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Biochemistry

用于大规模核相互作用分析的无标签免疫沉淀质谱工作流程

Published: November 17, 2019 doi: 10.3791/60432

Summary

描述是一种蛋白质组学工作流程,用于利用感兴趣的特定蛋白质和无标签质谱的免疫亲和力来识别来自核亚细胞部分的蛋白质相互作用伙伴。该工作流程包括亚细胞分馏、免疫沉淀、过滤器辅助样品制备、离线清理、质谱和下游生物信息学管道。

Abstract

免疫亲和力纯化质谱(IP-MS)已成为识别蛋白质-蛋白质相互作用的可靠定量方法。本出版物提供了一个完整的相互作用蛋白质组学工作流程,旨在识别来自细胞核的低丰度蛋白-蛋白质相互作用,这些相互作用也可以应用于其他亚细胞腔。此工作流程包括亚细胞分馏、免疫沉淀、样品制备、离线清理、单次无标签质谱以及下游计算分析和数据可视化。我们的方案经过优化,通过免疫沉淀内源蛋白,检测从整个细胞分解物(例如,细胞核中的转录因子相互作用)难以识别的分离、低丰度相互作用。分馏亚细胞腔。此处概述的样品制备管道为HeLa细胞核提取物的制备、内源诱饵蛋白的免疫亲和力纯化以及定量质谱分析提供了详细的说明。我们还讨论了在质谱基相互作用分析实验中进行大规模免疫沉淀的方法学考虑,并为评估数据质量提供指南,以区分真正的正蛋白非特定交互的交互。本文通过研究CMGC激酶DYRK1A的核相互作用体(一种低丰度蛋白激酶,在核内定义不良的相互作用)来证明这种方法。

Introduction

人类蛋白质组通过形成稳定的多亚单元复合物和瞬态蛋白-蛋白质相互作用,表现出巨大的结构和生化多样性。因此,在研究以解开分子机制时,通常需要识别感兴趣的蛋白质的相互作用伙伴。亲和纯化协议的最新进展和高分辨率快速扫描质谱仪器的出现,使蛋白质相互作用景观在单个无偏的实验中易于映射。

蛋白质相互作用协议通常采用具有亲和标记融合结构的异位表达系统来识别蛋白质相互作用,而无需高质量的抗体识别感兴趣的蛋白质1,2。但是,基于表位标记的方法有几个缺点。与表位的物理相互作用可能导致检测非特异性共纯蛋白3。此外,将这些表位标记融合到蛋白质的N-或C-端,可能会阻断原生蛋白-蛋白质的相互作用,或破坏蛋白质折叠,促进非生理性。此外,异位表达系统通常以超生理浓度过度表达诱饵蛋白,这可能导致伪性蛋白相互作用的识别,特别是对于剂量敏感基因5。为了规避这些问题,内源诱饵蛋白可以免疫沉淀,以及相关的相互作用的猎物蛋白,假设有一种高质量的抗体来识别本地蛋白质。

此处提供了一个相互作用蛋白质组学工作流程,用于以 CMGC 蛋白激酶 DYRK1A 为例,用于检测内源性蛋白质的核相互作用。破坏DYRK1A拷贝数、活动水平或表达会导致人类严重智力残疾,以及小鼠6、7、8、9胚胎杀伤力。DYRK1A具有动态时空调节10,并分门别类的蛋白质相互作用11,12,需要能够检测不同亚细胞室的低丰度相互作用伙伴的方法。

该协议利用人类HeLa细胞的细胞分馏成细胞胶和核质部分,免疫沉淀,质谱的样品制备,以及用于评估数据质量和可视化结果的生物信息管道概述,并提供用于分析和可视化的R脚本(图1)。此工作流中使用的蛋白质组学软件包均可免费下载或通过 Web 界面访问。有关软件和计算方法的更多信息,请参阅所提供的链接,提供深入教程和说明。

Protocol

注:表1概述了所有缓冲成分和蛋白酶混合物。

1. 细胞的制备

注:这种免疫沉淀质谱(IP-MS)方法需要每复制1~10毫克核莱沙的起始材料。在三联和三联控制中,1mg的核免疫沉淀将给予细胞量。

  1. 如果使用粘附细胞系,在收获前,每次复制3 x 15厘米的培养皿中,将细胞生长到90%的汇合度。
    注:建议对诱饵和控制条件至少执行三个复制免疫沉淀。该协议将假定使用"仅珠子"控件,该控件控制与珠子的大量非特定交互,从第 4 节开始。其他类型的控件可能很有用。讨论部分对此进行了深入描述。
    1. 用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤板2x,使用每15厘米板使用3mL0.25%的胰蛋白酶来胰蛋白化细胞。在1,200 x g下旋转细胞5分钟,并去皮素。
  2. 对于悬浮细胞,生长到类似的规模/密度,以达到70-80毫克的总蛋白质。
    1. 在1,200 x g和4°C下粒细胞5分钟。小心地将介质分给。
      注:在此步骤中可以组合小球,以便使用第 2 节中概述的大规模亚细胞分馏实现高效处理。
  3. 用PBS + 5 mM MgCl2补充蛋白酶抑制剂(PIs)和磷酸酶抑制剂(PhIs)洗涤细胞颗粒2x(见表1)。
    注:细胞颗粒可闪冻结在液氮中,并储存在-80°C,直到准备分馏。

2. 核提取物的制备

注:蛋白酶和磷酸酶抑制剂应在使用后30分钟内添加到分馏缓冲液中。

  1. 如果冷冻,在冷缓冲液 A + PI/PhIs 的 1x 颗粒体积中解冻细胞颗粒 15 分钟。将细胞颗粒放在4°C的螺母上,以帮助解冻时重新悬浮。否则,将细胞颗粒从步骤 1.3 重新悬浮到 1x 颗粒体积缓冲 A + API /PHI。
    1. 在2,000 x g和4°C下颗粒10分钟,使缓冲液分光。
  2. 用缓冲器 A 将包装的细胞体积的 5 倍悬浮细胞,并在冰上孵育 20 分钟。
  3. 在 2,000 x g和 4 °C 下,将缓冲液分10分钟,用2倍原装包装细胞体积缓冲器A+PI/PHIs重新悬浮,用"A"/松软的虫刺片进行7倍的悬浮。
  4. 在 2,000 x g和 4 °C 下使莱酸离心 10 分钟。
  5. 小心地移掉上清液,用液氮闪光冻结。将分乳酸储存在-80°C。此步骤的上清液是细胞亚细胞分数。
    注:在此步骤中,通过用液氮闪光冷冻并储存在-80°C,可以节省核颗粒
  6. 用 0.9x 缓冲液 B + PI/ PhI 的颗粒重新悬浮颗粒,并在 4°C 下在螺母上混合 5 分钟。
  7. 要使核被分出,用更紧的"B"发出20倍的刺。
  8. 在4°C下将核分糖在螺母上混合30分钟,使其均匀。
  9. 在4°C下在21,000 x g下将核莱沙离心30分钟。移液关闭上清液,并保存为可溶性核蛋白提取物。
    注:核酸酶处理产生的核颗粒允许恢复染色质相关的蛋白质部分。
  10. 在4°C下,将可溶性核提取物与缓冲C+PI进行3小时透析。
    1. 切割适当长度为 24 mm 宽度的透析管,切断 8 kDa 分子量。夹紧管的一侧,将核质加载到管中。装载液化液后,夹住另一端,然后浸入含有缓冲 C + API 的清洁玻璃容器中。
  11. 在4°C下将直径核提取物/核质在21,000 x g下离心30分钟。用于 IP-MS 分析的核提取物可以在液氮中进行无用和闪光冷冻,如果需要,可储存在-80°C。

3. 亚细胞分馏的验证

  1. 完成蛋白质测定以确定核莱沙酸的蛋白质浓度。双辛酸蛋白测定为下游应用提供了足够的灵敏度。
  2. 前所述,在SDS-PAGE凝胶上加载20μg的细胞和核馏分,用于西方斑点分析。加载时跳过通道,以避免样品的特性错误。
  3. 探测西方污点p84(THOC1)作为核标记,和GAPDH作为细胞体标记。根据核分数中的细胞标记的比例确定分馏范围,反之亦然。
    注:可以使用其他核和细胞标记的抗体。

4. 内源核饵蛋白的免疫沉淀

注: 建议从此时起使用低固定管。这将减少在样品处理过程中对管的非特异性结合,并避免不必要的样品损失。此外,确保 LCMS H2O 级用于为其余步骤准备缓冲区。

  1. 在微离心管中结合蛋白质-A和蛋白-G的12.5 μL珠体积,为每个复制制备蛋白质A/G珠混合物。将珠子储存为含有 20% 乙醇的浆料。使用在吸头上切开的移液器尖端确定浆料 %(v/v) 内的珠子浓度,并使用移液器吸头移液器,以确保珠子可以进入吸头。
  2. 用300μL的IP缓冲液1清洗蛋白质A/G珠混合物2x。在 4°C 下以 1,500 x g旋转珠子 1 分钟,并旋转缓冲液。
  3. 制备抗体蛋白A/G珠子:要将抗体与珠子结合,请加入300μL的IP缓冲液1和10μg所需的抗体。让珠子/抗体混合物在4°C的螺母上过夜。对于仅珠控制,不要添加任何抗体。
    注:每个复制总共10μg的抗体可以用作起点,但需要针对每个单独的抗体和实验中使用的解毒物的尺度进行精确优化
  4. 在水浴中将步骤2.10中的核液解冻,并将适当的体积与低保留微离心管中解冻,每次复制1mg蛋白质输入。
    1. 以16,000 x g旋转16,000 x g30分钟,并将上清液转移到新管中。
    2. 每1mg的核莱糖和在4°C的螺母上加入1μL的苯甲酸酶(250单位/μL),10~15分钟。
  5. 准备珠子,以预清除乳清。如步骤 4.1 中,将每个蛋白质 A 和蛋白质 G 珠的 12.5 μL 添加到 1.5 mL 低保留管中。用 IP 洗涤缓冲液 1 + API 清洗 2 次,并清除缓冲液。
  6. 从步骤4.5向珠子中加入1毫克的核莱沙。在 4°C 下在螺母上摇动 1 小时时孵育。
    1. 离心预清除在1,500 x g和4°C1分钟。
    2. 当核解液在步骤 4.5.1 中用珠子孵育时,用 IP 缓冲液 1 + PI 清洗抗体蛋白 A/G 珠 2x。在1,500 x g和4°C下离心1分钟,并去向缓冲液。
  7. 将预清除的核解结物从步骤4.6.1转移到抗体蛋白A/G珠子上。在4°C下摇动螺母时孵育4小时,在1,500 x g和4°C孵育1分钟后,离心。
  8. 将上清液转移到标记为每个复制的流通过管中。
  9. 用 1 mL 的 IP 缓冲液 2 + PI 清洗抗体蛋白 A/G 珠子。在1,500 x g和4°C下离心1分钟,去皮缓冲液,并重复共3倍。
  10. 与上一步一样,用 1 mL 的 IP 缓冲液 1+ PI 离心清洗珠子 2x。确保上次洗涤后清除所有缓冲液。
  11. 20 μL 的 2x 甘氨酸 (pH 2.75), 每次 30 分钟。使用洗脱缓冲液确保管在孵育过程中摇动。在750 x g和4°C下旋转1分钟,每孵育30分钟后移液器离开上清液。
    注:虽然此处描述的低pH甘氨酸方法使大多数诱饵蛋白洗脱,但一些抗体-抗原相互作用需要更严格的缓冲条件。
  12. 闪速冷冻在液氮中,储存在-80°C。

5. 样品制备

注:胰岛素插入免疫沉淀洗脱样品有助于在三氯乙酸(TCA)沉淀和样品处理期间恢复蛋白质,这对低丰度内源诱饵蛋白非常重要。

  1. 如果冷冻,在室温下解冻。
    1. 将样品放在冰上,每100μL的渗脂中加入10μL的1.0mg/mL胰岛素。涡旋,然后立即加入10μL的1%脱氧胆酸钠。再次涡旋样品,加入30μL的20%TCA,然后加入一个最终的涡旋。
    2. 在冰上孵育样品20分钟,然后在4°C下以21,000 x g离心30分钟。
    3. 吸出上清液,并加入0.5 mL的丙酮,丙酮已预冷却至-20°C。涡旋,然后在21,000 x g和4°C旋转30分钟。
    4. 吸气上清液,使留在管底部的颗粒干燥。
  2. 使用经过改进的过滤器辅助样品制备 (FASP) 方法准备质谱样本,该方法经过优化,可减少样品处理,如下所示14
    1. 用30 μL的SDS烷基化缓冲液从步骤5.1.4中重新悬浮蛋白质颗粒(见表1)。在 95°C 热块上孵育样品 5 分钟。在进行下一步之前,在室温下冷却 15 分钟。
    2. 在每个样品中加入 300 μL 的 UA 溶液和 30 μL 的 100 mM TCEP。将此解决方案加载到 30k 离心滤波器上。在室温下以 21,000 x g旋转离心滤波器 10 分钟。
      注:诱饵蛋白及其假定的相互作用者此时应绑定到过滤器。但是,如果过滤器出现问题,可以保留流。
    3. 用 250 μL UA 清洗过滤器,以 21,000 x g的离心机清洗 10 分钟。
    4. 用 100 mM Tris pH 8.5 的 100 μL 清洗过滤器,在 21,000 x g下将离心机清洗 10 分钟。
    5. 加入 3 μL 的 1 μg/μL Lys C 重新悬浮在 0.1 M Tris pH 8.5 中。将过滤器填充至 100 μL 标记,并在 37°C 下消化 1 小时,同时在螺母上摇动。
    6. 加入1 μL 1μg/μL MS级胰蛋白酶。轻轻混合,让胰蛋白酶在37°C下与样品一起孵育过夜,同时在螺母上摇动。
    7. 在 21,000 x g下离心 20 分钟,从过滤器中排出肽。
      注:可能需要多轮离心才能恢复所有埃卢特。如果这样做,有严重样品损失的可能性。
  3. 使用 C18 旋转柱对肽进行脱盐。遵循制造商提供的协议。
  4. 在7μL0.1%TFA中重新悬浮冻干肽,在5%醋酸酯中。将样品松点3分钟,以确保肽已被重新悬浮。以 14,000 x g下旋转 10 分钟。
  5. 将重新悬浮的肽转移到适当的样品小瓶中,以装载到液相色谱-质谱(LC/MS)系统中。

6. LC/MS 系统适用性

注:由于亲和纯化样品中蛋白质的量度较小,且一般含量较低,LC/MS 平台以最大的灵敏度和鲁棒性运行至关重要。

  1. 在移动A阶段将1mLLC/MS级酸添加到1L的LC/MS级水中,并将1mLLC/MS级酸添加到1升LC/MS级乙酰乙酰乙酸。
  2. 准备或安装 75 μm 熔融硅毛细管柱,内装 <2 μm 反向相 C18 树脂,长度为 ±250 mm。将样品直接注入列中,将获得最佳效果。
  3. 使用全新的移动相位清除超高性能液色谱 (UPLC) 系统。安装 C18 柱后,使用合适的发射器(即 20 μm id x 360 μm od 拉到 10 μm 尖端)建立稳定的流速和电喷。将柱保持在 40°C。C。
  4. 通过注入复杂的质量控制标准(如 HeLa 全细胞溶酶胰子板消化的 100–200ng),测试整体 LC/MS 系统性能。具有适合复杂样本的渐变(即 2⁄3 小时梯度洗脱时间)。建立肽和蛋白质鉴定的基线系统性能。
    注:为获得最佳效果,从 20,000-35,000 种独特肽中进行 3,000~5,000 或更多蛋白质鉴定,将为实验样品提供最佳性能。
  5. 对于常规LC/MS系统的适用性,注射100~200 fmol或更少的单一蛋白质消化标准,如牛血清白蛋白(BSA)。具有短梯度(即 20-30 分钟)的空值。
    注:多次注射蛋白质消化液将有助于建立基线LC/MS系统性能,每个IP-MS样品在每次IP-MS样品后重复注射,提供整个实验系统性能的测量,并允许检测仪器漂移,这可以偏置无标签实验。选定单个峰值强度和峰值形状的基线将通知 MS、LC 和列的性能。
  6. 为避免分析柱过载,将实验样品的一小部分(占总数的 15-30%)加载到基柱上,并使用适用于复杂样品的梯度(即 2⁄3 小时)进行分离。如果蛋白质鉴定的数量不能令人满意,则将所有样品加载到柱上。
  7. 在样品之间运行单一蛋白质消化标准,以监测LC/MS系统性能和样品结转。根据您的样品,可能需要多个标准来减少样品结转。

7. 数据处理

  1. 下载在https://www.maxquant.org/找到的蛋白质组学软件包 MaxQuant。
    注: 这将用于将步骤 6.6 中的 RAW MS 数据文件处理到蛋白质 ID、基因名称和定量值的数据表中,这些值与用于下游分析的标识相关联。
    1. 选择"原始数据"选项卡的"输入数据"子标题中的"加载"。打开存储 MS 原始文件的文件位置,并为每个 MS/MS 运行选择原始文件。
    2. 单击"特定于组"选项卡并选择"消化"。在酶列表中选择LysC并单击右箭头将此酶添加到将在搜索中使用的列表中。接下来,选择"乐器"并确保屏幕顶部的下拉列表中显示正确的仪器类型。将其他特定于组的搜索参数保留在标准设置上。
    3. 单击"全局参数"选项卡并选择"序列"。为将在此搜索中使用的分类添加相应的 FASTA 文件。如果不这样做,将不能正确分配肽。对于人类蛋白酶,从UniProthttps://www.uniprot.org/help/human_proteome下载FASTA文件。
    4. 在"全局参数"选项卡中,单击蛋白质量化。在"肽量化"下拉菜单中,选择"唯一+ 剃刀"。
      注:MaxQuant通过基于强度的绝对定量(iBAQ)和无标签定量(LFQ)提供蛋白质的替代定量。然而,肽计数信息足以进行本协议15中的下游分析。
    5. 在 MaxQuant 接口的左下角,选择要用于搜索的处理器数。这将直接影响运行所需的时间长度,因此请为此选择尽可能多的时间)。单击屏幕左下角的"开始"以开始运行。选择屏幕顶部的"性能"选项卡以查看搜索进度。
  2. 运行完成后,打开Perseus中的蛋白质组.txt文件,一个蛋白质组学计算平台,或其他电子表格程序来查看数据16。
    1. 使用 Perseus 去除常见污染物,并击中反向蛋白质序列。按照http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:use_cases:interactions的详细珀塞斯文档进行操作。
      注:在分析软件(例如Excel)中打开蛋白组.txt文件将自动损坏某些基因和蛋白质名称。
  3. 使用相关性净化污染物库 (CRAPome) 分析实验数据。http://crapome.org/在此存储库中注册一个帐户,并根据需要按照本教程进行操作17、18
    1. 使用在 CRAPome 主页上找到的"分析数据"工作流。选择对应于此交互实验中使用的亲和纯化系统的外部控件。
      注:这些控制可用于计算可用于检测常见污染物的第二次折数变化浓缩。
    2. 使用 Perseus 或合适的电子表格应用程序从 MaxQuant 的蛋白组.txt 输出生成输入文件。有关手动格式化的详细信息,请参阅http://crapome.org/?q=fileformatting。或者,使用提供的 R 脚本"export_CRAPomeSAINT_Input_File.R"生成 SAINT/CRAPome 输入文件。请参阅补充编码文件中的 README.txt 。
    3. 运行分析,以确定免疫沉淀中每个诱饵蛋白的折叠变化浓缩和SAINT(INTeractome显著性分析)概率。确保在 FC-A 下的下拉菜单中选择"用户控件",FC-B下拉列表中选择"CRAPome 控件"或"所有控件",并选择概率分数以生成 SAINT 概率。运行结束后,查看"分析结果"下的可用输出以及作业 ID。从"分析结果"下载数据矩阵,以便将来绘图和数据可视化。
  4. 通过遵循补充编码文件中提供的R-Scripts,将蛋白质作为FC-A(IP与用户控制)和SAINT概率的函数进行绘制。
    注: 提供一组 R 脚本,用于生成 FC-A vs. SAINT 概率和 iBAQ vs. log2(蛋白质丰度)的绘图,由从无标签强度的经验 Bayes 分析的调整后的 p 值范围着色。差分统计分析和绘图的详细信息在 README.txt 和 R 脚本"main_differential_analysis中找到。R"在补充编码文件中。
  5. 评估诱饵蛋白的已知相互作用蛋白按 FC-A 和 SAINT 排列的位置。在三脚架上进行单诱饵实验,截断 FC-A > 3.00 和 SAINT > 0.7 作为起点。
    注:选择"高置信度"交互和"低置信度"交互器的截止点时,必须根据生物信息进行通知。

8. 数据可视化

注: 有许多程序可以有效地可视化蛋白质组数据(例如,R、Perseus、Cytoscape、STRING-DB)。分析高置信度命中与这些交互器的功能丰富之间的连接性,对于确定命中优先级以便进一步验证和功能表征,可能是一个有用的策略。

  1. 下载Cytoscape,一个开源网络可视化工具https://cytoscape.org/download.html19
  2. 准备一个输入文件,作为一个选项卡分隔文件格式化与三列:诱饵(源节点),猎物(目标节点),交互类型(边缘类型)。这可以在 Perseus 或任何您选择的电子表格程序中完成。
  3. 从文件图标选择"导入表",朝向程序左上角(由向下箭头和图标中的矩阵指定)。Cytoscape 将自动将交互数据填充到网络中,以便进行自定义格式设置和设计。
  4. 选择 Cytoscape 控制面板上的"样式"选项卡,然后单击"Def"列中的方块以调整整个网络的属性。选择网络中的特定节点或边,然后选择样式菜单的Byp.列中的正方形以绕过默认设置并仅调整选定对象。或者,单击样式菜单顶部的下拉菜单以查看预设的网络格式。
    注:STRING-db蛋白-蛋白质相互作用数据此时可以手动通过输入文件或通过Cytoscape中的插件的各种扩充工具集成到该网络中,http://apps.cytoscape.org/20。推荐用于浓缩分析的细胞景插件在21http://apps.cytoscape.org/apps/cluego。
  5. 要增加对在此工作流中生成的数据集的信心,应执行以感兴趣的猎物蛋白为目标的对等 IP-MS 或 IP-西方实验。

Representative Results

在IP-MS实验中识别的大多数蛋白质质量由非特异性蛋白质组成。因此,IP-MS实验的关键挑战之一是解释哪些蛋白质是高置信的相互作用者,而非特异性的相互作用者。为了证明在数据质量评估中使用的关键参数,该研究利用仅珠控制从5mg的HeLa核提取物中分析了三倍免疫沉淀物。确保IP-MS实验可靠的第一个内部检查是诱饵蛋白是否属于通过控制折叠变化和SAINT概率识别的最高富集蛋白之一。在这种情况下,诱饵DYRK1A在对照上名列前三大富集蛋白(图2A,B)。在利用四个独立抗体对DYRK1A的核相互作用研究中,一个FC-A截止>3.00和SAINT概率截止>0.7为识别新奇和先前验证的相互作用体22提供了严格的截止。当应用于这个实验时,可以看到高置信的相互作用者和>95%的被鉴定为非特异性的共化蛋白之间的明显分离(图2A,B)。应用折叠变化扩充和概率阈值,通过要求生物复制中持续高富集蛋白 ID,可提高严格性。

除了统计评分,CRAPome分析工作流程还将以前报告的交互映射到诱饵猎物数据23。虽然此映射可用于阈值高置信度和低置信度交互,但以前报告的交互可能通过 FC-A 和 SAINT 概率得分较低,这可能表明给定诱饵的许多已知交互可能仅存在于特定的细胞类型、上下文或细胞器中。对于 DYRK1A 数据集示例,iREF 交互器 FC-A 值低至 0.45,表示对控制的极低扩充(图 2C)。为了避免误报的通货膨胀,统计阈值应优先于减少假负数的严格性。应该指出,这些相互作用的检测与蛋白质丰度无关(图2C)。HeLa细胞内每个iREF交互的计算绝对拷贝数显示,IP-MS24与交互伙伴的检测水平没有相关性。

Cytoscape是可视化多层交互数据的有效工具19。在下面描述的DYRK1A免疫沉淀实验中,FC-A > 3.0和SAINT > 0.9的组合使用将高置信力相互作用者列表减少到六种蛋白质(图2D)。然而,当单独应用 > 3.0 的 FC-A 截止时,向网络添加了八种额外的蛋白质。这些额外的蛋白质相互作用者与网络中已有的相互作用者具有高连接性,这表明它们具有类似的复合物或功能作用。为此,来自STRING-DB的蛋白质-蛋白质相互作用的证据被整合到这个网络作为蓝色虚线20。虽然这种单诱饵、三元实验提供了完整的 DYRK1A 交互网络的有限样本,但使用额外的诱饵、复制和集成大型公共数据集可用于扩展高置信度交互网络。因此,统计截止点将特定于每个单独的实验,需要进行彻底评估。

Figure 1
图1:亚细胞IP-MS的代表性蛋白质组学工作流程。细胞生长在4L圆底瓶或15厘米组织培养皿中,并同时收获,用于亚细胞分馏。细胞被分馏成细胞、核和核颗粒,免疫沉淀从1~10毫克的核解物中通过识别同一诱饵的一个或多个抗体进行。在单次拍摄质谱之前执行滤片辅助样品制备 (FASP) 和离线样品清理。下游计算管道用于将数据处理成可解释的交互数据。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:单诱饵单抗体IP-MS实验的代表性数据。A) 来自 CRAPome 分析工作流的 FC-A 和 SAINT 概率输出,用于使用单抗体进行激酶 DYRK1A (n = 3) 的最佳实验。仅珠子控件用于比较。红色实线表示在 FC-A > 3.00 和 SAINT > 0.7 处设置的截止点。(B) 最大昆特蛋白质丰度估计 (iBAQ) 输出与 log2 蛋白质丰度比在 DYRK1A IP 中进行控制,由调整的 p 值范围从无标签强度的经验贝叶斯分析进行着色。(C) FC-A 和在 iRef 数据库中列为相互作用蛋白的蛋白质的估计拷贝数23、24。(D) DYRK1A 相互作用者的细胞景网络可视化。蓝色节点 = FC-A > 3.00,SAINT > 0.7。橙色节点 = FC-A > 3.00。黑色边缘 – 在 IPMS 实验中被识别为相互作用者的蛋白质。蓝色虚线边缘 = 猎物蛋白之间的 SAINT 相互作用(置信力 > .150)。请点击此处查看此图的较大版本。

蛋白酶抑制剂(PI)混合物
试剂 最终浓度
甲苯钠 1 mM
本泽米丁 1 mM
二硫二醇 (DTT) 1 mM
苯甲烷硫磷化物(PMSF) 0.25 mM
磷酸酶抑制剂(PhI)混合物
试剂 最终浓度
微囊丁 LR 1 μM
正射钠 0.1 mM
氟化钠 5 mM
亚细胞分馏缓冲器:
缓冲 A pH 7.9
试剂 最终浓度
赫佩斯 10 mM
MgCl2 1.5 mM
氯化钾 10 mM
缓冲器 B pH 7.9
试剂 最终浓度
赫佩斯 20 mM
MgCl2 1.5 mM
Nacl 420 mM
乙烯二甲酸(EDTA) 0.4 mM
甘油 25% (v/v)
缓冲器 C pH 7.9
试剂 最终浓度
赫佩斯 20 mM
MgCl2 2 mM
氯化钾 100 mM
乙烯二甲酸(EDTA) 0.4 mM
甘油 20% (v/v)
免疫沉淀缓冲液:
IP 缓冲区 1
试剂 最终浓度
赫佩斯 20 mM
氯化钾 150 mM
Edta 0.1 mM
NP-40 0.1% (v/v)
甘油 10% (v/v)
IP 缓冲区 2
试剂 最终浓度
赫佩斯 20 mM
氯化钾 500 mM
Edta 0.1 mM
NP-40 0.1% (v/v)
甘油 10% (v/v)
SDS 烷基化缓冲液 pH 8.5
试剂 最终浓度
Sds 4%(v/v)
氯甲酰胺 40 mM
TCEP 10 mM
特里斯 100 mM
UA pH 8.5
试剂 最终浓度
尿素 8 M
特里斯 0.1 米
• 使用 HPLC 等级 H2O

表 1:缓冲区组合

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Discussion

此处概述的蛋白质组学工作流程为识别感兴趣的蛋白质的高可信度蛋白质相互作用器提供了一种有效的方法。这种方法通过亚细胞分数降低样品复杂性,并专注于通过强大的样品制备、离线样品清理和LC-MS系统的严格质量控制来增加识别相互作用伙伴。此处描述的下游数据分析允许对被确定为与诱饵共纯的蛋白质进行简单的统计评估。然而,由于大量的实验变量(规模、细胞系、抗体选择),每个实验都需要不同的截止点和关于数据可视化和扩充的考虑。

IP-MS 实验中的第一个设计考虑因素是选择抗体,这些抗体将用于与相互作用的伙伴一起共同纯化感兴趣的蛋白质。在过去几十年中,商业抗体的可得性已经扩大到覆盖了人类蛋白质体的较大部分,但仍有许多蛋白质的试剂有限。此外,在西方斑点检测等应用中经过验证的抗体可能无法在免疫沉淀实验中选择性地富集靶蛋白。在进行大规模相互作用蛋白质组学实验之前,建议从90%的10厘米培养皿或等效的细胞数中完成IP,并通过西方印迹探测感兴趣的靶蛋白。如果超过一种抗体可用于免疫沉淀,建议选择多种抗体,识别蛋白质不同部分的表皮。抗体与诱饵蛋白结合可以遮挡假定相互作用的伙伴所需的结合界面。选择诱饵蛋白的二次表位将增加基于质谱实验确定的相互作用特征的覆盖率。

第二个主要考虑因素是选择适当的控制,以区分高置信度相互作用和低置信度或非特定相互作用与被确定为与诱饵共纯的相互作用。对IP-MS实验最严格的控制是完成从诱饵的CRISPR KO细胞系的免疫沉淀。这种控制能够识别和过滤直接与抗体而不是诱饵蛋白结合的非特异性蛋白质。如果生成每个诱饵蛋白的CRISPR KO细胞系不可行,可以使用同一同样的诱饵抗体的IgG-珠子控制。在使用代表多个物种的抗体面板的实验中,只使用珠子控制是适当的,但会增加被确定为高置信的相互作用者的误报率。

IP-MS 实验中使用的细胞系的选择取决于几个关键因素。蛋白质表达和定位很大程度上取决于细胞类型。虽然RNA表达估计可以发现许多常用细胞系的大多数基因,但蛋白质表达与RNA表达的相关性较差,必须经实验确定。应避免以极低拷贝数表示诱饵蛋白的细胞系,以避免与可能需要的细胞培养量急剧增加相关的问题。然而,应该指出,样品制备可以针对极低丰度蛋白质的检测进行优化。过滤器辅助样品制备(FASP)方法虽然健壮,但可能导致样品中肽损失超过50%。单罐固相增强样品制备(SP3)是一种生成样品的有效方法,用于质谱分析,将样品损耗降至最低26。SP3 样品制备方法实现的增强的恢复性,可在此工作流程中用于定量接近检测极限的蛋白质。

这种蛋白质组学工作流程已应用于许多核诱饵,包括激酶、E3泛基蛋白气体和多亚单元复合物的脚手架成员。假设抗体试剂进行适当验证,成功执行此工作流程后,将检测感兴趣的蛋白质的高可信度蛋白质核相互作用伙伴。

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了琳达·克尼克唐氏综合症研究所向W.M.O.提供的"大挑战"赠款和DARPA合作协议13-34-RTA-FP-007的支持。我们要感谢杰西·库兰和基拉·科佐利诺在阅读和评论手稿方面的贡献。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA Thermo Fisher Scientific 25200056
1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes Fisher Scientific 02-681-320
4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561096
acetone (HPLC) Thermo Fisher Scientific A949SK-4
Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column Millipore Sigma UFC503096
Benzamidine Sigma-Aldrich 12072
benzonase Sigma-Aldrich E1014
Chloroacetamide Sigma-Aldrich C0267
Dialysis tubing closure Caroline Biological Supply Company 684239
DTT Sigma-Aldrich 10197777001
EDTA Sigma-Aldrich EDS
GAPDH antibody Santa Cruz Biotechnology Sc-47724
Glycerol Fisher Scientific 887845
Glycine Sigma-Aldrich G8898
HeLa QC tryptic digest Pierce 88329
HEPES Fisher Scientific AAJ1692630
insulin Thermo Fisher Scientific 12585014
iodoacetamide Sigma-Aldrich I1149
KONTES Dounce homogenizer 7 ml VWR KT885300-0007
Large Clearance pestle 7ml VWR KT885301-0007
Lysyl endopeptidase C VWR 125-05061
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich 208337
Microcystin enzo life sciences ALX-350-012-C100
Nonidet P 40 Substitute solution Sigma-Aldrich 98379
p84 antibody GeneTex GTX70220
Phosphate Buffered Saline
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227
Pierce BSA Protein Digest, MS grade Thermo Fisher Scientific 88341 LCMS QC
Pierce C18 spin columns Thermo Fisher Scientific PI-89873
Pierce Trypsin Protease, MS Grade Thermo Fisher Scientific 90057 For mass spectrometry sample prep
PMSF Sigma-Aldrich P7626
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P9541
Protein A Sepharose CL-4B GE Healthcare Bio-Sciences 17-0780-01
Protein G Sepharose 4 Fast Flow GE Healthcare Bio-Sciences 17-0618-01
SDS Sigma-Aldrich L3771
Silica emitter tip Pico TIP FS360-20-10
Small Clearance pestle 7ml VWR KT885302-0007
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich 201154
Sodium metabisulfite Sigma-Aldrich 31448
Sodium orthovanadate Sigma-Aldrich S6508
Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing Thomas Scientific 3787K17
TC Dish 150, Standard Sarstedt 83.3903 Tissue culture dish for adherent cells
TCA Sigma-Aldrich T9159
TCEP Thermo Scientific PG82080
TFA Thermo Fisher Scientific 28904
Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS Thermo Fisher Scientific
Trizma Base Sigma-Aldrich T6066
Urea Thermo Fisher Scientific 29700
Waters ACQUITY M-Class UPLC Waters
Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7µm Spherical Hybrid (1.7 µm, 75 µm x 250 mm) Waters 186007484 nanoflow C18 column

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References

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用于大规模核相互作用分析的无标签免疫沉淀质谱工作流程
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Guard, S. E., Ebmeier, C. C., Old, W. M. Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling. J. Vis. Exp. (153), e60432, doi:10.3791/60432 (2019).More

Guard, S. E., Ebmeier, C. C., Old, W. M. Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling. J. Vis. Exp. (153), e60432, doi:10.3791/60432 (2019).

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