل من المخزن المؤقت لغسل الخلية. الطرد المركزي تعليق الخلية مره أخرى في 200 x g لمده 5 دقيقه. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق الخلايا مع 10 مل من المخزن المؤقت غسل الخلية.
- قم باجراء عمليه عد الخلايا عبر اختبار الاستبعاد الأزرق من التريان لتقييم مدي صلاحيه الخلية باستخدام عداد الخلايا المؤتمت.
- اجراء فحص MTS لقياس انتشار الخلايا في 2 و 24 و 48 h.
ملاحظه: تم اجراء الفحص MTS علي لوحه ثقافة الانسجه بشكل جيد 96 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. وقد تم طلاء ال100 μL الذي يحتوي علي وسائط الاستزراع الخلوي (التي تحتوي علي 10,000 خلايا Jurkat أو 1,500) لكل بئر بعد عمليه تبادل المخزن المؤقت. في كل نقطه زمنيه ، تمت أضافه 20 μL من الكواشف MTS إلى كل بئر وحضنت ل 2 ح في 37 درجه مئوية. تم تقييم الامتصاص عند 490 نانومتر باستخدام قارئ لوحه. - اجراء اختبارات وظيفية لمقارنه تاثير العملية المؤتمتة مقابل العملية اليدوية علي خلايا Jurkat ووظيفة MSC.
- الخلايا الثقافية Jurkat في لوحه 96 البئر في كثافة من 1 × 106 خلايا/مل حفزت مع 50 Ng/ml phorbol 12-myristate 13-خلات (نقدا) و 1 ميكروغرام/مل ionomycin (الخلية كوكتيل التحفيز) في dmem: وسائل الاعلام F12 التي تحتوي علي 10 ٪ الجنين البقري المصل (المعرض) لمده 24 ساعة. احتضان الخلايا في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2.
- قياس الإنتاج interleukin-2 من الثقافة ماده طافي باستخدام حبه القائم علي فحص اليسا (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- الثقافة mscs في 12 لوحه بئر في كثافة الخلايا 10,000/سم2 في 1 مل من dmem: F12 وسائل الاعلام التي تحتوي علي 10% التي تم استكمالها مع مضادات الγ 50 وحدات/mL ل 48 h. جمع ماده طافي لفحص تركيز kynurenine لقياس indoleamine 2, 3-ديوكسيجيناسي (IDO) نشاط انزيم mscs كماهو موضح سابق
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا البروتوكول ، استخدمنا خلايا Jurkat و MSCs كامثله تمثيليه لإظهار عمليه تبادل المخزن المؤقت المؤتمت. اثناء العملية ، الخلايا Jurkat و MSCs مشتركه نفس الخطوات المعالجة مع الاختلافات في قوه الطرد المركزي وسرعه المضخة التي تتحكم في معدل التدفق (الجدول 1). ويبين الشكل 2 الصور التمثيلية الملتقطة بواسطة الكاميرا للكيفية التي قد يظهر بها سرير الخلية المميعة اثناء عمليه تبادل المخزن المؤقت. عاده ، فان سرير الخلية المميعة تشبه الصورة في الشكل 2ا، حيث تتراكم الخلايا في الوسط ونحو الجبهة من المخروط مع مساحة صغيره في غيض من الغرفة ، حيث الخلايا لا تتراكم وفتح مدخل تحميل الخلية مرئية. قد يتم ضغط السرير الخلوي المميع (الشكل 2ب) عند إدخال المخزن المؤقت الجديد الذي يكون في لزوجه أو كثافة مختلفه. في هذا البروتوكول ، تم تخفيض سرعه المضخة من 30-35 مل/دقيقه إلى 20 مل/دقيقه في بداية خطوه الغسيل. مره واحده امتلات الغرفة مع العازلة الجديدة ، تم إرجاع سرعه المضخة إلى المعتاد لمنع الخلايا التكوير في غيض من الغرفة. ويمكن تطبيق معدل تدفق عال (الشكل 2ج) لتحديد الخلايا الحية لان الخلايا الميتة أصغر وأخف وزنا ويمكن إجبارها علي الخروج من الغرفة عن طريق زيادة معدل التدفق.
وقد تحققت العملية اليه للتبادل المؤقت بتركيز الخلايا أولا ، ثم إدخال المخزن المؤقت للغسيل ، الذي كان حوالي 10x من حجم سرير الخلية المميعة. ثم تمت صياغة الخلايا إلى الحجم المطلوب. وقد صممت هذه الخطوات الثلاث للمعالجة لتتبع نفس المبادئ التي يتبعها التبادل اليدوي للمخزن المؤقت. عاده ، يتم استخدام طرد بدورتين (200 x g، 5 min) لاجراء تبادل المخزن المؤقت اليدوي ، حيث يتم التركيز علي الخلايا للتركيز ، وأعاده التعليق للغسيل ، ثم طرد مره أخرى وأعاده التعليق إلى وحده التخزين النهائية. وكان الوقت اللازم لتجهيز العمليات المؤتمتة أقصر مقارنه بالفترات اليدوية (الشكل 3). وكان معدل الاسترداد بين العمليات اليدوية واليه متشابها بالنسبة لكل من خلايا Jurkat و MSCs ، ولم تتاثر صلاحيه الخلية بالعملية (الشكل 4). تم التحقق من جوده الخلية عن طريق انتشار الخلايا (مقايسة MTS) وإنتاج السايسيسين/الانزيم. وأظهرت الخلايا المستعادة معدلات انتشار مماثله بين الدليل والعمليات المؤتمتة (الشكل 5(ا)). وكان مستوي إنتاج انترليوكين-2 من خلايا المحلفين ونشاط ايدو من الفئات العمرية البارزة مماثلا أيضا بين المجموعتين (الشكل 5ب و 5ج).
| رقم الخطوة | وصف | فتح الصمامات | سرعه الطرد المركزي (ز) | سرعه المضخة (مل/دقيقه) | مشغلات | |
| 1 | رئيس أنابيب من B إلى A | الف ، باء ، كاف | 10 | 50 | حجم: 45 ml | |
| 2 | تعبئة فقاعه فخ من A إلى B | الف ، باء ، كاف | 100 | 50 (عكس) | الحجم: 10 مل | |
| 3 | رئيس الأنابيب من الف إلى دال | الف ، دال ، كاف | 100 | 50 (عكس) | الحجم: 2 مل | |
| 4 | رئيس أنابيب J إلى K | ياء ، كاف | 100 | 50 | الحجم: 3 مل | |
| 5 | تحميل الخلايا – البداية الاولي من D إلى G | دال ، كاف ، زاي | 1600 (jurkat) 1500 (MSCs) | 25 (jurkat) 30 (MSCs) | حجم: 100 ml | |
| 6 | تحميل الخلايا مع الكشف عن فقاعه [عند الكشف عن فقاعه/أنابيب فارغه ، فان البرنامج وقفه والانتظار للأمر المشغل ، اضغط علي ' وقفه ' أو ' المقبل '] | الف ، دال ، كاف | = الخطوة الاخيره | 30 (jurkat) 35 (MSCs) | فقاعه الاستشعار D | |
| 7 | إفراغ الوسائط المتبقية علي أنبوب المنفذ D | الف ، دال ، كاف | = الخطوة الاخيره | = الخطوة الاخيره | حجم: 1.5 ml | |
| 8 | غسل الخلايا 1 | الف ، باء ، كاف | = الخطوة الاخيره | 20 | الحجم: 20 مل | |
| 9 | تكثف سرعه الغسيل | الف ، باء ، كاف | = الخطوة الاخيره | 35 | المؤقت: 5 ثانيه سرعه الكبس | |
| 10 | غسل الخلايا 2 | الف ، باء ، كاف | = الخطوة الاخيره | = الخطوة الاخيره | الحجم: 20 مل | |
| 11 | استعد للحصاد | ياء ، كاف | = الخطوة الاخيره | = الخطوة الاخيره | المؤقت: 2 ثانيه | |
| 12 | استرداد الخلايا إلى الإخراج وتمييع لحجم الهدف | باء ، ياء ، كاف | = الخطوة الاخيره | 60 (عكس) | الحجم: 10 مل | |
| ملاحظه: ' = الخطوة الاخيره ' هو خيار الاعداد لسرعه يطرد وسرعه الضخ في واجهه المستخدم الرسوميه. | ||||||
الجدول 1: اعداد واجهه المستخدم الرسوميه لتبادل المخزن المؤقت المؤتمت لخلايا Jurkat و MSCs.
الشكل 1: نظام معالجه خلايا الطرد المركزي المضاد للتدفق. (ا) رسم تخطيطي يوضح مبدا الطرد المضادة للتدفق. قوه مضاده للتدفق موجودة في التدرج داخل غرفه الخلية. في حين ان اليطرد (السهم الرمادي) ، فان الخلايا ذات الأقطار الأكبر تتلقي قوه ترسيب اعلي ، حيث تصل الخلايا إلى التوازن القوي نحو النهاية الضيقة للغرفة ، وتشكل سريرا خلويا مميعا. يتم غسلها الحطام الخلية والجزيئات الصغيرة التي هي صغيره جدا للبقاء في الغرفة بعيدا. (ب) يتالف نظام معالجه الطرد المركزي المضاد للتدفق من جهاز المعالجة ومجموعه المعالجة الاحاديه الاستخدام. (ج) تكوين مجموعه الاداات أحاديه الاستخدام لبروتوكول التبادل المؤقت. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: سرير الخلية المميعة في غرفه الزنزانة. الصور التمثيلية لسرير الخلية المميعة تحت (ا) المتوسطة ، (ب) منخفضه ، و (ج) ارتفاع معدل التدفق. يشير الخط المنقط إلى منطقه سرير الخلية المميعة داخل الغرفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنه وقت معالجه الخلايا للخلايا الخاصة بالjurkat و MSCs مع المعالجة اليدوية والمؤتمتة. (ن = 3 – 4 في كل مجموعه ، يتم عرض البيانات كمتوسط ± SD). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مقارنه بين قابليه الخلية للبقاء واستعاده الخلايا الحية للخلايا الjurkat و MSCs مع المعالجة اليدوية والمؤتمتة. وتم قياس قابليه الخليةللبقاء (ا) واستعاده الخلايا الحية (ب) بواسطة فحص الاستبعاد الأزرق من التريان باستخدام عداد الخلايا الألى. تم تخفيض استعاده الخلايا الحية في غياب المصل أو عندما فقط 3 x 106 أو 1 x 106 الخلايا تمت معالجتها. (ن = 4 – 9 في كل مجموعه ، يتم عرض البيانات كمتوسط ± SD). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تكاثر الخلايا ووظيفة الخلية من المعالجة اليدوية واليه. (ا) تم اجراء فحص MTS للخلايا الjurkat و mscs في 2 و 24 و 48 ساعة بعد تبادل المخزن المؤقت. وقد تم تحديد نوعيه الخلايا المستردة بواسطة إنتاج انترليوكين-2 من خلايا Jurkat (B) ، ونشاط الايدو في mscs (C). (ن = 4 – 8 في كل مجموعه ، يتم عرض البيانات كمتوسط ± SD). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: استقرار سرير الخلية المميع بمعدل تدفق مختلف. تم تنفيذ عمليتين لكل نوع خليه. في عمليه واحده ، اما 3 × 107 خلايا jurkat أو 1 × 107 mscs. في العملية الثانية ، تم استخدام 10 x عدد الخلايا. في كلا العمليتين ، تم جمع 10 مل من الخلية الelutriate من الميناء A في معدلات تدفق مختلفه باستخدام سرعه يطرد المشار اليها في هذا البروتوكول (1,600 x g للخلايا jurkat و 1,500 x g ل mscs). تم تحديد عدد الخلايا في الخلية وعرضها كنسبه مئوية من الكمية الاجماليه للخلايا التي تم تحميلها في الغرفة. (ن = 3 لكل مجموعه ، يتم عرض البيانات كمتوسط ± SD). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول تبادل المخزن المؤقت التلقائي الموصوف بسيط وسهل الاستخدام. ومع ذلك ، هناك بضع خطوات رئيسيه في هذا البروتوكول ذات اهميه حاسمه وتتطلب اهتماما خاصا. في تجربتنا ، عند معالجه الخلايا الكبيرة مثل MSCs (متوسط قطر 10-15 μm) يجب ان تشمل كل تشغيل ما لا يقل عن 1 × 107 خلايا لتحقيق الشفاء الأمثل للخلايا (الشكل 4ب). معالجه الخلايا الصغيرة ، مثل خلايا Jurkat (متوسط ~ 10 μm قطر) ، يتطلب حوالي 3 × 107 خلايا لتحقيق مستقره سرير الخلية المميعة (الشكل 4ب). عندما يكون رقم الخلية منخفضا جدا ، تكون الخلايا أكثر عرضه لأزالها من السرير المميع ، والذي سيؤثر علي الاسترداد النهائي للخلايا. بالاضافه إلى ذلك ، قارننا معدلات فقدان الخلايا بسرعات ضخ مختلفه عند تطبيق سرعه الطرد المركزي الثابتة. وهنا ، لاحظنا ان فقدان الخلايا زاد مع معدل التدفق (الشكل 6) ، الذي يرجع إلى تزايد عدم الاستقرار في السرير المميع بمعدلات تدفق اعلي. ومع ذلك ، كانت النسبة المئوية لفقدان الخلايا اقل عندما تم تحميل 10 x عدد الخلايا في الغرفة ، مما يوحي بأنه يمكن تطبيق سرعه مضخة اعلي عند معالجه عدد أكبر من الخلايا للسماح بمعالجه أسرع. وفي الخطوة 5 من العملية ، أعيد تعميم 100 مل من وسائط الاعلام الثقافية من الغرفة مره أخرى إلى حقيبة نقل الخلايا للسماح للسرير المميع بالتشكيل والاستقرار قبل الحد من الحجم والتبادل المؤقت. إذا كان تركيز الخلية منخفضا (علي سبيل المثال ، اقل من 0.2 × 106/مل) ، قد تحتاج خطوه أعاده التدوير إلى توسيع للسماح بما يكفي من الخلايا لتشكيل سرير الخلية المميعة. المثل ، إذا كان تركيز الخلية مرتفعا ، يمكن تقصير خطوه أعاده التدوير.
وجود المصل في المخزن المؤقت يغسل هو أيضا حاسمه لاستعاده الخلايا. وقد أظهرت الدراسات السابقة ان الإجهاد الهيدروديناميكي يمكن ان يسبب موت الخلايا الميتة في غياب البروتينات التخزين المؤقت22,23. ديناميكية تدفق نظام الطرد المركزي المضادة للتدفق معقده جدا. في هذا البروتوكول ، انخفضت معدلات استرداد الخلايا إلى حوالي 70 ٪ عند اجراء العملية في غياب المصل (الشكل 4ب). علي الرغم من ان اليه الدقيقة ليست واضحة ، وكان وجود مصل في وسائل الاعلام الثقافية أو الزلال في غسل المخازن المؤقتة قادره علي التخفيف من الاضرار الميكانيكية المحتملة للخلايا. للتطبيقات التي تتطلب المخازن المؤقتة الخالية من مصل الدم ، والنشا هيدروكسي ايثيل وال40 ديديكسان هي أمثله من المضافات غير البروتينية التي غالبا ما تستخدم في تصنيع الخلايا لحماية ضد الإجهاد هيدروديناميكي24،25.
وقد استخدمت تقنيه طرد التدفق المضاد في تصنيع الادويه علي نطاق واسع ومعالجه المنتجات الدموية17. وغالبا ما تقتصر تطبيقات تكنولوجيا مركبات الكربون الكلوريه فلورية في تصنيع الخلايا الصغيرة الحجم (اي 0.1 إلى 10 لتر) علي عزل الخلايا الاحاديه النواة من منتجات المواد الدموية ، مثل الوترا (Terumo BCT)26، الذي يتطلب تدخلا يدويا إضافيا لتنفيذ خطوات الغسل والتركيز. وتشمل المنصات الأخرى لمعالجه الخلايا الصغيرة الحجم أنظمه التبادل العازلة المستندة إلى الترشيح الغشائي مثل LOVO (Fresenius Kabi)27 وفصل طرد العمودي مثل SEPAX (GE Healthcare)28. علي الرغم من انه من الصعب اجراء مقارنه مباشره بين الاجهزه ، واحده من مزايا هذا الجهاز الطرد المركزي المضاد للتدفق هو قدرته علي تقديم كميات صغيره جدا من الإنتاج (الحد الأدنى 5 مل) ، وهو أصغر من بين منصات معالجه الخلايا المتاحة حاليا. حجم الإنتاج الصغيرة مناسبه للتطبيقات مثل صياغة الخلايا للحقن المحلية29 أو ضخ للمواليد الولدان30. الكاميرا المضمنة في الجهاز هي أيضا ميزه فريدة من نوعها التي توفر التصور للسرير الخلية المميعة اثناء مرحله تطوير العملية.
واحده من القيود المفروضة علي تكنولوجيا مركبات الكربون الكلوريه فلورية هو انها حساسة لحجم وكثافة الخلايا. عند اعداد بروتوكول تبادل المخزن المؤقت لنوع خليه مختلفه ، يجب ان يكون البروتوكول المعروض هنا بمثابه مبدا توجيهي للمستخدمين لتحسين وفقا لاحتياجاتهم ، مع الأخذ في الاعتبار حجم خلاياهم من الفائدة وكثافة تعليق الخلية الخاصة بهم. وعلي الرغم من ان البروتوكول الحالي قابل للاستخدام لتجهيز ما يصل إلى 5 لتر من وسائل الاعلام ، فان الوقت اللازم للتجهيز سيتم توسيعه بشكل كبير (اي 1 – 2 ساعة). ومن المهم الاشاره إلى انه لم يتم في هذه الدراسة الحالية دراسة تاثير فتره التجهيز الممتدة علي نوعيه الخلايا.
ستقوم الدراسات المستقبلية بتقييم تاثير سرعه المعالجة ووقت المعالجة علي وظيفة الخلية لتحديد الحد الأقصى لقدره الجهاز علي المعالجة. وعلاوة علي ذلك ، قد تستكشف الدراسات المستقبلية تطبيقات أخرى مثل أزاله السولفوكس ثنائي الميثيل (DMSO) من المنتجات التي يتم الاحتفاظ بها بالتبريد والازاله الانتقائية للخلايا الميتة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
SW ، IF ، و DJ هي COO ، والمدير التنفيذي لشركه سسينوجي Pty المحدودة. وقدمت سسينوجي أيضا الوصول إلى جهاز CFC.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل برنامج دعم الهياكل الاساسيه التشغيلية لحكومة فيكتوريا ، وقسيمة التكنولوجيا الحكومية الفيكتورية التي تقدمها أداره التنمية الاقتصادية والوظائف والنقل والموارد. RL هو المتلقي لزمالة التطوير الوظيفي لمجلس الصحة والبحوث الطبية الوطنية. ال هو المتلقي لجائزه الدراسات العليا الاستراليه.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 ml Luer lock syringes | BD | 302830 | |
| 20% Human serum albumin (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma-Aldrich | 156477-25g | |
| 500ml IV saline bag | Fresenius Kabi | K690521 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240112 | |
| Automated cell counter (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Cell stimulation cocktail (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 | |
| Cell transfer bags | Terumo | T1BBT060CBB | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| DMEM: F12 media | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | |
| EnVision plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C | |
| Luer (female) fittings | CPC | LF41 | |
| PC laptop or PC tablet device | ASUS | N/A | |
| Plate reader (SpectraMax i3) | Molecular Device | N/A | |
| Recombinant Human IFN-γ | PeproTech | 300-02 | |
| Rotea counterflow centrifuge cell processing device | Scinogy | N/A | |
| Rotea single-use processing kit | Scinogy | N/A | |
| RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Surgical scissors | ProSciTech | 420SS | |
| Trichloroacetic acide | Sigma-Aldrich | T6399-250g | |
| Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
References
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1. BioProcess International. 16 (3), (2018).
- Hampson, B., Ceccarelli, J. Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here? BioProcess International. 14 (4), (2016).
- Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. Mapping success for commercial cell therapy manufacturing. BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).
- Heathman, T. R., et al. The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges. Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).
- Lipsitz, Y. Y., et al. A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products. Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2. BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).
- Hanley, P. J., et al. Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System. Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).
- Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like? Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).
- Galipeau, J., Sensebe, L. Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities. Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).
- Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry? Pharmaceutical Research. 35 (8), 152 (2018).
- James, D. How short-term gain can lead to long-term pain. Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).
- Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies. Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).
- Rafiq, Q. A. Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture. Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).
- Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE). Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).
- Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra™) for clinical-scale generation of dendritic cells. Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).
- Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study. Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).
- Whitford, W. G. Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing. Subramanian, G. , (2014).
- Scinogy. SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH & CONCENTRATION. , https://www.scinogy.com/projects (2019).
- Yu, D., et al. Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule. Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).
- Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways. Journal of Cancer. 8 (19), 4124 (2017).
- Ling, W., et al. Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment. Cancer Research. 74 (5), 1576-1587 (2014).
- Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Zhu, F., et al. Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products. Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).
- Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch. Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).
- Stroncek, D. F., et al. Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies. Journal of Translational Medicine. 12, 241 (2014).
- Mfarrej, B., et al. Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts. Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).
- Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation. Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).
- Lim, R., et al. First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study. Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).
