Burada sunulan non-invaziv mezenkimal kök hücre için bir protokol (MSC) teslim ve travmatik beyin hasarı bir fare modeli nde izleme. Süperparamanyetik demir oksit nano partikülleri, msc etiketlemesi için manyetik rezonans görüntüleme (MRG) prob ve gerçek zamanlı MRG kullanılarak intranazal doğumdan sonra invaziv in vivo izleme için non-invaziv in vivo izleme olarak kullanılır.
Travmatik beyin hasarı (TBI) gibi beyin yaralanmaları için kök hücre bazlı tedaviler klinik çalışmalar için umut verici bir yaklaşımdır. Ancak, invaziv hücre iletimi ve düşük transplantasyon verimliliği ile izleme gibi teknik engeller, çevirisel kök tabanlı tedavide zorluklar olmaya devam etmektedir. Bu makalede, süperparamanyetik demir oksit (SPIO) nano partikülleri ile mezenkimal kök hücrelerin (MSCs) etiketleme dayalı kök hücre etiketleme ve izleme için ortaya çıkan bir teknik açıklanmıştır, yanı sıra etiketli MSCs intranazal teslim. Bu nano tanecikleri floresan izotiyoyanat (FITC) gömülü ve güvenli MSCs etiketlemek için, daha sonra intranazal rota ile TBI kaynaklı farelerin beyinteslim edilir. Daha sonra gerçek zamanlı manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ile non-invaziv in vivo izlenir. Hücre etiketlemesi ve intranazal doğum için SPIO’yu birleştiren bu tekniğin önemli avantajları arasında (1) non-invaziv, uzun takip sürelerinde doğumdan sonra in vivo MSC takibi, (2) non-invaziv nedeniyle birden fazla dosing rejimi olasılığı MSC teslimat yolu ve (3) insanlar için olası uygulamalar, SPIO güvenliği nedeniyle, MRG ile hücre izleme yönteminin non-invaziv doğası, ve yönetim yolu.
Mezenkimal kök hücreler (MSC) insanlarda merkezi sinir sistemi (CNS) bozuklukları ve yaralanmalarının tedavisinde kök hücre bazlı tedaviler için cazip adaylardır. Ayrıca, MSCs yaralanma sitelerinde terapötik proteinlerin teslimi için bir araç olarak kullanılmıştır1,2. Son yıllarda, cns bozukluklarının kök hücre temelli tedavileri için 1) hücre tesliminin yeni yollarını ve 2) hücre takibini sağlamak için umut verici yenilikler geliştirilmiştir. Kök hücrelerin beyne intranazal olarak verilmesi, hücrelerin kribriform plakayı atlayıp parenkim yolu üzerinden kısmen koku alma ampulüne girme yeteneğine bağlıdır3. Spio nano partikülleri manyetik rezonans görüntüleme (MRG) için güvenli problar olduğundan ve MRI3,4,5tarafından MSC’lerin non-invaziv hassas uzunlamasına izleme izin, intranazal doğum ve süperparamanyetik demir oksit (SPIO) nano tanecikleri ile MSCs etiketleme kombinasyonu, CNS bozukluklarının tedavisinde MSCs klinik uygulamalar için umut verici bir yaklaşım temsil eder . Ayrıca intranazal doğum, kısa bir süre içinde tekrarlanan bir uygulama sağlayan güvenli ve non-invaziv bir yoldur.
Bu makalede, SPIO etiketli hücreler ve MRG kullanan travmatik beyin hasarı (TBI) bir fare modelinde vivo post-intranazal doğumda MSC’leri izlemek için son derece hassas ve non-invaziv bir teknik açıklanmaktadır. SPIO etiketlemenin önemli bir avantajı da, hücrelerin etkin ve non-invaziv olarak izlenmesini mümkün kılan, MRG ile dokudaki SPIO’nun hassas tespitidir. Burada kullanılan SPIO nano tanecikleri ticari olarak mevcuttur ve bir floresan izotiyoyanat ile etiketlenmiş (FITC) florofor, hangi immünboyama veya ek işleme olmadan dokuda SPIO tespiti için izin verir. Ayrıca, uzunlamasına gerçek zamanlı izleme yapmak ve teslim MSCs biyodağılımı araştırmak mümkündür.
Burada açıklanan protokol, MSC’lerin SPIO etiketlemesi ve SPIO etiketli MSC’lerin intranazal sonrası doğumun MRI takibi için genel prosedürleri temsil eder. Protokol, non-invaziv bir yöntem kullanarak beyinde in vivo in-in-in MSC’lerin göç ve biyodağıtım çalışma fırsatı sağlar.
MsCs CNS bozuklukları ve yaralanmalar için kök hücre tabanlı tedaviler için cazip adaylar nedeniyle trofik faktörleri salgılama yeteneği nedeniyle 1) nörorestoratif süreçleri tetiklemek ve 2) nörokoruma sağlamak, yaralanma alanı içinde anti-inflamatuar etkileri nedeniyle9,10,11,12. SPIO etiketli MSC’lerin uzun süreli MRG takibi ve saptanması hücre bölünmesi ile hücreler arası SPIO seyreltilmesi nedeniyle sınırlı olsa da, etiketli hücreler hayvan modellerinin beyinlerinde transplantasyon sonrası birkaç haftaya kadar tespit edilebilir13.
Ayrıca burada transfeksiyon ajanları olmadan dextran ile kaplanmış SPIO nano tanecikleri ile MSCs etiketleme protokolü açıklanmıştır. Diğer protokoller literatürde kullanılmıştır14,15,16. Ancak, her durumda, bu protokoller hücre tipi, SPIO boyutu, kuluçka süresi ve SPIO konsantrasyonu için ayarlanmalıdır. MSC’lerin kondrojenik farklılaşma potansiyelini bozmuş olduğu, ancak SPIO etiketlemesi üzerine adipojenik farklılaşma olmadığı gösterilmiştir17. Bu nedenle SPIO’nun kök hücrelerin farklılaşma gücü üzerindeki etkisini değerlendirmek için kök hücre dağıtımından önce farklılaşma tözlerinin yapılması tavsiye edilir. Bir önceki çalışmada, burada kullanılan aynı SPIO tipi ve konsantrasyonu ile MSC etiketleme mscs osteojenik veya adipojenik farklılaşma potens etkilemediği gösterilmiştir6.
Beyin bozuklukları ve yaralanmalar için terapötik kök hücre tesliminin intranazal yolu kök hücrelerin klinik uygulaması için umut verici bir yaklaşımdır. Ancak, burun boşluğundaki kök hücrelerin davranışlarını belirleyen içsel ve moleküler mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. İntranazal yol küçük moleküllerin teslimi için yaygın olarak araştırılsa da, terapötik sapın büyüklüğü ve biyodağılım davranışı küçük moleküllerden farklıdır. Mevcut protokol, MSC’lerin intranazal doğumdan sonra yaralanma bölgesine doğru göç etme eğiliminde olduğunu göstermektedir.
Burada, SPIO etiketli MSC’leri izlemek için T2*ağırlıklı görüntüler kullanılmıştır. Diğer raporlarde degrade yankı görüntüleme kullanılmıştır. Ancak, septiyer SPIO nedeniyle gradyan eko görüntülemede genellikle duyarlılık görülür. Mevcut protokolde, T2*ağırlıklı görüntülerde SPIO etiketli MSC’leri temsil eden hipoyoğun alanların konumu histolojik inceleme ile saptanan beyin kesitlerinde SPIO’nun konumuyla aynıydı(Şekil 3). Bu, beyindeki SPIO etiketli MSC takibi için T2*ağırlıklı spin eko görüntülemenin yeterli hassasiyetini gösterir.
Özetle, açıklanan protokol beyin yaralanmaları ve bozukluklarının in vivo kök hücre takibi çalışmaları için yararlıdır. In vivo kök hücrelerinin uzunlamasına takibi geleneksel olarak hayvanların birden fazla zaman noktasında kurban edilerek gerçekleştirilmiştir. Mevcut protokol, klinik ortamlarda beyin yaralanmaları ve bozuklukları için kök hücre tabanlı tedavi için potansiyel bir prosedürü temsil eden MSC’lerin doğum ve takibi için non-invaziv ve verimli bir yaklaşım sağlamaktadır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı hibe, tarafından desteklenmiştir Tayvan (EN FAZLA 104-2923-B-038-004 -MY2, EN 107-2314-B-038-063 ve MOST 107-2314-B-038-042) ve Taipei Tıp Üniversitesi (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-T04, 400 106-5310-001-400, DP2-107-21121-01-N-05 ve DP2-108-21121-01-N-05-01).
Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
D-MEM/F-12 (1X) with GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | |
Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | 12662-029 | |
Fluorescence Wild Field Microscope | Olympus | Olympus BX43 | |
Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
Gentamicin (10 mg/mL) | GIBCO | 15710-064 | |
Hair clipper | Pet Club | PC-400 | |
Head Trauma Contusion device | Precision Systems and Instrumentation | Model TBI-0310 | |
Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 | |
ITK-SNAP Software | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah | ITK-SNAP 3.8.0 | |
Ketamine (Ketavet) | Pfizer | 778-551 | |
Mice | National Laboratory Animal Center, Taiwan | C57BL6 | Wild type mice strain used in the study |
Microdrill | Nakanishi | NE50 | Combine with Burrs for generating the bone window |
Microtome | Leica | RM2265 | |
Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells | GIBCO | S1502-100 | |
MRI scanner | Bruker Biospec | ||
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
Prussian Blue Stain | Abcam | ab150674 | |
Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles | BioPAL | Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51 | stem cells labeling for in vivo tracking using MRI |
Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
Timer | Wisewind | Replaceable with any source | |
TrypLE | GIBCO | 12604-013 | |
Xylazine (Rompun) | Bayer | QN05 cm92 |