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Bioengineering

स्मॉल-स्केल सेल प्रोसेसिंग के लिए ऑटोमेटेड काउंटरफ्लो सेंट्रलाइजसिस्टम

Published: December 12, 2019 doi: 10.3791/60423
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,2, 1, 1,2, 1,2, 3, 1,2,4
1The Ritchie Centre, Hudson Institute of Medical Research, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, Monash University, 3Scinogy, 4Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

Summary

स्वचालन सेल विनिर्माण में अपस्केलिंग और लागत प्रबंधन के लिए महत्वपूर्ण है। यह पांडुलिपि छोटे पैमाने पर बायोप्रोसेसिंग के लिए बफर एक्सचेंज और सेल एकाग्रता चरणों को स्वचालित करने के लिए एक काउंटरफ्लो अपकेंद्रित्र सेल प्रोसेसिंग डिवाइस के उपयोग का वर्णन करती है।

Abstract

जीन और सेल आधारित चिकित्सा के सफल व्यावसायीकरण के लिए विनिर्माण प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है जो लागत प्रभावी और स्केलेबल हैं। बफर एक्सचेंज और उत्पाद एकाग्रता अधिकांश विनिर्माण प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक घटक हैं। हालांकि, उत्पाद विकास के शुरुआती चरणों में, इन चरणों को अक्सर मैन्युअल रूप से किया जाता है। बफर एक्सचेंज के लिए मैनुअल डेड-एंड सेंट्रलाइजेशन श्रम-गहन, महंगा और स्केलेबल नहीं है। एक बंद स्वचालित प्रणाली प्रभावी ढंग से इस श्रमसाध्य कदम को खत्म कर सकते हैं, लेकिन कार्यान्वयन चुनौतीपूर्ण हो सकता है । यहां, हम एक नए विकसित सेल प्रोसेसिंग डिवाइस का वर्णन करते हैं जो छोटे से मध्यम पैमाने पर सेल प्रसंस्करण के लिए उपयुक्त है और इसका उद्देश्य मैनुअल प्रसंस्करण और बड़े पैमाने पर स्वचालन के बीच की खाई को पाटना है। इस प्रोटोकॉल को प्रवाह दर और केंद्रीकरण गति को संशोधित करके विभिन्न सेल प्रकारों और प्रक्रियाओं पर आसानी से लागू किया जा सकता है। हमारे प्रोटोकॉल ने मैनुअल प्रक्रिया की तुलना में कम प्रसंस्करण समय के साथ उच्च सेल वसूली का प्रदर्शन किया। स्वचालित प्रक्रिया से बरामद कोशिकाओं ने भी अपनी प्रसार दरों को बनाए रखा । डिवाइस को बफर एक्सचेंज, सेल फॉर्मूलेशन और क्रायोप्रिजर्वेशन जैसे चरणों को समायोजित करने के लिए एक बंद विनिर्माण प्रक्रिया में मॉड्यूलर घटक के रूप में लागू किया जा सकता है।

Introduction

आधुनिक चिकित्सा के परिदृश्य जीन और सेल आधारित चिकित्सा (जीसीटी) में हाल की घटनाओं के माध्यम से तेजी से बदल गया है । ट्रांसलेशनल रिसर्च में सबसे तेजी से बढ़ते क्षेत्रों में से एक के रूप में, जीसीटी क्षेत्र को भी अद्वितीय और अभूतपूर्व चुनौतियों का सामना करना पड़ता है । मजबूत नैदानिक परिणामों के अलावा, जीसीटी की वाणिज्यिक सफलता के लिए कुशल और लागत प्रभावी विनिर्माण प्रक्रियाएं आवश्यक हैं, जो विशेष रूप से छोटे पैमाने पर विनिर्माण1में प्राप्त करना मुश्किल है। समय, श्रम और गुणवत्ता आश्वासन की लागत बढ़ाया जाता है जब कोशिकाओं के प्रत्येक बैच केवल सैकड़ों या हजारों के बजाय एक मरीज के लिए कुछ खुराक पैदा करता है । एलोजेनिक सेल उपचारों के विपरीत जिसमें विनिर्माण प्रक्रियाएं एंटीबॉडी और पुनः संयोजन प्रोटीन के उत्पादन के समान हैं, ऑटोलोगस सेल उपचार आमतौर पर छोटे पैमाने पर संचालन1के रूप में उत्पादित होते हैं। बायोफार्माविनिर्माण2में अपेक्षाकृत नई घटना के रूप में, छोटे पैमाने पर सेल प्रसंस्करण के लिए विकल्प वर्तमान में काफी सीमित हैं।

बफर एक्सचेंज सेल विनिर्माण के लिए आवश्यक है। यह डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं में से एक है जहां कोशिकाओं को संस्कृति मीडिया से हटा दिया जाता है और क्रायोप्रिजर्वेशन या जलसेक के लिए केंद्रित किया जाता है। वर्तमान में, छोटे पैमाने पर सेल विनिर्माण अक्सर अकादमिक अनुसंधान सेटिंग में उन लोगों के समान प्रक्रियाओं को लागू करता है और 3बंध्यताबनाए रखने के लिए विशेष स्वच्छ कमरे पर निर्भर करता है । मैनुअल डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाएं अक्सर वॉल्यूम डिडक्शन और बफर एक्सचेंज के लिए पैलेट और रिस्ट्रेन सेल के लिए बेंचटॉप अपकेंद्री का उपयोग करती हैं। ये खुली प्रक्रियाएं महंगी (यानी, श्रम और स्वच्छ कमरे मेंटेनेंस) हैं और इसमें सीमित विनिर्माण क्षमता है, जो वाणिज्यिक उत्पादन2,3के लिए आदर्श नहीं हैं।

विनिर्माण दक्षता में सुधार और वाणिज्यिक पैमाने पर प्रस्तुतियोंकोप्राप्त करने के समाधान के रूप में स्वचालन को लागू करने का प्रस्ताव किया गया है । गामा विकिरण या टर्मिनल एंड फिल्ट्रेशन जैसे जीवविज्ञान के लिए उपयोग किए जाने वाले पारंपरिक तरीकों के माध्यम से सेल-आधारित उत्पादों में स्टर्लिटी हासिल नहीं की जा सकती है। इसके बजाय, एक स्वचालित बंद प्रणाली संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए तैनात किया जाता है और ऑपरेटरों को निष्फलबनाएरखने के लिए स्वच्छ कमरे पर निर्भर 4 । प्रोसेस ऑटोमेशन या तो समानांतर (स्केल-आउट) में चलने वाले कई सिस्टम होने या किसी व्यक्तिगत डिवाइस (स्केल-अप) की प्रसंस्करण क्षमता को बढ़ाकर स्केलेबिलिटी के मुद्दे को भी संबोधित करता है, जो बदले में ऑपरेटरों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करता है । इसके अलावा, ऑटोलोगस उपचारों के लागत मॉडलिंग विश्लेषण से पता चलता है कि स्वचालन से विनिर्माण की लागत5,6कम हो सकती है। हालांकि, एक ऑटोलॉगस स्टेम सेल नैदानिक परीक्षण में कोई लागत लाभ नहीं मिला, जहां एक स्वचालित विनिर्माण मंच का उपयोग7किया गया था, यह सुझाव देते हुए कि स्वचालन का लागत लाभ व्यक्तिगत विनिर्माण प्रक्रिया पर निर्भर हो सकता है।

विभिन्न रणनीतियां हैं जिनमें स्वचालन को मौजूदा विनिर्माण प्रक्रिया में पेश किया जा सकता है। यह या तो पूरी तरह से एकीकृत मंच या मॉड्यूलर आधारित प्रसंस्करण श्रृंखला को लागू करके प्राप्त किया जा सकता है। ऑटोलॉगस सेल मैन्युफैक्चरिंग के लिए व्यावसायिक रूप से कई पूरी तरह से एकीकृत प्लेटफॉर्म उपलब्ध हैं, जैसे क्लिनिमैक्स कौतुक (मिल्टेनी बायोटेक), कोकून (ऑक्टेन बायोटेक), और क्वांटम (टेरुमो बीसीटी)। इन एकीकृत प्लेटफार्मों, जिन्हें अक्सर "जीएमपी-इन-ए-बॉक्स" के रूप में वर्णित किया जाता है, बुनियादी ढांचे पर कम मांग रखते हैं और काम करना आसान होता है। हालांकि, पूरी तरह से एकीकृत सेटअप की विनिर्माण क्षमता प्रणाली से जुड़े इनक्यूबेटर द्वारा प्रतिबंधित की जा सकती है। उदाहरण के लिए, कौतुक की कुल क्षमता अपने 400 मीटर चैंबर8 तक सीमित है और क्वांटम कारतूस में एक सीमित सतह क्षेत्र है जो 2.1 मीटर2 (120 टी175 फ्लास्क के बराबर)7है, जो उच्च कोशिका खुराक9,10की आवश्यकता वाले रोगियों के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है। इसके अतिरिक्त, कौतुक और क्वांटम में एक आम विशेषता है जो उनके उपयोग को सीमित करती है: परिचालन इकाई को सेल विस्तार अवधि में कोशिकाओं के एक बैच द्वारा कब्जा कर लिया जाता है, इस प्रकार प्रत्येक इकाई11द्वारा निर्मित किए जा सकने वाले बैचों की संख्या को सीमित करता है। स्वचालन के प्रति मॉड्यूलर दृष्टिकोण कई मॉड्यूलर इकाइयों के साथ एक विनिर्माण श्रृंखला बनाना है जो वाणिज्यिक विनिर्माण प्रक्रिया12,13का अनुकरण करता है । यह दृष्टिकोण, जो संस्कृति डिवाइस को सेल वाशिंग डिवाइस से अलग करता है, जिससे विनिर्माण दक्षता को अधिकतम किया जा सकता है। एक आदर्श प्रसंस्करण उपकरण वह होगा जो विनिर्माण के लिए अनुकूलनीय और स्केलेबल है12की आवश्यकता है ।

काउंटरफ्लो सेंट्रलियूगेशन (सीएफसी) तकनीक, जो 1970 के दशक में वापस आ गई है, सेल प्रोसेसिंग14में एक लंबा इतिहास रहा है । यह एक प्रतिप्रवाह बल के साथ अपकेंद्रित्र बल संतुलन द्वारा सेल एकाग्रता और जुदाई प्राप्त करता है। आमतौर पर, एक सेल निलंबन एक निरंतर प्रवाह दर के तहत एक सेल कक्ष के संकीर्ण अंत से प्रवेश करता है, जबकि एक अपकेंद्रित्र बल(चित्रा 1ए)के अधीन है। तरल पदार्थ का प्रवाह विपरीत दिशा में अपकेंद्रित्र बल में लगाया जाता है। इसे काउंटरफ्लो फोर्स के रूप में जाना जाता है, जो सेल चैंबर के भीतर एक ढाल बनाता है। इसके बाद काउंटरफ्लो फोर्स कम हो जाती है क्योंकि सेल चैंबर शंकु के आकार के सेल चैंबर की नोक से दूर हो जाता है । उच्च घनत्व और बड़े व्यास वाली कोशिकाओं में उच्च तलछट दर होती है, और इस प्रकार वे शंकु के आकार के सेल कक्ष की नोक की ओर बल संतुलन तक पहुंचते हैं। छोटे कण कक्ष के आधार की ओर संतुलन तक पहुंच सकते हैं या कक्ष में बनाए रखने के लिए बहुत छोटे हो सकते हैं और धोया जाएगा। सीएफसी तकनीक ज्यादातर रक्त एपेरेसिस उत्पादों को संसाधित करने में अपने आवेदन के लिए जानी जाती है, जैसे कि डेंड्रिटिक सेल उपचारों के लिए मोनोसाइट्स को अलग करना15,16। बफर एक्सचेंज के संदर्भ में, सीएफसी प्रौद्योगिकी केवल बड़े पैमाने पर विनिर्माण17 में लागू किया गया है और अभी तक ऑटोलोगस सेल चिकित्सा के छोटे पैमाने पर विनिर्माण के लिए इस्तेमाल किया जाना है ।

छोटे पैमाने पर सेल विनिर्माण के लिए एक उपयुक्त डिवाइस की आवश्यकता को संबोधित करने के लिए, एक स्वचालित सीएफसी डिवाइस (सामग्री की तालिकादेखें), हाल ही में18विकसित किया गया था । स्वचालित सेल प्रोसेसिंग डिवाइस सेल मलबे को हटाने और बफर एक्सचेंज की सुविधा के लिए काउंटरफ्लो सेंट्रलियूजेशन तकनीक का उपयोग करता है। डिवाइस एक एकल उपयोग किट के साथ बफर एक्सचेंज करता है जिसे सेल ट्रांसफर बैग से बाँझ-कनेक्ट किया जा सकता है, जो कोशिकाओं को बाँझ, संलग्न प्रणाली के भीतर संसाधित करने की अनुमति देता है। यहां, हम स्वचालित प्रोटोकॉल में स्तनधारी कोशिका संस्कृतियों में बफर एक्सचेंज करने के लिए एक प्रतिप्रवाह अपकेंद्री उपकरण के उपयोग की जांच करते हैं। इस अध्ययन में, हमने क्रमशः गैर-अनुयायी और अनुयायी सेल प्रकारों को मॉडल करने के लिए जुरकैट कोशिकाओं और मेसेंचिमल स्ट्रोमल कोशिकाओं (एमएससी) का उपयोग करके बफर एक्सचेंज प्रोटोकॉल का परीक्षण किया। जुरकैट कोशिकाओं को अमर कर दिया जाता है टी कोशिकाएं अक्सर तीव्र टी सेल ल्यूकेमिया19,20के अध्ययन के लिए उपयोग की जाती हैं । एमएससी वयस्क स्टेम सेल हैं जिनका अध्ययन मानव नैदानिक परीक्षणों में विभिन्न प्रकार की बीमारियों के लिए किया गया है9.

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Protocol

1. बफर एक्सचेंज के लिए अभिकर्मकों और कोशिकाओं की तैयारी

  1. एक वर्ग 2 लैमिनार प्रवाह हुड में बफ़र्स (सामग्री की तालिकादेखें) तैयार करें। एक सिरिंज और सुई विधानसभा का उपयोग करना, एक 500 मिलील खारा बैग से खारा समाधान के 50 mL हटा दें। इसे 20% ह्यूमन सीरम एल्बुमिन (एचएसए) के 50 mL के साथ बदलें ताकि नमकीन में 2% एचएसए बनाया जा सके, जो वॉश बफर के रूप में काम करेगा।
  2. संस्कृति जहाजों से कोशिकाओं को हटा दें और नीले बहिष्कार को ट्राइपैन द्वारा शुरुआती कोशिका मात्रा और व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए एक सेल गिनती करें। कोशिकाओं को एक स्थानांतरण बैग में लोड करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में जुरकैट कोशिकाओं को आरपीएमआई में सुसंस्कृत किया गया था और एमएससी को DMEM: F12 में सुसंस्कृत किया गया था। दोनों मीडिया को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान के साथ पूरक किया गया था। कोशिकाओं को 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सुसंस्कृत किया गया था । एमएससी या अनुयायी कोशिकाओं के लिए, कोशिकाओं को अलग करने के लिए संस्कृति जहाजों में पाचन एंजाइम (उदाहरण के लिए, ट्राइप्सिन) जोड़ें, और कोशिकाओं को अलग होने के बाद संस्कृति मीडिया के साथ बुझाएं। इस प्रोटोकॉल में एक ट्रांसफर बैग का इस्तेमाल किया गया था क्योंकि संस्कृति जहाजों में कोशिकाओं का विस्तार किया गया था । हालांकि, अगर कोशिकाओं को एक सेल संस्कृति बैग में सुसंस्कृत कर रहे हैं, यह सीधे बाँझ ट्यूब वेल्डिंग के माध्यम से एकल उपयोग किट से जोड़ा जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, या तो 3 x 107 जुरकैट कोशिकाओं या 1 x 107 एमएससी प्रत्येक रन के लिए इस्तेमाल किया गया था, जहां कोशिकाओं को संस्कृति मीडिया के 40 मिलील में निलंबित कर दिया गया था।
    1. एक हस्तांतरण बैग में कोशिकाओं लोड (सामग्री की मेजदेखें) एक सिरिंज और सुई विधानसभा का उपयोग कर अगर एक बाँझ ट्यूब वेल्डर एकल उपयोग प्रसंस्करण किट के लिए हस्तांतरण बैग कनेक्ट करने के लिए उपलब्ध है ।
    2. वैकल्पिक रूप से, स्थानांतरण बैग से जुड़े लगभग 10 सेमी शेष के साथ कनेक्टिंग ट्यूब को काटने के लिए ऑटोक्लेव कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें और ट्यूबिंग के अंत में एक महिला लूर कनेक्टर जोड़ें। कोशिकाओं और मीडिया को एस्पिरेट करने के लिए सिरिंज का उपयोग करें, फिर सिरिंज को लूयर कनेक्टर से कनेक्ट करें और कोशिकाओं को स्थानांतरण बैग से लोड करें।
  3. कोशिकाओं वाले बैग को कनेक्ट करें, चरण 1.1 में तैयार वॉश बफर के 500 मिलील वाले बफर बैग को धोएं, अपशिष्ट बैग, और एकल उपयोग किट(चित्रा 1बी)के लिए सिरिंज एकत्र करें।
    नोट: प्रत्येक बैग की कनेक्टिंग स्थिति कार्यक्रम में सेटिंग्स पर निर्भर करती है। इस प्रोटोकॉल में, हमने स्थिति ए पर अपशिष्ट बैग, स्थिति बी पर वॉश बफर, पोजिशन डी और एफ पर सेल बैग, और स्थिति एच(चित्रा 1सी)पर संग्रह सिरिंज से जुड़ा।

2. स्वचालित बफर एक्सचेंज प्रोटोकॉल के लिए कार्यक्रम

  1. डिवाइस का ग्राफिक यूजर इंटरफेस (जीयूआई) खोलें और लैपटॉप पीसी या टैबलेट पर'स्टारटी'बटन दबाएं। फिरनयाबनाने के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल या प्रेस'नया'खोलें।
  2. प्रत्येक चरण के माध्यम से नेविगेट करने के लिए"फॉरवर्ड"और'बैकवर्ड'बटन का उपयोग करें, खोले/बंद होने के लिए वाल्व का चयन करें, अपकेंद्रित्र गति, पंप की गति, पंप दिशा, और कार्रवाई ट्रिगर। प्रत्येक चरण के लिए सेटिंग्स तालिका 1में संक्षेप में दी जाती हैं । इसके बाद प्रोटोकॉल बचाएं।

3. मशीन की स्थापना

  1. मशीन पर सिंगल-यूज प्रोसेसिंग किट रखें और उसी हिसाब से कनेक्टेड बैग ्स को हैंग करें। सभी वाल्वों को डिफॉल्ट बंद स्थिति में रीसेट करने के लिए लाल'स्टॉप/रीसेट'बटन दबाएं।
    नोट: मशीन एक परीक्षण प्रदर्शन जब दरवाजा सुनिश्चित करने के लिए किट सही ढंग से रखा गया है और यह कि सभी वाल्व उचित काम कर रहे है बंद कर दिया जाएगा ।
  2. जीयूआई को प्रोसेसिंग डिवाइस से कनेक्ट करें और'कनेक्ट'बटन दबाएं। फिर सहेजे गए कार्यक्रम को डाउनलोड करें। जब हरा'प्ले'बटन ऊपर रोशनी, यह इंगित करता है कि प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए तैयार है।
  3. ट्रांसफर बैग ट्यूबिंग के लिए मैनुअल क्लैंप खोलें।
    नोट: यदि ऑपरेटर क्लैंप खोलना भूल जाता है, तो डिवाइस बंद हो जाएगा और दबाव सेंसर चेतावनी दिखाई देगी। डिवाइस को रीसेट करने के लिए'स्टॉप'बटन दबाएं और फिर से शुरू करने के लिए क्लैंप खोलें।

4. स्वचालित बफर एक्सचेंज

  1. बफर एक्सचेंज प्रोग्राम शुरू करने के लिए'स्टार्ट'प्रेस करें।
    नोट: स्वचालित प्रक्रिया को मैन्युअल रूप से बदलने के लिए, प्रक्रिया को होल्ड पर रखने के लिए'ट्रिगर'या प्रेस'ठहराव'तक पहुंचने से पहले अगले चरण में जाने के लिए'अगला'बटन दबाएं। यह केवल वाल्व जे और कश्मीर खुला(चित्रा 1सी)रखते हुए किट के माध्यम से कोशिकाओं को फिर से परिचालित करेगा ।
  2. स्वचालन चरण 6(तालिका 1)के अंत में, प्रक्रिया तब रुक जाएगी जब अब खाली बैग में हवा बुलबुला सेंसर को ट्रिगर करती है। प्रेस"अगले"अगले कदम के लिए प्रक्रिया को स्थानांतरित करने के लिए अगर बैग वास्तव में खाली है, या प्रेस"ठहराव"प्रसंस्करण फिर से शुरू करने के लिए अगर सेंसर लाइन में एक बुलबुले से शुरू हो गया था ।

5. कोशिकाओं को इकट्ठा करना और नमूना देना

  1. जब स्वचालित प्रक्रिया समाप्त हो जाती है, तो सभी ट्यूबिंग क्लैंप को बंद कर दें। दरवाजा खोलें और डिवाइस से सिंगल-यूज किट लें। बाद की प्रक्रियाओं के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए सिरिंज डिस्कनेक्ट करें। सेल काउंट और व्यवहार्यता जांच के लिए एकत्र कोशिकाओं का नमूना लें (चरण 6.2 देखें)।

6. प्रक्रिया सत्यापन

  1. मैनुअल बफर एक्सचेंज प्रोटोकॉल का उपयोग करके नियंत्रण प्रयोग करें।
    1. 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज सेल सस्पेंशन। सुपरनेटेंट को त्यागें और सेल वॉश बफर के 30 मीटर के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर फिर से सेल निलंबन को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेटेंट को त्यागें और सेल वॉश बफर के 10 मीटर के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  2. एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर सेल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन परख के माध्यम से सेल गिनती करें।
  3. 2, 24, और 48 घंटे में सेल प्रसार की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक एमटीएस परख प्रदर्शन करें।
    नोट: एमटीएस परख निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक ९६ अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट पर किया गया था । सेल कल्चर मीडिया (10,000 ज्यूकैट कोशिकाओं या 1,500 युक्त) का 100 माइक्रोन एलीकोट बफर एक्सचेंज प्रक्रिया के बाद चढ़ाया गया था। हर समय, एमटीएस अभिकर्मकों के 20 μL प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा गया था और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड। एक प्लेट रीडर का उपयोग कर490 एनएम पर अवशोषक का आकलन किया गया था।
  4. जुरकैट कोशिकाओं और एमएससी समारोह पर मैनुअल प्रक्रिया बनाम स्वचालित प्रक्रिया के प्रभाव की तुलना करने के लिए कार्यात्मक परख प्रदर्शन करें।
    1. संस्कृति जुरकैट कोशिकाओं को एक ९६-अच्छी तरह से थाली में 1 x १०६ कोशिकाओं/mL के घनत्व में ५० एनजी/mL phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (PMA) और 1 μg/mL आयनोमाइसिन (सेल उत्तेजना कॉकटेल) DMEM में उत्तेजित: F12 मीडिया 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त २४ hh के लिए । कोशिकाओं को 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें ।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, बीड-आधारित एलिसा परख (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके संस्कृति अधिनेत से इंटरल्यूकिन-2 उत्पादन को मापें।
    3. डीएमईएम के 1 एमएल में 10,000 कोशिकाओं/सेमी2 के घनत्व में 12 अच्छी प्लेट में संस्कृति एमएससी: F12 मीडिया जिसमें 10% एफबीएस शामिल हैं, जो इंटरफेरॉन के साथ पूरक है- 48 एच के लिए 50 इकाइयों/mL। इंडोलेमाइन 2,3-डाइऑक्सीजनेस (आईडीओ) एंजाइम गतिविधि को मापने के लिए किनुरिन एकाग्रता परख के लिए सुपरनेटेंट एकत्र करें

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में, हमने स्वचालित बफर एक्सचेंज प्रक्रिया को प्रदर्शित करने के लिए प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में जुरकैट कोशिकाओं और एमएससी का उपयोग किया। इस प्रक्रिया के दौरान, जुरकैट कोशिकाओं और एमएससी ने अपकेंद्रित्र बल और पंप गति में अंतर के साथ एक ही प्रसंस्करण चरणों को साझा किया जो प्रवाह दर(तालिका 1)को नियंत्रित करते हैं। चित्रा 2 बफर एक्सचेंज प्रक्रिया के दौरान तरलीकृत सेल बिस्तर कैसे दिखाई दे सकता है, इसके कैमरे द्वारा कैप्चर की गई प्रतिनिधि छवियों को दिखाता है। आमतौर पर, तरलीकृत सेल बिस्तर चित्रा 2एमें छवि के समान होगा, जहां कोशिकाएं कक्ष की नोक पर एक छोटी सी जगह के साथ शंकु के सामने और शंकु के सामने जमा होती हैं, जहां कोशिकाएं जमा नहीं होती हैं और सेल लोडिंग इनलेट का उद्घाटन दिखाई देता है। तरल सेल बिस्तर संकुचित किया जा सकता है(चित्रा 2बी)नए बफर को पेश करते समय जो एक अलग चिपचिपाहट या घनत्व पर है। इस प्रोटोकॉल में वाशिंग स्टेप की शुरुआत में पंप की स्पीड 30-35 मिली/मिन से घटाकर 20 मीटर/मिन कर दी गई। एक बार चैंबर नए बफर से भर गया था, पंप की गति कक्ष की नोक पर छर्रों कोशिकाओं को रोकने के लिए सामांय करने के लिए वापस आ गया था । लाइव कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए एक उच्च प्रवाह दर(चित्रा 2सी)लागू किया जा सकता है क्योंकि मृत कोशिकाएं छोटी और हल्की होती हैं और प्रवाह दर में वृद्धि करके उन्हें चैंबर से बाहर मजबूर किया जा सकता है।

बफर एक्सचेंज की स्वचालित प्रक्रिया पहले कोशिकाओं को केंद्रित करके हासिल की गई थी, फिर वॉश बफर पेश करती थी, जो तरल कोशिका बिस्तर की मात्रा के लगभग 10x थी। तब कोशिकाओं को वांछित मात्रा में तैयार किया गया था। इन तीन प्रसंस्करण चरणों को मैनुअल बफर एक्सचेंज के समान सिद्धांतों का पालन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। आमतौर पर, मैनुअल बफर एक्सचेंज करने के लिए दो-चक्र केंद्रीकरण (200 x ग्राम,5 मिन) का उपयोग किया जाता है, जिसमें कोशिकाओं को ध्यान केंद्रित करने, धोने के लिए फिर से निलंबित करने के लिए निकाल दिया जाता है, फिर फिर से केंद्रीकृत किया जाता है और अंतिम मात्रा में फिर से निलंबित किया जाता है। स्वचालित प्रक्रियाओं का प्रसंस्करण समय मैनुअल लोगों(चित्रा 3)की तुलना में कम था। मैनुअल और स्वचालित प्रक्रियाओं के बीच वसूली दर दोनों Jurkat कोशिकाओं और MSCs के लिए समान थे, और सेल व्यवहार्यता प्रक्रिया(चित्रा 4)से प्रभावित नहीं था । सेल की गुणवत्ता को सेल प्रसार (एमटीएस परख) और साइटोकिन/एंजाइम उत्पादन द्वारा सत्यापित किया गया था । बरामद कोशिकाओं ने मैनुअल और स्वचालित प्रक्रियाओं(चित्रा 5ए)के बीच समान प्रसार दरों को दिखाया। जुरकैट कोशिकाओं से इंटरल्यूकिन-2 उत्पादन का स्तर और एमएससी की आईडीओ गतिविधि भी दोनों समूहों(चित्र5बी और 5सी)के बीच तुलनीय थी ।

चरण संख्या विवरण खुले वाल्व सेंट्रलाइज स्पीड (जी) पंप की गति (एमएल/मिन) ट्रिगर्स
1 बी से ए तक प्राइम ट्यूबिंग ए, बी, कश्मीर 10 50 वॉल्यूम: 45 मिलीलीटर
2 ए से बी तक बुलबुला जाल भरें ए, बी, कश्मीर 100 50 (रिवर्स) वॉल्यूम: 10 मिलीलीटर
3 प्रधानमंत्री टयूबिंग ए टू डी ए, डी, कश्मीर 100 50 (रिवर्स) वॉल्यूम: 2 मिलीलीटर
4 प्रधानमंत्री टयूबिंग जम्मू से कश्मीर जम्मू, कश्मीर 100 50 वॉल्यूम: 3 मिलीलीटर
5 लोड सेल - प्रारंभिक प्रारंभ डी टू जी डी, कश्मीर, जी 1600 (जुरकैट) 1500 (एमएससी) 25 (जुरकैट) 30 (एमएससी) वॉल्यूम: 100 मिलीलीटर
6 बुलबुले का पता लगाने के साथ लोड कोशिकाओं [बुलबुला का पता लगाने पर/ ए, डी, कश्मीर = अंतिम चरण 30 (जुरकैट) 35 (एमएससी) बबल सेंसर डी
7 पोर्ट डी ट्यूब पर खाली शेष मीडिया ए, डी, कश्मीर = अंतिम चरण = अंतिम चरण वॉल्यूम: 1.5 मिलीलीटर
8 धोने की कोशिकाएं 1 ए, बी, कश्मीर = अंतिम चरण 20 वॉल्यूम: 20 मिलीलीटर
9 धोने की गति को बढ़ाना ए, बी, कश्मीर = अंतिम चरण 35 टाइमर: 5 सेकंड स्पीड रैंपिंग
10 धोने की कोशिकाएं 2 ए, बी, कश्मीर = अंतिम चरण = अंतिम चरण वॉल्यूम: 20 मिलीलीटर
11 फसल के लिए तैयार जम्मू, कश्मीर = अंतिम चरण = अंतिम चरण टाइमर: 2 सेकंड
12 उत्पादन के लिए कोशिकाओं को ठीक करें और मात्रा को लक्षित करने के लिए पतला करें बी, जम्मू, कश्मीर = अंतिम चरण 60 (रिवर्स) वॉल्यूम: 10 मिलीलीटर
नोट: '= अंतिम चरण' जीयूआई में अपकेंद्रित्र गति और पंप गति के लिए एक सेटिंग विकल्प है।

तालिका 1: जुरकैट कोशिकाओं और एमएससी के लिए स्वचालित बफर एक्सचेंज जीयूआई सेटअप।

Figure 1
चित्रा 1: काउंटरफ्लो अपकेंद्रित्र सेल प्रोसेसिंग सिस्टम। (क)एक योजनाबद्ध आरेख जो प्रतिप्रवाह केंद्रीकरण के सिद्धांत को दर्शाता है। काउंटरफ्लो बल सेल चैंबर के भीतर एक ढाल में मौजूद है। जबकि सेंट्रलाइजिंग (ग्रे तीर), बड़े व्यास वाली कोशिकाओं को एक उच्च तलछट बल प्राप्त होता है, जिसमें कोशिकाएं कक्ष के संकीर्ण अंत की ओर बल संतुलन तक पहुंचती हैं, जो एक तरल सेल बिस्तर बनाते हैं। कक्ष में रहने के लिए बहुत छोटे होते हैं कि सेल मलबे और छोटे कण ों को बह जाता है। (ख)काउंटरफ्लो अपेंडिफ्यूजल प्रोसेसिंग सिस्टम में प्रोसेसिंग डिवाइस और सिंगल-यूज प्रोसेसिंग किट शामिल है । (ग)बफर एक्सचेंज प्रोटोकॉल के लिए एकल उपयोग किट विन्यास। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सेल कक्ष में तरल ीकृत सेल बिस्तर। (ए)मध्यम,(बी)कम, और(सी)उच्च प्रवाह दर के तहत एक तरल ीकृत सेल बिस्तर की प्रतिनिधि छवियां। बिंदीदार रेखा कक्ष के भीतर तरल सेल बिस्तर के क्षेत्र को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: मैनुअल और स्वचालित प्रसंस्करण के साथ जुरकैट कोशिकाओं और एमएससी के सेल प्रोसेसिंग समय की तुलना। (n= 3-4 प्रत्येक समूह में, डेटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: मैनुअल और स्वचालित प्रसंस्करण के साथ जुरकैट कोशिकाओं और एमएससी की सेल व्यवहार्यता और लाइव सेल रिकवरी की तुलना। सेल व्यवहार्यता(ए)और लाइव सेल रिकवरी(बी)को स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन परख द्वारा मापा गया था। सीरम के अभाव में लाइव सेल रिकवरी कम हो गई थी या जब केवल 3 x 106 या 1 x 106 कोशिकाओं पर कार्रवाई की गई थी। (n= 4-9 प्रत्येक समूह में, डेटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: मैनुअल और स्वचालित प्रसंस्करण से सेल प्रसार और सेल कार्य। (A)बफर एक्सचेंज के बाद जुरकैट कोशिकाओं और एमएससी की एमटीएस परख 2, 24 और 48 घंटे पर की गई। बरामद कोशिकाओं की गुणवत्ता को जुरकैट कोशिकाओं(बी)से इंटरल्यूकिन-2 उत्पादन और एमएससी(सी)में आईडीओ गतिविधि द्वारा निर्धारित किया गया था। (n= 4-8 प्रत्येक समूह में, डेटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: विभिन्न प्रवाह दर पर तरल सेल बिस्तर स्थिरता। प्रत्येक सेल प्रकार के लिए दो प्रक्रियाएं की गई थीं। एक प्रक्रिया में, या तो 3 x 107 जुरकैट कोशिकाएं या 1 x 107 एमएससी। दूसरी प्रक्रिया में, 10x कोशिकाओं की संख्या का उपयोग किया गया था। दोनों प्रक्रियाओं में, इस प्रोटोकॉल में इंगित अपकेंद्रित्र गति (जुरकैट कोशिकाओं के लिए 1,600 x और एमएससी के लिए 1,500 x ग्राम) का उपयोग करके विभिन्न प्रवाह दरों पर पोर्ट ए से सेल ए के 10 मिलीग्राम एकत्र किए गए थे। एल्यूट्रिएट में कोशिकाओं की संख्या निर्धारित की गई थी और कक्ष में भरी हुई कोशिकाओं की कुल राशि के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत की गई थी। (n = 3 प्रत्येक समूह के लिए, डेटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

स्वचालित बफर एक्सचेंज प्रोटोकॉल वर्णित सरल और उपयोगकर्ता के अनुकूल है। फिर भी, इस प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जो महत्वपूर्ण हैं और विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है। हमारे अनुभव में, जब एमएससी (औसत व्यास 10-15 माइक्रोन) प्रत्येक रन जैसी बड़ी कोशिकाओं को संसाधित करते समय इष्टतम सेल रिकवरी(चित्रा 4बी)प्राप्त करने के लिए कम से कम 1 x 107 कोशिकाओं को शामिल करना चाहिए। जुरकैट कोशिकाओं (औसत ~ 10 माइक्रोन व्यास) जैसे छोटे कोशिकाओं को संसाधित करना, एक स्थिर तरल कोशिका बिस्तर(चित्रा 4बी)प्राप्त करने के लिए लगभग 3 x 107 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। जब सेल संख्या बहुत कम होती है, तो कोशिकाओं को तरल बिस्तर से हटाने की अधिक संभावना होती है, जो अंतिम सेल वसूली को प्रभावित करेगा। इसके अतिरिक्त, जब लगातार अपकेंद्रित्र गति लागू होती है तो हमने विभिन्न पंप गति पर सेल हानि दरों की तुलना की। यहां, हमने देखा कि सेल हानि प्रवाह दर(चित्रा 6)के साथ बढ़ी है, जो उच्च प्रवाह दरों पर तरलीकृत बिस्तर की बढ़ती अस्थिरता के कारण है। हालांकि, सेल हानि का प्रतिशत कम था जब 10x कोशिकाओं की संख्या कक्ष में लोड की गई थी, जिससे पता चलता है कि तेजी से प्रसंस्करण की अनुमति देने के लिए बड़ी संख्या में कोशिकाओं को संसाधित करते समय उच्च पंप गति लागू की जा सकती है। प्रक्रिया के चरण 5 में, संस्कृति मीडिया के 100 मिलील को कक्ष से वापस सेल ट्रांसफर बैग में पुन: परिचालित किया गया ताकि तरलीकृत बिस्तर को वॉल्यूम में कमी और बफर एक्सचेंज से पहले बनाने और स्थिर करने की अनुमति दी जा सके। यदि सेल एकाग्रता कम है (उदाहरण के लिए,0.2 x 10 6/mL से नीचे), तो पुनर्परिसंचरण चरण को पर्याप्त कोशिकाओं को तरल सेल बिस्तर बनाने की अनुमति देने के लिए बढ़ाने की आवश्यकता हो सकती है। इसी तरह अगर सेल कंसंट्रेशन ज्यादा है तो रिसर्चर स्टेप को छोटा किया जा सकता है।

सेल रिकवरी के लिए वॉश बफर में सीरम की मौजूदगी भी अहम है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि हाइड्रोडायनामिक तनाव22,23बफरिंग प्रोटीन के अभाव में परिगलित कोशिका मृत्यु का कारण बन सकता है । प्रतिप्रवाह अपकेंद्रित्र प्रणाली का प्रवाह गतिशील काफी जटिल है। इस प्रोटोकॉल में, सेल वसूली दरों के आसपास 70% तक गिरा जब प्रक्रिया सीरम(चित्रा 4बी)के अभाव में किया गया था. हालांकि सटीक तंत्र स्पष्ट नहीं है, संस्कृति मीडिया या धोने बफ़र्स में एल्बुमिन में सीरम की उपस्थिति कोशिकाओं को संभावित यांत्रिक क्षति को कम करने में सक्षम था । सीरम-मुक्त बफ़र्स की आवश्यकता वाले अनुप्रयोगों के लिए, हाइड्रोक्सेटिट्ल स्टार्च और ड्डिश्न 40 गैर-प्रोटीन एडिटिव्स के उदाहरण हैं जो अक्सर हाइड्रोडायनामिक तनाव24,25से बचाने के लिए सेल विनिर्माण में उपयोग किए जाते हैं।

काउंटरफ्लो सेंट्रलियूगेशन तकनीक का उपयोग बड़े पैमाने पर बायोफार्माविनिर्माण और रक्त उत्पाद प्रसंस्करण17में किया गया है। छोटे पैमाने पर सेल विनिर्माण (यानी, 0.1-10 एल) में सीएफसी प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग अक्सर एफिरेसिस उत्पादों से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को अलग करने तक सीमित होते हैं, जैसे एलुट्रा (तेरुमो बीसीटी)26,जिसमें अतिरिक्त मैनुअल हस्तक्षेप को धोने और ध्यान केंद्रित करने के लिए आवश्यक है। अन्य छोटे पैमाने पर सेल प्रोसेसिंग प्लेटफार्मों में झिल्ली निस्पंदन आधारित बफर एक्सचेंज सिस्टम जैसे लोवो (फ्रेसेनियस काबी)27 और ऊर्ध्वाधर सेंट्रलिफायर सेपरेशन पृथक्करण जैसे सेपेक्स (जीई हेल्थकेयर)28शामिल हैं। हालांकि उपकरणों के बीच सीधी तुलना करना मुश्किल है, लेकिन इस काउंटरफ्लो अपकेंद्रित्र डिवाइस के फायदों में से एक बहुत छोटे आउटपुट वॉल्यूम (न्यूनतम 5 mL) देने की क्षमता है, जो वर्तमान में उपलब्ध सेल प्रोसेसिंग प्लेटफार्मों में सबसे छोटा है। छोटे आउटपुट वॉल्यूम स्थानीय इंजेक्शन29 के लिए कोशिकाओं को तैयार करने या नवजात30के लिए इन्फ्यूजन जैसे अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है। डिवाइस में एम्बेडेड कैमरा भी एक अनूठी विशेषता है जो प्रक्रिया विकास चरण के दौरान तरल कोशिका बिस्तर का दृश्य प्रदान करता है।

सीएफसी तकनीक की सीमाओं में से एक यह है कि यह कोशिकाओं के आकार और घनत्व के प्रति संवेदनशील है। एक अलग सेल प्रकार के लिए एक बफर एक्सचेंज प्रोटोकॉल स्थापित करते समय, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं के लिए एक दिशानिर्देश के रूप में काम करने के लिए अपनी जरूरतों के अनुसार अनुकूलन चाहिए, ब्याज की अपनी कोशिकाओं के आकार और उनके सेल निलंबन के घनत्व को ध्यान में रखते हुए । हालांकि वर्तमान प्रोटोकॉल मीडिया के 5 एल तक प्रसंस्करण के लिए उपयोग करने योग्य है, प्रसंस्करण समय काफी बढ़ाया जाएगा (यानी, 1-2 घंटे)। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस वर्तमान अध्ययन में सेल गुणवत्ता पर विस्तारित प्रसंस्करण समय के प्रभाव की जांच नहीं की गई है।

भविष्य के अध्ययन डिवाइस की अधिकतम प्रसंस्करण क्षमता निर्धारित करने के लिए सेल फ़ंक्शन पर प्रसंस्करण गति और प्रसंस्करण समय के प्रभाव का मूल्यांकन करेंगे। इसके अलावा, भविष्य के अध्ययन क्रायोपआरक्षित उत्पादों से डाइमिथाइल सल्फासऑक्साइड (डीएमएसओ) को हटाने और मृत कोशिकाओं को चयनात्मक हटाने जैसे अन्य अनुप्रयोगों का पता लगा सकते हैं।

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Disclosures

SW, IF, और डीजे सीओओ, सीटीओ, और Scinogy Pty लिमिटेड के सीईओ हैं । सीएफसी डिवाइस तक पहुंच भी सिनोगी द्वारा प्रदान की गई थी।

Acknowledgments

यह काम विक्टोरियन सरकार के परिचालन बुनियादी ढांचे के समर्थन कार्यक्रम, और आर्थिक विकास, नौकरियां, परिवहन और संसाधन विभाग द्वारा प्रदान किए गए विक्टोरियन सरकारी प्रौद्योगिकी वाउचर द्वारा समर्थित है । आरएल एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद कैरियर विकास फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है । अल एक ऑस्ट्रेलियाई स्नातकोत्तर पुरस्कार के प्राप्तकर्ता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 ml Luer lock syringes BD 302830
20% Human serum albumin (HSA) CSL Behring AUST R 46283
4-(Dimethylamino)benzaldehyde Sigma-Aldrich 156477-25g
500ml IV saline bag Fresenius Kabi K690521
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240112
Automated cell counter (Countess) Thermo Fisher Scientific N/A
Cell counting chamber slides Thermo Fisher Scientific C10228
Cell stimulation cocktail (500x) Thermo Fisher Scientific 00-4970-93
Cell transfer bags Terumo T1BBT060CBB
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G3582
Centrifuge Eppendorf 5810R
DMEM: F12 media Thermo Fisher Scientific 11320082
EnVision plate Reader Perkin Elmer N/A
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 10099141
Human Interleukin 2 (IL2) Kit Perkin Elmer Al221C
Luer (female) fittings CPC LF41
PC laptop or PC tablet device ASUS N/A
Plate reader (SpectraMax i3) Molecular Device N/A
Recombinant Human IFN-γ PeproTech 300-02
Rotea counterflow centrifuge cell processing device Scinogy N/A
Rotea single-use processing kit Scinogy N/A
RPMI media Thermo Fisher Scientific 11875119
Surgical scissors ProSciTech 420SS
Trichloroacetic acide Sigma-Aldrich T6399-250g
Trypan Blue stain Thermo Fisher Scientific T10282
Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) Thermo Fisher Scientific 12604013

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References

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Li, A., Wilson, S., Fitzpatrick, I., … More

Li, A., Wilson, S., Fitzpatrick, I., Barabadi, M., Chan, S. T., Krause, M., Kusuma, G. D., James, D., Lim, R. Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing. J. Vis. Exp. (154), e60423, doi:10.3791/60423 (2019).

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