Summary

소규모 셀 처리를 위한 자동 카운터플로우 원심 시스템

Published: December 12, 2019
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Summary

자동화는 셀 제조에서 업스케일링 및 비용 관리의 핵심입니다. 이 원고는 소규모 바이오 프로세싱을 위한 완충교환 및 세포 농도 단계를 자동화하기 위한 카운터플로우 원심 세포 처리 장치의 사용을 설명합니다.

Abstract

유전자 및 세포 기반 치료법의 성공적인 상용화에는 비용 효율적이고 확장 가능한 제조 공정이 필요합니다. 버퍼 교환 및 제품 농도는 대부분의 제조 공정에 필수적인 구성 요소입니다. 그러나 제품 개발의 초기 단계에서이러한 단계는 종종 수동으로 수행됩니다. 버퍼 교환을 위한 수동 막다른 원심분리는 노동 집약적이고 비용이 많이 들며 확장이 가능하지 않습니다. 폐쇄된 자동화 시스템은 이러한 까다로운 단계를 효과적으로 제거할 수 있지만 구현이 어려울 수 있습니다. 여기서는 중소 규모 셀 처리에 적합한 새로 개발된 셀 처리 장치를 설명하고 수동 처리와 대규모 자동화 사이의 격차를 해소하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 유속 및 원심분리 속도를 수정하여 다양한 세포 유형 및 프로세스에 쉽게 적용할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 수동 프로세스에 비해 짧은 처리 시간과 높은 세포 복구를 입증했다. 자동화된 공정으로부터 회수된 세포는 또한 그들의 증식속도를 유지했다. 이 장치는 완충물 교환, 세포 제형 및 냉동 보존과 같은 단계를 수용하기 위해 밀폐 된 제조 공정에서 모듈 식 구성 요소로 적용 할 수 있습니다.

Introduction

현대 의학의 풍경은 유전자와 세포 기반 치료 (GCT)의 최근 발전을 통해 빠르게 변화하고있다. 번역 연구에서 가장 빠르게 성장하는 분야 중 하나인 GCT 부문은 독특하고 전례 없는 도전에 직면하고 있습니다. 견고한 임상 결과 외에도 효율적이고 비용 효율적인 제조 공정은 소규모 제조1에서달성하기 어려운 GCT의 상업적 성공에 필수적입니다. 세포의 각 배치가 수백 또는 수천 대신 한 환자에 대한 몇 가지 복용량을 생산할 때 시간, 노동 및 품질 보증의 비용이 확대됩니다. 제조 과정이 항체 및 재조합 단백질의 생산에 더 가깝다는 동종 세포 치료와는 달리, 자가 세포 치료는 일반적으로 소규모 수술1로생산된다. 바이오 의약품 제조2에서비교적 새로운 현상으로, 소규모 전지 처리에 대한 옵션은 현재 매우 제한적입니다.

버퍼 교환은 셀 제조에 필수적입니다. 그것은 세포가 배양 배지에서 제거되고 동결 보존 또는 주입을 위해 집중되는 다운스트림 프로세스 의 한개입니다. 현재 소규모 세포 제조는 학술 연구 환경에서와 유사한 프로세스를 적용하는 경우가 많으며 불임 유지를 위해 전문 클린 룸에의존합니다 3. 수동 다운스트림 프로세스는 종종 벤치탑 원심분리기를 사용하여 볼륨 감소 및 버퍼 교환을 위해 펠릿 및 재중단 셀을 사용합니다. 이러한 개방 공정은 비용이 많이 들고 (즉, 노동 및 클린 룸 유지 보수) 및 상업 생산2,3에적합하지 않은 제한된 제조 능력을 가지고있다.

자동화 구현은 제조 효율성을 개선하고 상업적 규모의 생산을 달성하기위한 솔루션으로 제안되었다2. 감마 조사 또는 말단 여과와 같은 생물학적 제제에 사용되는 전통적인 방법을 통해 세포 기반 제품에서는 멸균을 달성할 수 없습니다. 대신, 오염 위험을 줄이기 위해 자동 폐쇄 시스템을 구축하고 운영자는 멸균을 유지하기 위해 클린 룸에 의존4. 또한 공정 자동화는 여러 시스템을 병렬로 실행(확장) 또는 개별 장치의 처리 용량(확장)을 증가시켜 운영자 간의 가변성을 최소화함으로써 확장성 문제를 해결합니다. 또한, 자가 치료의 비용 모델링 분석은 자동화가제조5,6의비용을 줄일 수 있음을 시사한다. 그러나 자동화 된 제조플랫폼이7을 사용한 자가 줄기 세포 임상 시험에서는 비용 이점이 발견되지 않았으며 자동화의 비용 이점은 개별 제조 공정에 따라 달라질 수 있음을 시사합니다.

자동화를 기존 제조 공정에 도입할 수 있는 여러 가지 전략이 있습니다. 이는 완전히 통합된 플랫폼 또는 모듈식 기반 처리 체인을 구현하여 달성할 수 있습니다. CliniMACS 프로디지(밀텐이 바이오텍), 코쿤(옥탄 생명공학), 퀀텀(테루모 BCT)과 같은 자가 세포 제조에 상용화된 여러 완전히 통합된 플랫폼이 있습니다. “GMP-in-a-box”라고도 하는 이러한 통합 플랫폼은 인프라에 대한 요구가 적고 운영이 용이합니다. 그러나, 완전히 통합된 설치의 제조 능력은 시스템에 부착된 인큐베이터에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 신동체의 배양 능력은 400 mL 챔버8로 제한되고 양자 카트리지는 2.1m2(120 T175 플라스크에 해당)로 설정된 제한표면적을 가지며, 이는 더 높은 세포 용량을 필요로 하는 환자에게 는9,10. 추가적으로, 신동 및 양자는 그들의 사용을 제한하는 공통 특성을 갖는다: 작동 단위는 세포 확장 기간 내내 세포의 단일 배치에 의해 점유되고, 따라서 각단위(11)에의해 제조될 수 있는 배치의 수를 제한한다. 자동화에 대한 모듈식 접근 방식은 상용 제조 공정12,13을시뮬레이션하는 여러 모듈형 단위로 제조 체인을 만드는 것입니다. 이러한 접근법은 배양 장치를 셀 세척 장치로부터 분리하여, 제조 효율을 극대화할 수 있다. 이상적인 가공 장치는12의제조 요구에 적응하고 확장 할 수있는 장치일 것입니다.

1970년대로 거슬러 올라가는 카운터플로우 원심분리(CFC) 기술은 세포 처리14에서오랜 역사를 가지고 있습니다. 원심력과 역류력의 균형을 맞추어 세포 농도와 분리를 달성합니다. 전형적으로, 세포 현탁액은 원심력을 행하면서 일정한 유량 하에서 셀 챔버의 좁은 말단으로부터 유입된다(도1A). 유체의 흐름은 원심력과 반대 방향으로 가해집니다. 이를 반류력이라고 하며, 이는 세포 챔버 내에서 그라데이션을 형성한다. 그런 다음 세포 챔버가 원뿔 모양 의 셀 챔버의 끝에서 멀리 넓어짐에 따라 카운터플로우력이 감소합니다. 밀도가 높고 직경이 큰 세포는 침전 속도가 더 높으며, 따라서 원뿔 모양의 세포 챔버의 끝을 향해 힘 평형에 도달합니다. 더 작은 입자는 챔버의 기지를 향해 평형에 도달하거나 챔버에 유지되기에는 너무 작을 수 있으며 멀리 씻겨질 것입니다. CFC 기술은 수지상 세포 치료법15,16에대한 단핵구를 분리하는 것과 같은 혈액 apheresis 제품 처리에 주로 응용되는 것으로 알려져 있다. 완충교환의 관점에서, CFC 기술은 대규모 제조17에만 적용되었으며, 자가 세포 치료의 소규모 제조에 아직 사용되지 않았습니다.

소규모 셀 제조에 적합한 장치의 필요성을 해결하기 위해 자동화된 CFC 장치(재료 표참조)가 최근18개개발되었습니다. 자동화된 셀 처리 장치는 역류 원심분리 기술을 사용하여 세포 이물질을 제거하고 버퍼 교환을 용이하게 합니다. 이 장치는 세포 전달 백에 멸균될 수 있는 일회용 키트로 버퍼 교환을 수행하여 세포를 멸균된 밀폐된 시스템 내에서 처리할 수 있습니다. 여기서, 우리는 자동화된 프로토콜에서 포유류 세포 배양물에서 완충교환을 수행하기 위해 역류 원심 장치의 사용을 조사한다. 이 연구에서는, 우리는 각각 비부착 및 부착 세포 모형을 모델링하기 위하여 Jurkat 세포 및 중간엽 기질 세포 (중간엽 기질 세포)를 사용하여 완충교환 프로토콜을 시험했습니다. Jurkat 세포는 급성 T 세포 백혈병19,20의연구에 자주 사용되는 불멸의 T 세포이다. 중msC는 광범위한 질병에 대한 인체 임상 시험에서 연구된 성인용줄기세포9.

Protocol

1. 버퍼 교환을위한 시약 및 셀 의 준비 클래스 2 층류 흐름 후드에서 버퍼 준비(재료 표참조). 주사기와 바늘 조립체를 사용하여 500 mL 식염수 백에서 식염수 50mL를 제거합니다. 이를 50 mL의 20% 인간 혈청 알부민(HSA)으로 대체하여 식염수로 2% HSA를 만들어 세척 완충제 역할을 합니다. 배양 혈관으로부터 세포를 제거하고 세포 수를 수행하여 트라이판 블루 배제에 의한 시?…

Representative Results

이 프로토콜에서는 Jurkat 셀과 MSC를 대표적인 예로 사용하여 자동화된 버퍼 교환 프로세스를 시연했습니다. 이 과정에서 Jurkat 셀과 MCS는 유속을 제어하는 원심력과 펌프 속도의 차이로 동일한 처리 단계를 공유했습니다(표1). 도 2는 완충교환 과정에서 유동화된 셀 베드가 어떻게 나타날 수 있는지에 대해 카메라에 의해 포착된 대표적인 이미지를 나타낸다. 일반…

Discussion

설명된 자동화된 버퍼 교환 프로토콜은 간단하고 사용자 친화적입니다. 그럼에도 불구하고 이 프로토콜에는 중요하고 특별한 주의가 필요한 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 우리의 경험에서, MCS와 같은 더 큰 세포를 가공할 때 (평균 직경 10-15 μm) 각 실행은 최적 세포 회수를 달성하기 위하여 적어도 1 x 107 셀을 포함해야 합니다(그림 4B). Jurkat 세포 (평균…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램과 경제 개발, 일자리, 운송 및 자원부에서 제공하는 빅토리아 정부 기술 바우처에 의해 지원됩니다. RL은 국가 보건 및 의학 연구 위원회 경력 개발 펠로우십의 수혜자입니다. AL은 호주 대학원 상을 받는 사람입니다.

Materials

20 ml Luer lock syringes BD 302830
20% Human serum albumin (HSA) CSL Behring AUST R 46283
4-(Dimethylamino)benzaldehyde Sigma-Aldrich 156477-25g
500ml IV saline bag Fresenius Kabi K690521
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240112
Automated cell counter (Countess) Thermo Fisher Scientific N/A
Cell counting chamber slides Thermo Fisher Scientific C10228
Cell stimulation cocktail (500x) Thermo Fisher Scientific 00-4970-93
Cell transfer bags Terumo T1BBT060CBB
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G3582
Centrifuge Eppendorf 5810R
DMEM: F12 media Thermo Fisher Scientific 11320082
EnVision plate Reader Perkin Elmer N/A
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 10099141
Human Interleukin 2 (IL2) Kit Perkin Elmer Al221C
Luer (female) fittings CPC LF41
PC laptop or PC tablet device ASUS N/A
Plate reader (SpectraMax i3) Molecular Device N/A
Recombinant Human IFN-γ PeproTech 300-02
Rotea counterflow centrifuge cell processing device Scinogy N/A
Rotea single-use processing kit Scinogy N/A
RPMI media Thermo Fisher Scientific 11875119
Surgical scissors ProSciTech 420SS
Trichloroacetic acide Sigma-Aldrich T6399-250g
Trypan Blue stain Thermo Fisher Scientific T10282
Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) Thermo Fisher Scientific 12604013

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Li, A., Wilson, S., Fitzpatrick, I., Barabadi, M., Chan, S. T., Krause, M., Kusuma, G. D., James, D., Lim, R. Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing. J. Vis. Exp. (154), e60423, doi:10.3791/60423 (2019).

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