여기에 제시된 비침습적 중간엽 줄기 세포(MSC) 전달 및 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 추적을 위한 프로토콜이 제시된다. 초파라마그네틱 산화물 나노입자는 실시간 MRI를 이용한 비강 내 전달 후 생체 내 추적 및 비침습적 MSC 라벨링을 위한 자기 공명 영상(MRI) 프로브로 사용된다.
외상성 뇌 손상 (TBI)과 같은 뇌 손상에 대한 줄기 세포 기반 치료는 임상 시험을위한 유망한 접근 방식입니다. 그러나, 침략적인 세포 납품과 낮은 이식 효율성을 가진 추적과 같은 기술적인 장애물은 번역줄기 기지를 둔 치료에 있는 도전남아 있습니다. 이 기사에서는 중간엽 줄기 세포 (SC)의 표지에 기초하여 줄기 세포 라벨링 및 추적을위한 새로운 기술을 설명합니다 초파라마그네틱 산화물 (SPIO) 나노 입자, 뿐만 아니라 라벨 링 된 중간 엽 줄기 세포의 비강 전달. 이들 나노입자는 플루오레세인 이소티오시오야네이트(FITC)-삽입되고 중산간 경로를 통해 TBI 유도 마우스의 뇌로 전달되는 MC에 라벨을 부착하는 것이 안전하다. 그(것)들은 실시간 자기 공명 화상 진찰 (MRI)에 의해 생체 내에서 비침습적으로 추적됩니다. 세포 표지 및 비강 전달을 위한 SPIO를 결합하는 이 기술의 중요한 이점은 (1) 비침습적, 생체 내 MSC 추적 후 긴 추적 기간 동안, (2) 비침습적 인 비침습적 처방으로 인한 다중 투약 요법의 가능성을 포함한다. MSC 전달의 경로, 및 (3) 인간에게 가능한 적용은, SPIO의 안전성, MRI에 의한 세포 추적 방법의 비침습적 성질, 및 투여 경로로 인해 가능하다.
중간 엽 줄기 세포 (MSC)는 중추 신경계 (CNS) 무질서 및 인간에 있는 상해의 처리에 있는 줄기 세포 기지를 둔 치료를 위한 매력적인 후보입니다. 더욱이, 중전적시(MCS)는 상해 부위1,2에서치료 단백질의 전달을 위한 비차량으로 사용되고 있다. 최근 몇 년 동안, 유망한 혁신은 1) 세포 전달의 새로운 경로 및 2) CNS 무질서의 줄기 세포 기지를 둔 치료를 위한 세포 추적을 설치하기 위하여 개발되었습니다. 뇌로 줄기 세포의 비강 전달은 진골 판을 우회하고 실사 경로를 통해 부분적으로 후각 전구를 입력하는 세포의 능력에 따라 달라집니다3. SPIO 나노입자가 자기공명영상(MRI)을 위한 안전한 프로브이기 때문에,MRI3,4에의한 미균 전달및 미균전달과 초파라마그네틱 산화철(SPIO) 나노입자의 라벨링의 조합은 CNS 장애 치료에 있어 MCS의 임상적 적용을 위한 유망한 접근법을 나타낸다. 또한, 비강 내 전달은 짧은 시간 내에 반복 투여를 허용하는 안전하고 비침습적 경로입니다.
이 기사에서는 SPIO 표지 세포와 MRI를 사용하는 외상성 뇌 손상(TBI)의 마우스 모델에서 생체 내 비강 전달에서 중식미큐어를 추적하기 위한 매우 민감하고 비침습적인 기술에 대해 설명합니다. SPIO 라벨링의 한 가지 중요한 장점은 MRI에 의한 조직 내 SPIO의 민감한 검출이며, 이를 통해 세포를 효율적이고 비침습적으로 추적할 수 있습니다. 여기서 사용되는 SPIO 나노입자는 시판되고 면역 염색 이나 추가 처리 없이 조직에서 SPIO를 검출할 수 있는 플루오레세인 이소티오피아네이트(FITC) 플루오로포폴링된다. 또한, 종방향 실시간 추적을 수행하고 전달된 MC의 생체 분포를 조사할 수 있다.
여기에 설명된 프로토콜은 SC의 SPIO 라벨링 및 SPIO 표지된 MSCs의 MRI 추적에 대한 일반적인 절차를 나타냅니다. 이 프로토콜은 비침습적 방법을 사용하여 뇌에서 생체 내 미세포 의 이동 및 생체 분포를 연구할 수 있는 기회를 허용한다.
중추 세포는 1) 신경 회복 과정을 유발하고 2) 신경 보호를 제공하는 영양 인자를 분비하는 능력으로 인해 CNS 장애 및 부상에 대한 줄기 세포 기반 치료에 대한 매력적인 후보물질이며, 부상 부위9,10,11,12내에서의 항염증 효과로 인해 신경 보호를 제공한다. SPIO 표지된 중간엽 줄기 세포의 장기 MRI 추적 및 검출은 세포 분열을 가진 세포간 SPIO의 희석으로 인해 제한될 수 있지만, 표지된 세포는 동물모델(13)의뇌에서 이식 후 최대 몇 주 동안 검출될 수 있다.
또한 여기에 설명된 것은 형질감염제 없이 덱젠으로 코팅된 SPIO 나노입자를 가진 MCS의 라벨링 프로토콜이다. 다른 프로토콜은 문헌14,15,16에사용되어 왔다. 그러나, 모든 경우에, 이 프로토콜은 세포 유형, SPIO 크기, 배양 시간 및 SPIO 농도를 위해 조정되어야 한다. 미세포는17에스포팅시 연골배분전 전위를 손상시켰지만 지광분화되지 않은 것으로 나타났다. 따라서 줄기세포의 분화 효능에 대한 SPIO의 영향을 평가하기 위해 줄기세포 전달 전에 분화 검사를 수행하는 것이 적극 권장된다. 이전 연구에서는, 여기에 사용된 동일한 SPIO 유형 및 농도를 이용한 MSC 라벨링이 MSCs6의골생성 또는 지방분화 효능에 영향을 미치지 않는다는 것이 입증되었다.
뇌 질환 및 부상에 대한 치료 줄기 세포 전달의 비강 경로는 줄기 세포의 임상 적용을위한 유망한 접근 방식입니다. 그러나, 비강에 있는 줄기 세포의 행동을 지시하는 본질적인 분자 기계장치는 불분명한 남아 있습니다. 비강 내 경로는 소분자의 전달을 위해 널리 탐구되지만, 치료 줄기의 크기 및 생체 분배 거동은 작은 분자와 다릅니다. 현재 프로토콜은 MSC가 비강 내 전달 후 부상 부위로 이동하는 경향이 있음을 보여줍니다.
여기서 T2*가중치 이미지는 SPIO 레이블이 있는 MC를 추적하는 데 사용되었습니다. 다른 보고서는 그라데이션 에코 이미징을 사용했습니다. 그러나, 감수성 유물은 세포간 SPIO 때문에 그라데이션 에코 화상 진찰에서 수시로 관찰됩니다. 현재 프로토콜에서, T2*가중 이미지에서 SPIO 표지 된 MSC를 나타내는 저강도 영역의 위치는 조직학적 검사에 의해 검출된 바와 같이 뇌 섹션에서 SPIO의 위치와 동일하였다(그림3). 이것은 두뇌에 있는 SPIO 표지된 MSC 추적을 위한 T2*가중스핀 에코 화상 진찰의 적당한 감도를 나타냅니다.
요약하면, 기재된 프로토콜은 뇌 손상 및 장애의 생체 내 줄기 세포 추적 연구에 유익하다. 생체 내 줄기 세포의 세로 추적은 전통적으로 여러 시점에서 동물을 희생하여 수행되었습니다. 현재 프로토콜은 임상 설정에서 뇌 손상 및 장애에 대한 줄기 세포 기반 치료에 대한 잠재적 인 절차를 나타내는 MSC 전달 및 추적을위한 비 침습적이고 효율적인 접근 방식을 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 과학기술부 보조금의 지원을 받아 대만 (MOST 104-2923-B-038-004 -MY2, MOST 107-2314-B-038-063, MOST 107-2314-B-038-042) 및 타이베이 의과 대학 (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-540-T00 106-5310-001-400, DP2-107-21121-N-05 및 DP2-108-21121-01-N-05-01).
Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
D-MEM/F-12 (1X) with GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | |
Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | 12662-029 | |
Fluorescence Wild Field Microscope | Olympus | Olympus BX43 | |
Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
Gentamicin (10 mg/mL) | GIBCO | 15710-064 | |
Hair clipper | Pet Club | PC-400 | |
Head Trauma Contusion device | Precision Systems and Instrumentation | Model TBI-0310 | |
Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 | |
ITK-SNAP Software | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah | ITK-SNAP 3.8.0 | |
Ketamine (Ketavet) | Pfizer | 778-551 | |
Mice | National Laboratory Animal Center, Taiwan | C57BL6 | Wild type mice strain used in the study |
Microdrill | Nakanishi | NE50 | Combine with Burrs for generating the bone window |
Microtome | Leica | RM2265 | |
Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells | GIBCO | S1502-100 | |
MRI scanner | Bruker Biospec | ||
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
Prussian Blue Stain | Abcam | ab150674 | |
Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles | BioPAL | Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51 | stem cells labeling for in vivo tracking using MRI |
Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
Timer | Wisewind | Replaceable with any source | |
TrypLE | GIBCO | 12604-013 | |
Xylazine (Rompun) | Bayer | QN05 cm92 |