Præsenteret her er en protokol for ikke-invasiv mesenchymal stamcelle (MSC) levering og sporing i en musemodel af traumatisk hjerneskade. Superparamagnetiske jernoxid nanopartikler er ansat som en MRI-sonde (magnetisk resonans imaging) til MSC-mærkning og ikke-invasiv in vivo-sporing efter intranasal levering ved hjælp af MRI i realtid.
Stamcelle-baserede terapier for hjerneskader, såsom traumatisk hjerneskade (TBI), er en lovende tilgang til kliniske forsøg. Tekniske forhindringer såsom invasiv celle levering og sporing med lav transplantations effektivitet er dog fortsat udfordringer i translationel Stam baseret behandling. Denne artikel beskriver en ny teknik til stamcelle mærkning og sporing baseret på mærkning af mesenchymal stamceller (MSCs) med superparamagnetiske jernoxid (SPIO) nanopartikler, samt intranasal levering af de mærkede MSCs. Disse nanopartikler er fluorescein isothiocyanat (FITC)-indlejret og sikkert at mærke MSCs, som efterfølgende leveres til hjernen af TBI-induceret mus ved intranasal rute. De spores derefter ikke-invasivt in vivo ved real-time magnetisk resonans imaging (MRI). Vigtige fordele ved denne teknik, der kombinerer SPIO for celle mærkning og intranasal levering omfatter (1) non-invasiv, in vivo MSC tracking efterleve ring for lange tracking perioder, (2) muligheden for flere doseringsregimer på grund af den ikke-invasive rute for MSC levering, og (3) mulige applikationer til mennesker, på grund af sikkerheden af SPIO, ikke-invasiv karakter af celle-tracking metode ved MRI, og administrationsvej.
Mesenchymal stamceller (MSC) er attraktive kandidater til stamcelle-baserede terapier i behandlinger af centralnervesystemet (CNS) lidelser og skader hos mennesker. Desuden har MSCS været anvendt som et middel til levering af terapeutiske proteiner på skades områder1,2. I de seneste år, lovende innovationer er blevet udviklet til at etablere 1) nye ruter af celle levering og 2) celle sporing for stamcelle-baserede behandlinger af CNS lidelser. Den intranasale levering af stamceller i hjernen afhænger af cellernes evne til at omgå cribriform pladen og ind i olfaktoriske pære delvist via en parentchymal rute3. Kombinationen af intranasal levering og mærkning af MSCS med superparamagnetiske jernoxid (spio) nanopartikler repræsenterer en lovende tilgang til kliniske anvendelser af MSCS i behandling af CNS-lidelser, da spio nanopartikler er sikre sonder for magnetisk resonans imaging (MRI) og tillader ikke-invasiv følsom langsgående sporing af MSCS efterleve ring af MRI3,4,5. Desuden er intranasal levering en sikker og ikke-invasiv rute, der giver mulighed for gentagen administration inden for en kort tidsperiode.
Denne artikel beskriver en meget følsom og ikke-invasiv teknik til sporing af MSCs in vivo post-intranasal levering i en musemodel af traumatisk hjerneskade (TBI), som beskæftiger SPIO-mærkede celler og MRI. En vigtig fordel ved SPIO-mærkningen er den følsomme påvisning af SPIO i vævet af MRI, hvilket gør det muligt at spore cellerne effektivt og ikke-invasivt. De SPIO nanopartikler, der anvendes her, er kommercielt tilgængelige og mærket med en fluorescein isothiocyanat (FITC) fluorophore, som giver mulighed for påvisning af SPIO i væv uden immun farvning eller yderligere behandling. Desuden er det muligt at udføre realtidssporing i længderetningen og undersøge biodistributionen af de leverede MSCs.
Den protokol, der er beskrevet her, repræsenterer generelle procedurer for SPIO-mærkningen af MSCs og MRI-sporing af SPIO-mærket MSCs post-intranasal levering. Protokollen giver mulighed for at studere migration og Biodistribution af MSCs efterleve ring in vivo i hjernen, ved hjælp af en ikke-invasiv metode.
MSCS er attraktive kandidater til stamcelle-baserede terapier for CNS lidelser og skader på grund af deres evne til at udskiller trofiske faktorer, der 1) udløser neurorestorative processer og 2) give neuroprotection, på grund af deres anti-inflammatoriske virkninger inden for skadeområde9,10,11,12. Selv om langsigtet MRI-sporing og detektion af SPIO-mærkede MSCs kan være begrænset på grund af fortynding af intercellulære SPIO med celledeling, kan mærkede celler påvises i op til flere uger efter transplantation i hjernen af dyremodeller13.
Også beskrevet her er mærknings protokollen for MSCS med spio nanopartikler belagt med dextran uden transfektering agenter. Andre protokoller er blevet anvendt i litteraturen14,15,16. I alle tilfælde bør disse protokoller dog justeres for celletype, SPIO-størrelse, inkubationstid og SPIO-koncentration. MSCS har vist sig at have nedsat chondrogenic differentiering potentiale, men ikke adipogenisk differentiering på spio mærkning17. Derfor anbefales det stærkt, at differentierings assays udføres før stamcelle levering for at evaluere SPIO’S indflydelse på stamcellernes differentierings styrke. I en tidligere undersøgelse, det blev påvist, at MSC mærkning med samme spio type og koncentration, der anvendes i her ikke påvirkede osteogen eller adipogenisk differentiering styrken af MSCS6.
Den intranasale vej af terapeutisk stamcelle levering for hjernen lidelser og skader er en lovende tilgang til den kliniske anvendelse af stamceller. Men de iboende og molekylære mekanismer, der dikterer opførsel af stamceller i næsehulen forbliver uklare. Selv om den intranasale rute er bredt udforsket for levering af små molekyler, er størrelsen og Biodistribution opførsel af den terapeutiske stamme adskiller sig fra små molekyler. Den nuværende protokol viser, at MSCs har tendens til at migrere mod skadestedet efter intranasal levering.
Her blev der brugt T2 *-vægtede billeder til at spore de SPIO-mærkede MSCs. Andre rapporter har brugt gradient ECHO Imaging. Men, følsomhed artefakter er ofte observeret i gradient ekko Imaging på grund af intercellulære SPIO. I den nuværende protokol var placeringen af de hypoinspændte områder, der repræsenterede de SPIO-mærkede MSCs på T2 *-vægtede billeder, den samme som placeringen af SPIO i hjerne sektioner som påvist ved histologisk undersøgelse (figur 3). Dette indikerer den passende følsomhed af T2 *-vægtet spin ECHO Imaging for SPIO-mærket MSC tracking i hjernen.
Sammenfattende er den beskrevne protokol gavnlig for in vivo stamcelle tracking undersøgelser af hjerneskader og lidelser. Den langsgående sporing af stamceller in vivo er traditionelt blevet udført ved at ofre dyr på flere tidspunkter. Den nuværende protokol giver en ikke-invasiv og effektiv tilgang til MSCs levering og sporing, som repræsenterer en potentiel procedure for stamcelle-baserede terapi for hjerneskader og lidelser i kliniske miljøer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for videnskab og teknologi tilskud, Taiwan (de fleste 104-2923-B-038-004-MY2, de fleste 107-2314-B-038-063, og de fleste 107-2314-B-038-042) og Taipei Medical University (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-400, TMU 106-5310-001-400, DP2-107-21121 -01-N-05 og DP2-108-21121 -01-N-05-01).
Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
D-MEM/F-12 (1X) with GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | |
Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | 12662-029 | |
Fluorescence Wild Field Microscope | Olympus | Olympus BX43 | |
Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
Gentamicin (10 mg/mL) | GIBCO | 15710-064 | |
Hair clipper | Pet Club | PC-400 | |
Head Trauma Contusion device | Precision Systems and Instrumentation | Model TBI-0310 | |
Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 | |
ITK-SNAP Software | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah | ITK-SNAP 3.8.0 | |
Ketamine (Ketavet) | Pfizer | 778-551 | |
Mice | National Laboratory Animal Center, Taiwan | C57BL6 | Wild type mice strain used in the study |
Microdrill | Nakanishi | NE50 | Combine with Burrs for generating the bone window |
Microtome | Leica | RM2265 | |
Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells | GIBCO | S1502-100 | |
MRI scanner | Bruker Biospec | ||
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
Prussian Blue Stain | Abcam | ab150674 | |
Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles | BioPAL | Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51 | stem cells labeling for in vivo tracking using MRI |
Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
Timer | Wisewind | Replaceable with any source | |
TrypLE | GIBCO | 12604-013 | |
Xylazine (Rompun) | Bayer | QN05 cm92 |