Summary
يقدم هنا بروتوكول لتسليم الخلايا الجذعية غير الغازية (MSC) وتتبع في نموذج الماوس من إصابات الدماغ الرضية. وتستخدم جسيمات نانويه أكسيد الحديد فائقه المغناطيسية كالتصوير بالرنين المغنطيسي (MRI) التحقيق لوضع العلامات MSC وغير الغازية في تتبع الجسم المجري بعد تسليم الأنف باستخدام الرنين المغناطيسي في الوقت الحقيقي.
Abstract
تعد العلاجات القائمة علي الخلايا الجذعية لإصابات المخ ، مثل إصابات الدماغ الرضية ، نهجا واعدا للتجارب السريرية. ومع ذلك ، تبقي العقبات التقنية مثل تسليم الخلايا الغازية وتتبع مع كفاءه زرع منخفضه التحديات في العلاج القائم علي الجذعية الانتقالية. توضح هذه المقالة تقنيه الناشئة لوضع العلامات الخلية الجذعية وتتبع استنادا إلى وضع العلامات علي الخلايا الجذعية المسمارية (MSCs) مع أكسيد الحديد المغناطيسي الفائق (SPIO) جسيمات نانويه ، فضلا عن تسليم الأنف من MSCs المسمية. هذه الجسيمات النانويه هي فلوريسئين ايزوثيسيانات (FITC)-جزءا لا يتجزا من وأمنه لتسميه MSCs ، والتي يتم تسليمها في وقت لاحق إلى أدمغه الفئران التي يسببها الدماغ عن طريق الأنف. ثم يتم تعقبها غير اينفاسيفيلي في الجسم الفعلي عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي في الوقت الحقيقي (MRI). وتشمل المزايا الهامه لهذه التقنية التي تجمع بين SPIO لوضع العلامات الخلية والتسليم في الأنف (1) غير الغازية ، في الجسم البحري تتبع MSC بعد التسليم لفترات طويلة تتبع ، (2) امكانيه أنظمه الجرعات متعددة بسبب غير الغازية طريق التسليم MSC ، و (3) التطبيقات الممكنة للبشر ، وذلك بسبب سلامه SPIO ، والطبيعة غير الغازية لطريقه تتبع الخلية عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي ، ومسار الاداره.
Introduction
الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) هي المرشحين جذابة للعلاجات القائمة علي الخلايا الجذعية في علاج اضطرابات الجهاز العصبي المركزي (CNS) والإصابات في البشر. وعلاوة علي ذلك ، استخدمت mscs كوسيلة لتسليم البروتينات العلاجية في مواقع الإصابات1،2. في السنوات الاخيره ، تم تطوير ابتكارات واعده لإنشاء 1) طرق جديده لتوصيل الخلايا و 2) تتبع الخلايا لعلاجات الخلايا الجذعية للاضطرابات العصبية. ويتوقف توصيل الخلايا الجذعية داخل المخ علي قدره الخلايا علي تجاوز الصفيحة المعدنية وإدخال اللمبة الشميه جزئيا عن طريق الطريقالثالث. وعلاوة علي ذلك ، فان توصيل الأنف بالأنف هو طريق أمن وغير غازي يسمح بالاداره المتكررة في غضون فتره قصيرة من الزمن.
توضح هذه المقالة تقنيه حساسة للغاية وغير الغازية لتعقب MSCs في الجسم المجري بعد الولادة في نموذج الماوس من إصابات الدماغ الرضية (الاصابه) ، التي توظف الخلايا المسمية SPIO والتصوير بالرنين المغناطيسي. ميزه واحده هامه من الوسم SPIO هو الكشف الحساسة من SPIO في الانسجه عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي ، مما يجعل من الممكن لتتبع الخلايا بكفاءة وغير اينفاسيفيلي. والجسيمات النانويه SPIO المستخدمة هنا متاحه تجاريا والموسومة مع فلوريسئين ايزوكلوروسيانات (FITC) فلوكوفيري, الذي يسمح للكشف عن SPIO في الانسجه دون المناعي أو معالجه اضافيه. وعلاوة علي ذلك ، فمن الممكن لأداء التتبع في الوقت الحقيقي الطولي والتحقيق في التوزيع الحيوي لل MSCs تسليمها.
Protocol
تمت الموافقة علي جميع الإجراءات المتعلقة بالماشية في هذا البروتوكول من قبل لجنه الرعاية المؤسسية للحيوانات والاستخدام ، بموافقه لجنه الأخلاق للاستخدام الحيواني في جامعه تايبيه الطبية (الموافقة رقم. LAC-2018-0574; 15.03.2019).
1. وضع العلامات MSCs مع جسيمات نانويه SPIO
- لتسميه MSCs مع SPIO ، أضافه 6 مل من وسائل الاعلام الوسم (25 ميكروغرام/مل من SPIO في المتوسطة النسر المعدلة دولبيكو [DMEM] مع عدم وجود مصل الأبقار الجنينية [المتحف]) إلى قارورة T75 التي تحتوي علي MSCs (80 ٪ كونفلوينسي).
-
احتضان الخلايا مع وسائط الوسم في الحاضنة2 co (37 درجه مئوية ، 5 ٪ co2) دون اهتزاز. بعد 24 ساعة ، قم بازاله الوسائط الملصقة برفق باستخدام ماصه باستور معقمه مع طرف بلاستيكي ملحق بالفراغ. غسل الخلايا أحاديه الطبقة 2x مع 6 مل من الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني) لأزاله اي اثار من SPIO غير المستوعبة.
- لتحديد ما إذا كانت الخلايا المسمية بنجاح ، تحقق من الخلايا المسمية تحت المجهر الفلورسنت أو المجهر البؤري إذا تم الموسومة SPIO مع فلوكوفيري (اي ، مثل تلك المستخدمة هنا ؛ الشكل 1باء ، جيم). بدلا من ذلك ، أداء تلطيخ الأزرق البروسي للخلايا (انظر الخطوات 6.2-6.4 لبروتوكول تلطيخ).
- حصاد الخلايا الملتصقة عن طريق العلاج مع 3 مل من التريبسين واحتضان في 37 درجه مئوية. بعد 5 دقائق من الحضانة ، أضف 7 مل من وسائل الاعلام DMEM التي تم تسخينها مسبقا مع 10% من الوسائط (v/v) لتنشيط التريبسين. جمع تعليق الخلية باستخدام ماصه في أنبوب مخروطي 15 مل.
- نابذ تعليق الخلية في 300 x g لمده 5 دقيقه. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في الاذاعه التلفزيونية. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام الصبغة الزرقاء التريكان ومقياس الكريات الدموية.
ملاحظه: سوف تظهر الخلية بيليه من الخلايا المسمية كلون داكن بسبب تحميل الحديد (الشكل 1D). هذا البروتوكول هو ذات الصلة لوضع العلامات MSC والتصوير بالرنين المغناطيسي. وقد تم الأمثل مسبقا الاجراء لوضع العلامات MSC6 ، وفقط الخطوات اللازمة لاعداد المسمي mscs لتتبع في الجسم الذي يتم تضمينها هنا ، لأنه في تتبع المجري هو التركيز. وينبغي تحسين البروتوكول الخاص بالخياطة ووضع العلامات علي أنواع الخلايا الأخرى من قبل الباحث. - ضبط تركيز الخلية باستخدام خدمه تلفزيونيه إلى خلايا 150,000 (أو رقم الذي ينتج عنه اشاره التصوير بالرنين المغناطيسي كافيه) في 18 μL من تلفزيوني (أو الحجم الإجمالي الذي سيتم استخدامه في اجراء التسليم في الأنف).
ملاحظه: وقد لوحظ ان تركيز الخلية اعلي من 150,000 خلايا/18 μL من الخدمات التلفزيونية يؤدي إلى تراكم الخلايا ، والتي قد تؤثر علي كفاءه التسليم في الأنف. إذا كان هناك حاجه إلى عدد أكبر من الخلايا للتسليم في الأنف ، وزيادة الحجم الكلي لتعليق الخلية وزيادة عدد الإدارات الداخلية ، والأنف الاداره هو اجراء غير الغازية ، والجرعات المتعددة ممكن.
2. السيطرة علي تاثير القشرية (CCI) الاصابه
ملاحظه: في هذا البروتوكول ، تم الاحتفاظ الذكور C57 BL/6 الفئران (7-8 أسابيع من العمر) في دوره الضوء/الظلام 12/12 h مع الوصول إلى الطعام والماء الإعلان حسب.
- لاعداد كل الماوس للاصابه CCI ، وأداره زولازيبام (50 ملغ/كغ) و اكسيليازين (20 ملغ/كغ) تخدير كوكتيل عن طريق الحقن داخل الصفاق (i.p.) (1 مل/كغ). تاكد من ان عمق التخدير كافيه بسبب عدم وجود استجابه قرصه اصبع القدم. بدلا من ذلك ، ضع الماوس في غرفه الموردة مع 2 ٪-4 ٪ ايزوفلوراني ل 60 s.
- حلق الفراء من السطح الظهري من الجمجمة بين الاذنين باستخدام مقص الشعر الكترونيه. نظف المنطقة الحليقة عده مرات باستخدام مسحه قطنية معقمه منقوعه في اليود. استخدام مسحه القطن غارقه في الايثانول 70 ٪ لتنظيف قباله اليود.
- ضع الماوس التخدير في الإطار المجسم وأمن الماوس باستخدام قضبان الاذن وقضبان الأنف. اجراء شق ميدساجيتال (حوالي 2.5 سم) في الجلد حليق باستخدام مقص معقمه للوصول إلى سطح الجمجمة.
- أزاله الانسجه علي العظم باستخدام وساده من القطن للكشف عن الجمجمة. نظف سطح الجمجمة باستخدام مسحه قطنية منقوعه في 3%H 2O2 لمده 10 ثانيه ، ثم نظفها بوسادة قطنية جافه.
ملاحظه: يمكن الآن التعرف بسهوله علي غرز الجمجمة وكل من البرغما ولأمدا. - تحديد إحداثيات الاختيار علي سطح الجمجمة لأصابه CCI ورسم دائره (قطرها 4 ملم) حول الإحداثيات باستخدام قلم رصاص أو علامة السليم.
ملاحظه: في هذا البروتوكول ، تم استخدام الإحداثيات في انتيريبيوستيريور (AP)-2.0 mm والمقابل (ML) + 1.5 مم لاستقراء CCI. - استخدام المثقاب المجهري والجولة لدغ (0.5 ملم قطرها) لرقيقه الجمجمة في دائره ملحوظ. تجنب تطبيق الضغط اثناء الحفر ، كما الحفر من خلال العظام قد يسبب ضررا لل parenchyma الدماغ. نظف غبار العظام بعيدا باستخدام مسحه قطنية نظيفه وجافه.
- قم بازاله رفرف العظم برفق باستخدام ملقط ناعم معقم للكشف عن الام الجافية مع إبقائها سليمه. قم بازاله الماوس من الإطار المجسم الذي تم استخدامه لاعداد ما قبل الاصابه ووضعه في الإطار المجسم للجهاز CCI.
- تثبيت راس الماوس باستخدام قضبان الاذن وقضبان الأنف. تاكد من ان راس الماوس هو المستوي في اتجاه rostral-caudal وضبط قضبان الأنف ، إذا لزم الأمر.
- اتبع الإرشادات التي تظهر علي مربع التحكم إلى الصفر غيض المتهور إلى السطح القشرية المكشوفة. تاكد من محاذاة الطرف الفاعل مباشره فوق إحداثيات القشرة المطلوبة لتتاثر باستخدام عجلات التحكم X و Y علي قاعده الفاعل.
- تعيين معلمات التجربة باستخدام مربع التحكم مع سرعه 5 م/ث ، يسكن الوقت من 250 مللي ثانيه ، وعمق الاصابه من 1 ملم للحث علي أصابه خفيفه في الماوس.
- الحث علي الاصابه عن طريق الضغط علي زر "تاثير" علي مربع التحكم. امسح اي نزيف يحدث باستخدام مسحه قطنية معقمه.
- أزاله الماوس من الإطار المجسم وإغلاق الشق باستخدام الخيوط الجراحية الحريرية. لا تستخدم المشابك المعدنية لإغلاق الموقع الجراحي ، لان الفاره ستخضع لحقل مغناطيسي للتصوير بالرنين المغنطيسي.
- تطبيق المضادات الحيوية الموضعية (bacitracin نيوميسين) إلى موقع الجراحة لمنع العدوى. الحفاظ علي الماوس علي وساده التدفئة ورصد ذلك عن كثب خلال مرحله الانتعاش.
- أداره كيتوبروفين (2.5 مغ/كغ ، IP) يوميا لمده 3 أيام بعد الجراحة ، الا إذا كانت الاداره الكيتوبروفينه تتناقض مع أهداف الدراسة.
3. التوصيل الداخلية
- في 1 يوم بعد-CCI التعريفي, أداره زولازيبام (50 مغ/كغ) و اكسيليازين (20 مغ/كغ) تخدير كوكتيل عن طريق حقن i.p.. تاكد من ان الماوس هو تخدير عميق بسبب عدم وجود استجابه قرصه اصبع القدم.
-
اعداد الماوس لتسليم الأنف من MSCs بواسطة العلاج الهيلونيداز.
- الاستيلاء علي الراس الماوس وتشغيل ظهره بحزم في حين شل الجمجمة. ضع طرف الماصة الذي يحتوي علي حمض الهيالورونيك في الشريط المعقم (4 U/μL) بالقرب من منخر الفاره بزاوية 45 درجه.
- أداره 3 μL من التعليق الهيلونيداز في كل منخر. الحفاظ علي الماوس المعباه وتواجه التصاعدي علي وساده نظيفه لمده 5 دقائق. تكرار علاج حمض الهيالورونيك 4x (إجمالي 100 U حمض الهيالورونيك التعليق).
- بعد العلاج حمض الهيالورونيك ، والحفاظ علي الماوس المعالج علي وساده نظيفه مواجهه لمده 30 دقيقه.
- لتسليم MSCs في الدماغ ، وعقد الماوس بحزم ، كما هو موضح في الخطوة 1.2.3. أداره 3 μL/الأنف من تعليق MSC مع الفاصل الزمني 3 s. الحفاظ علي عقد الماوس في نفس الموقف لمده 30 ثانيه حتى قطرات عينه اختفت تماما.
ملاحظه: تجنب تشكيل فقاعات الهواء اثناء الاداره. - كرر الاداره مع الفاصل الزمني 2 دقيقه تصل إلى 3x.
ملاحظه: العدد الإجمالي للخلايا التي سيتم تسليمها هو 150,000 ، بحيث يمكن تسليم 18 μL من تعليق الخلية في جرعه 3 μL لكل منخر ، 3x لكل منهما. - أعاده الماوس إلى قفصها ومراقبتها عن كثب حتى يتعافى تماما من التخدير.
4. في فيفو التصوير بالرنين المغناطيسي
ملاحظه: وقد استخدمت في السابق تلطيخ النسيجية من انسجه المخ لتاكيد التسليم الناجح للخلايا الجذعية بعد العسل الاداره. ومع ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة فقط كنقطه نهاية للدراسة ، وليس طوليا. وباستخدام تحقيقات التصوير بالرنين المغناطيسي لتسميه الخلايا الجذعية العلاجية تسمح لطوليه ، غير الغازية ، في تتبع الجسم المجري للخلايا باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي. الأهم من ذلك ، هذا البروتوكول يقلل بكفاءة عدد الحيوانية المطلوبة. في هذا البروتوكول ، تم اجراء مسح التصوير بالرنين المغناطيسي في الأيام 1 و 7 و 14 بعد تسليم MSCs.
- لاعداد الماوس لمسح التصوير بالرنين المغناطيسي ، تخدير الماوس مع ايزوفلواني (5 ٪ ايزوفلوان في 1 لتر/دقيقه من O2 للاستقراء ، 1.5 ٪-2 ٪ ايزوفلونان للصيانة). قم باجراء قرصه اصبع القدم للتاكد من ان الماوس يصل إلى مستوي التخدير المطلوب.
- ضع الماوس علي حامل التصوير وأمن موقفه باستخدام الصنابير أو اي طريقه أخرى مناسبه. نقل حامل إلى مركز لفائف التصوير بالرنين المغناطيسي (7 T/40 سم المغناطيس) وربط اتصال الرصد.
- للحصول علي T2 *-المرجحة المسح الضوئي باستخدام تسلسل الصدى ، تعيين وقت التكرار (TR) إلى 1500 ms والوقت صدي (TE) إلى 2.8 ms.
- استخدام 16 مم × 16 ملم مجال الرؤية (فوف) ، 128 x 128 مصفوفة الاستحواذ (MTX) ، وسمك شريحة من 0.75 x 0.8 مم2 مع أربعه متوسطات اشاره وزاوية 90 ° الوجه (FA).
- سحب حامل الماوس من مركز لفائف التصوير بالرنين المغناطيسي بعد الانتهاء من المسح. أعاده الماوس إلى قفصها ومراقبتها عن كثب حتى يتعافى تماما من التخدير.
-
لتعقب وتحديد MSCs المسمية علي الصور الموزونة T2 * ، استخدم برنامج الاداه الاضافيه ITK (الإصدار 3.8.0)7.
- انقل البيانات الاوليه للتصوير بالرنين المغناطيسي من كمبيوتر جهاز التصوير بالرنين المغناطيسي إلى الكمبيوتر المستخدم للتحليل في صيغه DICOM (الصور الرقمية والاتصالات في الطب).
- تشغيل البرنامج ITK-SNAP وتحميل صور التصوير بالرنين المغناطيسي عن طريق النقر علي زر الملف . ثم انقر علي فتح الصورة الرئيسية في القائمة. اضغط علي زر فتح الصورة في نافذه العرض ، ثم حدد موقع الصور بالرنين المغناطيسي وافتحها باستخدام الزر استعراض .
ملاحظه: وسوف تظهر التصور من الخلايا المسمية في صور التصوير بالرنين المغناطيسي والمناطق hypointense. إذا كان التباين في الصورة يحتاج إلى تعديل ، حدد أدوات | تباين الصور. - إنشاء عناصر التقسيم للمناطق وآلافات وأجزاء الدماغ الأخرى عن طريق تحديد التسمية النشطة في قسم تسميات التجزئة. استخدام ألوان تسميه مختلفه لشرائح مختلفه (إذا كانت هناك حاجه إلى تجزئه أكثر من جزء واحد).
- استخدم أداه المضلع في شريط أدوات الرئيسي لرسم حول المناطق التي تمثل العلامات البارزة Spio المسمية Mscs. حدد قبول، الموجود أسفل صوره التصوير بالرنين المغناطيسي. ستظهر المناطق المجزاه بنفس لون التسمية النشطة المعينة لتلك الشريحة المعينة. كرر هذه الخطوة التجزئة لجميع شرائح التصوير بالرنين المغناطيسي.
- وضع خريطة ثلاثية الابعاد للمناطق المجزاه لتمثيل توزيع MSC في الدماغ بالبالكامل عن طريق تحديد أداه المشرط في أسفل شريط أدوات الابعاد الثلاثية، الموجود في قسم تسميات التجزئة في الجزء السفلي من أداه الاداات الاضافيه ل itk. ثم ، اضغط علي قبول في الجزء السفلي من الخريطة التي تم إنشاؤها 3d.
- لاجراء تحليل كمي (متوسط الحجم والكثافة) للمناطق المجزاه التي تمثل الخلايا المسمية ، اضغط علي زر التجزئة في اللوحة العلوية وحدد وحده التخزين والإحصائيات.
5. تثبيت الدماغ الماوس والمزايدة
-
لإصلاح الدماغ الماوس ، وأداء التروية عبر القلب مع 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) بعد الفحص بالرنين المغناطيسي الماضي ، كما سبق وصفها8.
- قطع رؤوس الراس واستخراج الدماغ8. إصلاح الدماغ مع 4 ٪ PFA لمده 48 ساعة علي الأقل في 4 درجه مئوية.
- ديهيدرات الدماغ عن طريق غمرها في محلول السكروز 30 ٪ في 4 درجه مئوية حتى المصارف الدماغ إلى الجزء السفلي من الحل.
- تضمين الدماغ في الحل درجه حرارة القطع الأمثل (OCT) وتجميد عند-20 درجه مئوية. قسم الدماغ مع ميكروتومي في شرائح مع سماكه 14 ميكرون وتركيبها علي الشرائح. خزن شرائح المقاطع عند-20 درجه مئوية حتى الاستخدام الإضافي.
6. تلطيخ الأزرق البروسي
ملاحظه: ويشيع استخدام تلطيخ الأزرق البروسي للكشف عن محتوي الحديد في الخلايا المسمية SPIO. هنا ، يتم استخدام تلطيخ الأزرق البروسي للتاكد من ان الإشارات hyبوينتينسي في صور التصوير بالرنين المغناطيسي تتوافق مع MSCs المسمي SPIO وليس التحف. تلطيخ الأزرق البروسي هو واحد من الطرق الكيميائية الأكثر حساسية المستخدمة للكشف عن الحديد في الانسجه ويمكن استخدامها لتحديد حتى حبيبه واحده من الحديد في الخلايا.
- غسل الشرائح من أقسام الدماغ مع الماء المقطر لمده 5 دقائق.
- أداء تلطيخ الأزرق البروسي عن طريق غمر الشرائح لمده 30 دقيقه في حل تلطيخ ، والذي يحتوي علي أجزاء متساوية حمض الهيدروكلوريك (10 ٪) والبوتاسيوم فيروسيانيد (10 ٪) أعدت علي الفور قبل الاستخدام.
- غسل 3x مع الماء المقطر ، لمده 5 دقائق لكل منهما. المضادة للبقع المقاطع مع الأحمر سريع النووية لمده 5 دقائق. شطف الشرائح 2x مع الماء المقطر.
- ديهيدرات الأقسام تدريجيا عن طريق غمر الشرائح في 95 ٪ و 100 ٪ الكحول لمده 2 دقيقه لكل منهما. أضافه المشبك مع المتوسطة المتصاعدة راتنجيه.
- استخدام المجهر الضوئي للكشف عن الخلايا الملونة في أقسام الدماغ.
ملاحظه: سيظهر الحديد في الخلايا المسمية كرواسب زرقاء اللون.
Representative Results
وبعد أربع وعشرين ساعة من الولادة في الأنف ، تم الكشف عن MSCs المسمية سبيسو بأنها مناطق قويه من المنطقة الوسطي إلى الاصابه القشرية علي الصور الموزونة T2 * (الشكل 2 ب) ، مما يشير إلى الهجرة المستهدفة من spio إلى موقع الاصابه. وظلت هذه الهجرة مرئية لفتره تصل إلى 14 يوما بعد التسليم ، حيث تبين ان الإشارات التي تدل علي التوتر مرئية دون تخفيض كبير لهذه المدة الزمنيه (الشكل 2 ب). وأظهرت الآثار التي تعرضت لها الكائنات المصابة التي عولجت بواسطة الاذاعه التلفزيونية ان المناطق التي لوحظت فيها تتوافق مع العلامات المسمية MSCs وليس علي الإشارات الملموسة (الشكل2 ا). تم تصور التوزيع الإحيائي لل mscs المسميةفيفيفو. تم تاكيد هجره MSCs إلى القشرة المصابة نسيجيا من قبل تلطيخ الأزرق البروسي والكشف عن قناه FITC من FITC-الموسومة SPIO في MSCs المسمي (الشكل 3ا ، ب).
الشكل 1: مخطط انسيابي للبروتوكول والتاكيد المختبري لامتصاص SPIO من قبل mscs. (ا) تم احتضان mscs مع spio ل 24 ساعة لوضع العلامات. ثم تم تسليم MSCs المسمية إلى نموذج ماوس الدماغ الدماغي الرضي عبر الأنف (IN) الطريق. تم اجراء التصوير بالرنين المغناطيسي في نقاط زمنيه مختلفه لتعقب MSCs المسمية. تم التاكد من وضع العلامات الكافية من MSCs بواسطة SPIO بواسطة (ب) المجهر الفلوري و (ج) المجهر البؤري باستخدام قناه fitc ، حيث تم المفتاحية الجسيمات المجهرية SPIO مع fitc (D) ظهرت الخلية بيليه من MSCs المسمي الظلام في اللون بسبب تحميل الحديد. FITC = فلوريسئين ايزوثيسيانات; SPIO = الجزيئات المغناطيسية الفائقة لأكسيد الحديد ؛ MSCs = الخلايا الجذعية المسسبيه; MRI = التصوير بالرنين المغناطيسي ؛ IN = داخل الأنف; إصابات الدماغ الرضية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التصوير بالرنين المغناطيسي في الوقت الحقيقي تمكن من الكشف عن وتتبع الهجرة MSC المسمية SPIO باتجاه مواقع الإصابات في أدمغه الفئران المستحثة بالدماغ. (ا) تعرضت الفئران للاصابه بالإصابات الرضية ، يليها العلاج بالاجهزه التلفزيونية الخاصة أو المسمية سبيسو ، التي تدار عن طريق خط الأنف 24 ساعة بعد اصابتها. وأظهرت المقاطع الاكليليه من الصور المرجحة T2 * MSCs المسمية كمنطقه التوتر (راس السهم) علي حافه موقع الاصابه (المنطقة المحددة) في 1 و 7 و 14 يوما بعد التسليم. الفئران المعالجة بالبرنامج التلفزيوني لا تظهر منطقه التوتر. (ب) عمليه التجزئة لمنطقه موقع الاصابه (الأخضر) والمسمية mscs (الأحمر) علي أساس الصور T2 *-التصوير بالرنين المغناطيسي الاكليليه. (ج) أعاده بناء 3d لعلاج الدماغ الماوس علي أساس T2 *-الصور المرجحة توضح التوزيع الحيوي لل mscs المسمي spio في الدماغ 14 يوما بعد التسليم. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التحليل النسيجي يؤكد وجود MSCs المسمي سبيسو في أدمغه الماشية المعالجة. واجري تحليل المجهر الفلوري من القشرة من الماوس التحكم (ب) التعامل مع تلفزيوني و (د) الماوس التعامل مع سبيسو المسمي mscs 14 يوما بعد التسليم. كشف التحليل وجود الخلايا الايجابيه الموسومة FITC (الخلايا المحاصرة ، الأخضر) في القشرة المصابة في الماوس المعالج بالماجستير ، ولكن لم تلاحظ اي مؤشرات FITC في قشره الماوس المعالج بالتلفزيونية. قضبان المقياس = 50 μm ، ما لم يذكر خلاف ذلك. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Discussion
البروتوكول الموصوف هنا يمثل الإجراءات العامة لوضع العلامات SPIO من MSCs وتتبع التصوير بالرنين المغناطيسي من سبيسو المسمي MSCs بعد الولادة الداخلية. يسمح البروتوكول الفرصة لدراسة الهجرة والتوزيع الإحيائي لل MSCs بعد التسليم في الجسم الحيوي في الدماغ ، وذلك باستخدام طريقه غير الغازية.
Mscs هي المرشحين جذابة للعلاجات القائمة علي الخلايا الجذعية لاضطرابات CNS والإصابات بسبب قدرتها علي إفراز العوامل الغذائية التي 1) الزناد العمليات العصبية و 2) توفير نيوروبروتكايشن ، نظرا لأثارها المضادة للالتهابات داخل منطقه الاصابه9،10،11،12. علي الرغم من ان تتبع التصوير بالرنين المغناطيسي علي المدى الطويل والكشف عن MSCs المسمي SPIO قد تكون محدوده بسبب تخفيف SPIO بين الخلوية مع انقسام الخلايا ، يمكن الكشف عن الخلايا المسمية لمده تصل إلى عده أسابيع بعد زرع في أدمغه النماذج الحيوانية13.
كما هو موضح هنا بروتوكول وضع العلامات من MSCs مع الجسيمات النانويه SPIO المغلفة مع ديكسكان دون وكلاء التحويل. استعملت بروتوكولات أخرى يتلقى يكون في الأدب14,15,16. ومع ذلك ، في جميع الحالات ، يجب تعديل هذه البروتوكولات لنوع الخلية ، حجم SPIO ، وقت الحضانة ، وتركيز SPIO. وقد تبين ان MSCs قد ضعف التمايز تشوندروجينيك المحتملة ولكن لا التمايز اديبوغينيك علي الوسم SPIO17. ولذلك ، فمن المستحسن جدا ان يتم اجراء اختبارات التمايز قبل تسليم الخلايا الجذعية لتقييم تاثير SPIO علي قوه التمايز من الخلايا الجذعية. في دراسة سابقه, وقد ثبت ان MSC وضع العلامات مع نفس نوع SPIO والتركيز المستخدمة في هنا لا تؤثر علي قوه التمايز أو اديبوغينيك من MSCs6.
ان الطريق الداخلية لتوصيل الخلايا الجذعية العلاجية لاضطرابات المخ والإصابات هو نهج واعد للتطبيق السريري للخلايا الجذعية. ومع ذلك ، تظل أليات المتاصله والجزيئية التي تملي سلوكيات الخلايا الجذعية في تجويف الأنف غير واضحة. علي الرغم من ان يتم استكشاف الطريق داخل الأنف علي نطاق واسع لتسليم جزيئات صغيره ، يختلف حجم وسلوك التوزيع الحيوي لجذع العلاجية من جزيئات صغيره. يوضح البروتوكول الحالي ان MSCs تميل إلى الهجرة نحو موقع الاصابه بعد الولادة الداخلية.
هنا ، تم استخدام الصور الموزونة T2 * لتعقب MSCs المسمي SPIO. واستخدمت تقارير أخرى تصوير الصدى المتدرج. ومع ذلك ، غالبا ما لوحظ التحف الحساسية في التصوير صدي الانحدار بسبب البينية SPIO. وفي البروتوكول الحالي ، كان موقع المناطق التي تمثل المساحات الموجودة في المنطقة والذي يمثل MSCs المسمي سبيسو علي الصور المرجحة T2 * هو نفس موقع SPIO في أقسام المخ كما كشف عنها الفحص النسيجي (الشكل 3). وهذا يشير إلى حساسية كافيه من T2 *-المرجحة التصوير صدي تدور ل SPIO-المسمي MSC تتبع في الدماغ.
وباختصار ، فان البروتوكول الموصوف مفيد لدراسات تتبع الخلايا الجذعية لإصابات المخ واضطراباته. التتبع الطولي للخلايا الجذعية في الجسم الحي قد تم اجراؤه تقليديا من خلال التضحية بالماشية في نقاط زمنيه متعددة. يوفر البروتوكول الحالي نهجا غير الغازية وفعاله للتسليم MSCs وتتبع ، والذي يمثل اجراء محتمل للعلاج القائم علي الخلايا الجذعية لإصابات الدماغ واضطرابات في الإعدادات السريرية.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل وزاره العلوم والتكنولوجيا المنح, تايوان (معظم 104-2923-ب-038-004-MY2, معظم 107-2314-ب-038-063, ومعظم 107-2314-ب-038-042) وجامعه تايبيه الطبية (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-400, TMU 106-5310-001-400 ، DP2-21121 -01 و DP2-108-21121 -01-N-05-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
| Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
| D-MEM/F-12 (1x) with GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | |
| Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | 12662-029 | |
| Fluorescence Wild Field Microscope | Olympus | Olympus BX43 | |
| Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
| Gentamicin (10 mg/mL) | GIBCO | 15710-064 | |
| Hair clipper | Pet Club | PC-400 | |
| Head Trauma Contusion device | Precision Systems and Instrumentation | Model TBI-0310 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 | |
| ITK-SNAP Software | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah | ITK-SNAP 3.8.0 | |
| Ketamine (Ketavet) | Pfizer | 778-551 | |
| Mice | National Laboratory Animal Center, Taiwan | C57BL6 | Wild type mice strain used in the study |
| Microdrill | Nakanishi | NE50 | Combine with Burrs for generating the bone window |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells | GIBCO | S1502-100 | |
| MRI scanner | Bruker Biospec | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
| Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
| Prussian Blue Stain | Abcam | ab150674 | |
| Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
| Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles | BioPAL | Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51 | stem cells labeling for in vivo tracking using MRI |
| Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
| Timer | Wisewind | Replaceable with any source | |
| TrypLE | GIBCO | 12604-013 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | QN05 cm92 |
References
- Pelled, G., et al. Smad8/BMP2-engineered mesenchymal stem cells induce accelerated recovery of the biomechanical properties of the Achilles tendon. Journal of Orthopedic Research. 30 (12), 1932-1939 (2012).
- Shahror, R. A., et al. Transplantation of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 Facilitates Cognitive Recovery and Enhances Neurogenesis in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury. Journal of Neurotrauma. , (2019).
- Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of cells to the brain. European Journal of Cell Biology. 88 (6), 315-324 (2009).
- Karussis, D., et al. Safety and immunological effects of mesenchymal stem cell transplantation in patients with multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis. Archives in Neurology. 67 (10), 1187-1194 (2010).
- Danielyan, L., et al. Intranasal delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells, macrophages, and microglia to the brain in mouse models of Alzheimer's and Parkinson's disease. Cell Transplant. 23, Suppl 1 123-139 (2014).
- Shahror, R. A., Ali, A. A. A., Wu, C. C., Chiang, Y. H., Chen, K. Y. Enhanced Homing of Mesenchymal Stem Cells Overexpressing Fibroblast Growth Factor 21 to Injury Site in a Mouse Model of Traumatic Brain Injury. International Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Li, Y., Chopp, M. Marrow stromal cell transplantation in stroke and traumatic brain injury. Neuroscience Letters. 456 (3), 120-123 (2009).
- Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275, Pt 3 411-426 (2016).
- Ohtaki, H., et al. Stem/progenitor cells from bone marrow decrease neuronal death in global ischemia by modulation of inflammatory/immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14638-14643 (2008).
- Mahmood, A., Lu, D., Chopp, M. Intravenous administration of marrow stromal cells (MSCs) increases the expression of growth factors in rat brain after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 21 (1), 33-39 (2004).
- Hoehn, M., et al. Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16267-16272 (2002).
- Reddy, A. M., et al. In vivo tracking of mesenchymal stem cells labeled with a novel chitosan-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles using 3.0T MRI. Journal of Korean Medical Science. 25 (2), 211-219 (2010).
- Roeder, E., et al. Dose-response of superparamagnetic iron oxide labeling on mesenchymal stem cells chondrogenic differentiation: a multi-scale in vitro study. PLoS ONE. 9 (5), e98451 (2014).
- Schafer, R., et al. Labeling of human mesenchymal stromal cells with superparamagnetic iron oxide leads to a decrease in migration capacity and colony formation ability. Cytotherapy. 11 (1), 68-78 (2009).
- Kostura, L., Kraitchman, D. L., Mackay, A. M., Pittenger, M. F., Bulte, J. W. Feridex labeling of mesenchymal stem cells inhibits chondrogenesis but not adipogenesis or osteogenesis. NMR in Biomedicine. 17 (7), 513-517 (2004).
