Automatiseret Counterflow centrifugal system til småskala cellebehandling

Summary

Automatisering er nøglen til opskalering og omkostningsstyring i celle fremstilling. Dette manuskript beskriver brugen af en modstrøms centrifugal cellebehandling enhed til automatisering af buffer udveksling og celle koncentration trin for lille-skala bioprocessing.

Abstract

Vellykket kommercialisering af gener og cellebaserede terapier kræver fremstillingsprocesser, der er omkostningseffektive og skalerbare. Buffer udveksling og produkt koncentration er væsentlige komponenter i de fleste produktionsprocesser. Men i de tidlige stadier af produktudvikling udføres disse trin ofte manuelt. Manuelle dødende centrifugering til buffer udveksling er arbejdskraftintensiv, bekostelig og ikke skalerbar. Et lukket automatiseret system kan effektivt eliminere dette omstændelig skridt, men gennemførelsen kan være udfordrende. Her beskriver vi en nyudviklet celle behandlingsenhed, der er velegnet til små-til mellemstore celle bearbejdning og har til formål at bygge bro mellem manuel behandling og storstilet automatisering. Denne protokol kan let anvendes til forskellige celletyper og processer ved at ændre strømningshastigheden og centrifugeringshastigheden. Vores protokol viste høj celle opsving med kortere behandlingstider i forhold til den manuelle proces. Celler genvundet fra den automatiserede proces også fastholdt deres spredning satser. Enheden kan anvendes som en modulær komponent i en lukket fremstillingsproces for at imødekomme trin som buffer udveksling, celle formulering og cryopreservation.

Introduction

Landskabet med moderne medicin har ændret sig hurtigt gennem den seneste udvikling i gen-og cellebaserede terapier (GCT). Som et af de hurtigst voksende områder inden for Translationel forskning står GCT-sektoren også over for unikke og hidtil usete udfordringer. Ud over solide kliniske resultater er effektive og omkostningseffektive fremstillingsprocesser afgørende for GCT ‘s kommercielle succes, hvilket er særligt vanskeligt at opnå i små fremstillingsvirksomheder¹. Udgifterne til tid, arbejdskraft, og kvalitet forsikringer er forstørret, når hver batch af celler kun producerer et par doser for en patient i stedet for hundreder eller tusinder. I modsætning til allogene celle terapier, hvor fremstillingsprocesser er mere beslægtet med produktion af antistoffer og rekombinante proteiner, fremstilles autologe celle terapier typisk som små operationer¹. Som et relativt nyt fænomen inden for biofarmaceutiske produktion²er mulighederne for småcellet forarbejdning i øjeblikket ret begrænsede.

Buffer udveksling er afgørende for celle produktion. Det er en af downstream-processerne, hvor cellerne fjernes fra dyrkningsmedier og koncentreres om Kryopreservation eller infusion. I øjeblikket anvender småcellet celle fremstilling ofte processer svarende til dem i den akademiske forsknings indstilling og er afhængige af specialiserede rene rum for at opretholde sterilitet³. Manuelle downstream-processer bruger ofte stationære centrifuger til pellet og resuspension af celler til reduktion af volumen og buffer udveksling. Disse åbne processer er dyre (dvs. arbejdskraft og Clean Room vedligeholdelse) og har begrænset produktionskapacitet, som ikke er ideelle til kommerciel produktion^2,3.

Implementering automatisering er blevet foreslået som en løsning til at forbedre produktionen effektivitet og opnå kommerciel skala produktioner². Sterilitet kan ikke opnås i celle-baserede produkter gennem traditionelle metoder, der anvendes til biologiske, såsom gammabestråling eller Terminal ende filtrering. I stedet implementeres et automatiseret lukket system for at reducere risikoen for kontaminering og operatører, der er afhængige af rene rum for at opretholde sterilitet⁴. Procesautomatisering løser også problemet med skalerbarhed ved enten at have flere systemer kørende parallelt (skalering) eller øge behandlingskapaciteten for en enkelt enhed (Scale-up), hvilket igen minimerer variabiliteten mellem operatørerne. Desuden tyder cost modellering analyse af autologt terapier, at automatisering kan reducere omkostningerne ved fremstilling af^5,6. Der blev imidlertid ikke fundet nogen cost-benefit i et klinisk forsøg med autologe stamceller, hvor der blev anvendt en automatiseret fremstillings platform⁷, hvilket tyder på, at omkostningsfordelen ved automatisering kan afhænge af den enkelte fremstillingsproces.

Der er forskellige strategier, hvor automatisering kan introduceres i en eksisterende fremstillingsproces. Dette kan opnås enten ved at implementere en fuldt integreret platform eller en modulbaseret forarbejdningskæde. Der er flere fuldt integrerede platforme kommercielt tilgængelige for autologt celle produktion, såsom CliniMACS Prodigy (Miltenyi bioTec), Cocoon (Octane Biotech), og Quantum (TERUMO BCT). Disse integrerede platforme, der ofte betegnes som “GMP-in-a-box”, har lave krav til infrastrukturen og er nemme at betjene. Produktionskapaciteten for en fuldt integreret opsætning kan dog være begrænset af den inkubator, der er tilsluttet systemet. F. eks. er fremstillings kapaciteten for Prodigy begrænset til 400 ml kammer⁸ , og kvante patronen har et begrænsende overfladeareal indstillet til 2,1 m² (svarende til 120 T175 kolber)⁷, hvilket måske ikke er tilstrækkeligt til patienter, der kræver højere celle doser^9,10. Desuden har Prodigy og Quantum en fælles attribut, der begrænser deres anvendelse: den operationelle enhed er besat af en enkelt batch af celler i hele cellen ekspansions perioden, og dermed begrænse antallet af partier, der kan fremstilles af hver enhed¹¹. Den modulære tilgang til automatisering er at skabe en produktionskæde med flere modulære enheder, der simulerer den kommercielle fremstillingsproces^12,13. Denne fremgangsmåde, som adskiller kultur enheden fra celle vaske anordningen, kan derved maksimere produktionseffektiviteten. En ideel behandlingsenhed ville være en, der er tilpasningsdygtig og skalerbar til produktionsbehov¹².

Counterflow centrifugering (CFC) teknologi, der daterer sig tilbage til 1970 ‘ erne, har haft en lang historie i cellebehandling¹⁴. Det opnår celle koncentration og adskillelse ved at afbalancere centrifugalkraft med en modstrøms kraft. Typisk kommer en cellesuspension fra den smalle ende af et celle kammer under en konstant strømningshastighed, mens den udsættes for en centrifugalkraft (figur 1a). Strømmen af væsken udøves i den modsatte retning til centrifugal kraften. Dette kaldes modstrøms kraften, som danner en gradient i celle kammeret. Modstrøms kraften aftager derefter som celle kammeret udvider væk fra spidsen af den kegleformede celle kammer. Celler med højere densitet og større diameter har en højere sedimenterings hastighed, og dermed når de Kraftligevægt mod spidsen af det kegleformede celle kammer. Mindre partikler kan opnå ligevægt mod bunden af kammeret eller være for lille til at blive opbevaret i kammeret og vil blive vasket væk. CFC-teknologien er mest kendt for sin anvendelse i behandling af blodaferese produkter, såsom isolerende monocytter for dendritiske celle terapier^15,16. Med hensyn til buffer udveksling, er CFC-teknologien kun blevet anvendt i storstilet produktion¹⁷ og har endnu ikke anvendes til den mindre skala fremstilling af autologt celle terapier.

For at imødegå behovet for en egnet anordning til småcellet fremstilling, en automatiseret CFC-enhed (Se tabel over materialer), blev for nylig udviklet¹⁸. Den automatiserede cellebehandling enhed bruger modstrøms Centrifugerings teknologi til at fjerne cellerester og lette buffer udveksling. Enheden udfører buffer udveksling med en engangs-kit, der kan være steril-forbundet til en celle overførsel taske, som gør det muligt for cellerne, der skal behandles i et sterilt, lukket system. Her undersøger vi brugen af en modstrøms centrifugal anordning til at udføre buffer udveksling i pattedyr cellekulturer i automatiserede protokoller. I denne undersøgelse testede vi buffer Exchange-protokollen ved hjælp af Jurkat-celler og mesenchymal stromale celler (MSCs) til at modellere ikke-vedhængende og vedhængende celletyper hhv. Jurkat celler er udødeliggjort t celler ofte anvendes til studiet af akut t celle leukæmi^19,20. MSCs er voksne stamceller, der er blevet undersøgt i humane kliniske forsøg for en bred vifte af sygdomme⁹.

Protocol

1. klargøring af reagenser og celler til buffer udveksling Forbered buffere (Se tabel over materialer) i en klasse 2 laminar flow hætte. Ved hjælp af en sprøjte og nål samling, fjerne 50 mL saltopløsning fra en 500 mL saltvands pose. Udskift dette med 50 mL 20% humant serumalbumin (HSA) for at lave 2% HSA i saltvand, som vil fungere som vaskebuffer. Fjern cellerne fra kultur skibene og Udfør et celletal for at bestemme start cellens mængde og levedygtighed ved trypan og et Blu…

Representative Results

I denne protokol brugte vi Jurkat cells og MSCs som repræsentative eksempler til at demonstrere den automatiserede buffer udvekslingsproces. Under processen delte Jurkat-celler og MSCs de samme forarbejdningstrin med forskelle i centrifugalkraft og pumpehastighed, der styrer strømningshastigheden (tabel 1). Figur 2 viser repræsentative billeder taget af kameraet for, hvordan den fluidiserede celle seng kan vises under buffer udvekslingsprocessen. Typisk vil den fluidisere…

Discussion

Den beskrevne automatiserede buffer udvekslings protokol er enkel og brugervenlig. Ikke desto mindre er der et par vigtige skridt i denne protokol, der er kritiske og kræver særlig opmærksomhed. I vores erfaring, ved behandling af større celler såsom MSCs (gennemsnitlige diameter 10 – 15 μm) hver kørsel bør omfatte mindst 1 x 10⁷ celler for at opnå optimal celle opsving (figur 4B). Behandling af mindre celler, såsom Jurkat celler (Gennemsnitlig ~ 10 μ…

Materials

20 ml Luer lock syringes	BD	302830
20% Human serum albumin (HSA)	CSL Behring	AUST R 46283
4-(Dimethylamino)benzaldehyde	Sigma-Aldrich	156477-25g
500ml IV saline bag	Fresenius Kabi	K690521
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240112
Automated cell counter (Countess)	Thermo Fisher Scientific	N/A
Cell counting chamber slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
Cell stimulation cocktail (500x)	Thermo Fisher Scientific	00-4970-93
Cell transfer bags	Terumo	T1BBT060CBB
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G3582
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM: F12 media	Thermo Fisher Scientific	11320082
EnVision plate Reader	Perkin Elmer	N/A
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10099141
Human Interleukin 2 (IL2) Kit	Perkin Elmer	Al221C
Luer (female) fittings	CPC	LF41
PC laptop or PC tablet device	ASUS	N/A
Plate reader (SpectraMax i3)	Molecular Device	N/A
Recombinant Human IFN-γ	PeproTech	300-02
Rotea counterflow centrifuge cell processing device	Scinogy	N/A
Rotea single-use processing kit	Scinogy	N/A
RPMI media	Thermo Fisher Scientific	11875119
Surgical scissors	ProSciTech	420SS
Trichloroacetic acide	Sigma-Aldrich	T6399-250g
Trypan Blue stain	Thermo Fisher Scientific	T10282
Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme)	Thermo Fisher Scientific	12604013