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Summary

Presentato qui è un protocollo per la consegna e il monitoraggio di cellule staminali mesenchymale non invasive (MSC) in un modello murino di lesioni cerebrali traumatiche. Le nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche sono impiegate come sonda di risonanza magnetica (MRI) per l’etichettatura MSC e il tracciamento in vivo non invasivo dopo la consegna intranasale mediante risonanza magnetica in tempo reale.

Abstract

Le terapie basate su cellule staminali per lesioni cerebrali, come lesioni cerebrali traumatiche (TBI), sono un approccio promettente per gli studi clinici. Tuttavia, gli ostacoli tecnici come la somministrazione invasiva di cellule e il monitoraggio con bassa efficienza dei trapianti rimangono sfide nella terapia a base di staminali traslazionali. Questo articolo descrive una tecnica emergente per l’etichettatura e il tracciamento delle cellule staminali in base all’etichettatura delle cellule staminali mesentiche (MSC) con nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico (SPIO), nonché la somministrazione intranasale delle MSC etichettate. Queste nanoparticelle sono incorporate in fluoresceina (FITC) e sicure per etichettare le MSC, che vengono successivamente consegnate al cervello dei topi indotti da TBI dalla rotta intranasale. Vengono quindi tracciati in modo non invasivo in vivo dalla risonanza magnetica in tempo reale (RM). Importanti vantaggi di questa tecnica che combina SPIO per l’etichettatura cellulare e la consegna intranasale includono (1) il monitoraggio MSC in vivo non invasivo dopo la consegna per lunghi periodi di tracciamento, (2) la possibilità di più regimi di dosazione a causa della non invasiva (3) possibili applicazioni per l’uomo, a causa della sicurezza dello SPIO, della natura non invasiva del metodo di tracciamento cellulare mediante la risonanza magnetica e del percorso di somministrazione.

Introduction

Le cellule staminali mesenchymiche (MSC) sono candidati interessanti per le terapie basate sulle cellule staminali nei trattamenti di disturbi e lesioni del sistema nervoso centrale (SNC) nell’uomo. Inoltre, le MSC sono state utilizzate come veicolo per la consegna di proteine terapeutiche nei siti di lesione^1,2. Negli ultimi anni, sono state sviluppate promettenti innovazioni per stabilire 1) nuove vie di consegna cellulare e 2) monitoraggio cellulare per le terapie basate sulle cellule staminali dei disturbi del SNC. La somministrazione intranasale delle cellule staminali nel cervello dipende dalla capacità delle cellule di bypassare la piastra cribriforme ed entrare parzialmente nel bulbo olfattivo tramite un percorso parenchyle³. La combinazione della somministrazione intranasale e l’etichettatura di MSC con nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico (SPIO) rappresenta un approccio promettente per le applicazioni cliniche di MSC nel trattamento dei disturbi del CNC, poiché le nanoparticelle SPIO sono sonde sicure per la risonanza magnetica (RM) e consentono il monitoraggio longitudinale sensibile non invasivo delle MSCs dopo la consegna da parte della risonanza magnetica^3,4,5. Inoltre, la consegna intranasale è un percorso sicuro e non invasivo che consente una somministrazione ripetuta entro un breve periodo di tempo.

Questo articolo descrive una tecnica altamente sensibile e non invasiva per il monitoraggio delle MSC in vivo della consegna post-intranasale in un modello murino di lesioni cerebrali traumatiche (TBI), che impiega cellule con etichettatura SPIO e risonanza magnetica. Un importante vantaggio dell’etichettatura SPIO è la rilevazione sensibile dello SPIO nei tessuti mediante la risonanza magnetica, che consente di tracciare le cellule in modo efficiente e non invasivo. Le nanoparticelle SPIO qui utilizzate sono disponibili in commercio e etichettate con un fluoroforo fluorescenza (FITC), che consente il rilevamento dello SPIO nei tessuti senza immunostaining o ulteriore elaborazione. Inoltre, è possibile eseguire il monitoraggio longitudinale in tempo reale e studiare la biodistribuzione delle MSC consegnate.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono animali in questo protocollo sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali, con l’approvazione del Comitato Etico per l’uso degli animali presso l’Università di Medicina di Taipei (approvazione n. LAC-2018-0574; 15.03.2019). 1. Etichettatura di MSC con SPIO Nanoparticles Per etichettare gli MSC con SPIO, aggiungere 6 mL di supporti di etichettatura (25 g/mL di SPIO nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco [DMEM] senza siero bovino fetale [FBS]) a un flacone T75 contenente MSC (80% di confluenza). Incubare le cellule con i mezzi di etichettatura in un’incubatrice di CO2 (37 gradi centigradi, 5% CO2)senza agitare. Dopo 24 h, rimuovere delicatamente il supporto di etichettatura utilizzando una sterile pipetta Pasteur con una punta di plastica attaccata al vuoto. Lavare le cellule momotore 2x con 6 mL di fosfato tampone salina (PBS) per rimuovere eventuali tracce di SPIO non internonesso. Per determinare se le cellule sono state etichettate con successo, controllare le cellule etichettate al microscopio fluorescente o al microscopio confocale se lo SPIO è contrassegnato con un fluoroforo (cioè, come quelli utilizzati qui; Figura 1B,C). In alternativa, eseguire la colorazione blu prussiana per le celle (vedere i passaggi da 6.2 a 6,4 per il protocollo di colorazione). Raccogliere cellule aderenti per trattamento con 3 mL di trypsin e incubare a 37 gradi centigradi. Dopo 5 minuti di incubazione, aggiungere 7 mL di supporti DMEM preriscaldati con 10% FBS (v/v) per inattivare la trypsin. Raccogliere la sospensione cellulare utilizzando una pipetta in un tubo conico da 15 mL. Centrifugate la sospensione cellulare a 300 x g per 5 min. Scartare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in PBS. Contare le cellule vitali utilizzando tosatura blu trypan e un emocitometro. NOT:</ Il pellet cellulare delle celle etichettate apparirà come un colore scuro a causa del caricamento del ferro (Figura 1D). Questo protocollo è rilevante per l’etichettatura MSC e la risonanza magnetica. La procedura per l’etichettatura MSC6 è stata precedentemente ottimizzata e solo i passaggi per preparare gli MSC etichettati per tenere traccia in vivo sono inclusi qui, poiché il tracciamento in vivo è al centro dell’attenzione. Il protocollo per la coltura e l’etichettatura di altri tipi di cellule dovrebbe essere ottimizzato dal ricercatore. Regolare la concentrazione cellulare utilizzando PBS a 150.000 celle (o un numero che si traduce in un segnale DI risonanza magnetica sufficiente) in 18 : L di PBS (o il volume totale che verrà utilizzato nella procedura di consegna intranasale). NOT:</ È stato notato che una concentrazione cellulare superiore a 150.000 cellule/18 gradi di PBS porta all’aggregazione cellulare, che può influenzare l’efficienza della somministrazione intranasale. Se è necessario un numero maggiore di cellule per la somministrazione intranasale, aumentare il volume totale delle sospensioni cellulari e aumentare il numero di amministrazioni intranasali, poiché la somministrazione intranasale è una procedura non invasiva ed è possibile il dosaggio multiplo. 2. Infortunio da impatto corticale controllato (CCI) NOT:</ In questo protocollo, i topi maschi C57 BL/6 (7-8 settimane) sono stati tenuti in un ciclo di luce/scuro 12/12 h con accesso ad libitum al cibo e all’acqua. Per preparare ogni topo per lesioni CCI, somministrare l’iniezione di zolazepam (50 mg/kg) e xylazina (20 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale (i.p.) (1 mL/kg). Assicurarsi che la profondità dell’anestesia sia sufficiente per mancanza di risposta del ditapo. In alternativa, posizionare il mouse in una camera dotata di 2%–4% isoflurane per 60 s. Rasare la pelliccia della superficie dorsale del cranio tra le orecchie utilizzando un tagliacapelli elettronico. Pulire l’area rasata più volte utilizzando un tampone di cotone sterile imbevuto di iodio. Utilizzare un tampone di cotone imbevuto di 70% etanolo per pulire lo iodio. Posizionare il mouse anetizzato nella cornice stereotassica e fissare il mouse utilizzando barre dell’orecchio e barre del naso. Fare un’incisione mediasagica (circa 2,5 cm) nella pelle rasata utilizzando forbici sterili per accedere alla superficie del cranio. Rimuovere il tessuto sull’osso utilizzando un batuffolo di cotone per esporre il cranio. Pulire la superficie del cranio con un tampone di cotone imbevuto in un 3% H2O2 per 10 s, quindi pulirlo con un batuffolo di cotone secco. NOT:</ Le suture del cranio e sia bregma che lambda possono ora essere facilmente identificate. Identificare le coordinate di scelta sulla superficie del cranio per la lesione CCI e disegnare un cerchio (4 mm di diametro) intorno alle coordinate utilizzando una matita o un pennarello adeguato. NOT:</ In questo protocollo, sono state utilizzate le coordinate anteeroposteriori (AP) -2,0 mm e mediolateral (ML) 1,5 mm per l’induzione CCI. Utilizzare un microdrill e una bava rotonda (di ausilio di 0,5 mm) per assottigliare il cranio in corrispondenza del cerchio contrassegnato. Evitare di applicare la pressione durante la perforazione, come perforazione attraverso l’osso può causare danni al parenchyma cervello. Pulire la polvere ossea utilizzando un tampone di cotone pulito e secco. Rimuovere delicatamente il lembo osseo utilizzando pinze sottili sterili per esporre la dura mater mantenendola intatta. Rimuovere il mouse dal telaio stereotassico utilizzato per la preparazione pre-infortunio e posizionarlo nel telaio stereotassico del dispositivo CCI. Stabilizzare la testa del mouse utilizzando le barre dell’orecchio e le barre del naso. Assicurarsi che la testa del mouse è livellata nella direzione rostral-caudale e regolare le barre del naso, se necessario. Seguire le istruzioni riportate nella casella di controllo per azzerare la punta dell’impatto sulla superficie corticale esposta. Assicurarsi che la punta dell’impatto sia allineata direttamente sopra le coordinate della corteccia desiderate per essere influenzata utilizzando le ruote di controllo X e Y sulla base dell’impactor. Impostare i parametri dell’esperimento utilizzando la casella di controllo con una velocità di 5 m/s, un tempo di perbita di 250 ms e una profondità di lesione di 1 mm per indurre lievi lesioni al mouse. Indurre lesioni premendo il pulsante ”impatto” sulla casella di controllo. Savare qualsiasi sanguinamento che si verifica utilizzando un tampone di cotone sterile. Rimuovere il mouse dal telaio stereotassico e chiudere l’incisione utilizzando suture chirurgiche di seta. Non utilizzare clip metalliche per chiudere il sito chirurgico, poiché il mouse sarà sottoposto a un campo magnetico per la risonanza magnetica. Applicare antibiotici topici (bacitracina neomycin) al sito chirurgico per prevenire le infezioni. Tenere il mouse sulla piastra di riscaldamento e monitorarlo attentamente durante la fase di recupero. Somministrare chetoprofene (2,5 mg/kg, IP) ogni giorno per 3 giorni dopo l’intervento chirurgico, a meno che la somministrazione chetoprofene non contraddica gli obiettivi di studio. 3. Consegna intranasale A 1 giorno dopo l’induzione del CCI, somministrare il cocktail anestetizzante zolazepam (50 mg/kg) e xylazina (20 mg/kg) tramite iniezione i.p. Assicurarsi che il mouse sia profondamente anetizzato dalla mancanza di risposta alla punta-pizzicamento. Preparare il mouse per la somministrazione intranasale di MSC mediante trattamento con ialuronidasi. Afferra la mischia del mouse e girala saldamente mentre immobilizza il cranio. Posizionare la punta di una pipetta che contiene la ialuronidasi in PBS sterile (4 U/L) vicino alla narice del topo con un angolo di 45 gradi. Amministrare 3 -L di sospensione di ialuronidasi in ogni narice. Mantenere il mouse immobilizzato e rivolto verso l’alto su un pad pulito per 5 min. Ripetere il trattamento con ialuronidasi 4x (totale di 100 sospensioni U ialuronidasi). Dopo il trattamento con ialuronidasi, tenere il topo trattato su un pad pulito rivolto verso l’alto per 30 min. Per fornire MSC nel cervello, tenere saldamente il mouse, come descritto nel passaggio 3.2.1. Amministrare 3 / naci/ sospensione della sospensione MSC con un intervallo di 3 s. Tenere il mouse nella stessa posizione per 30 s fino a quando le gocce campione sono completamente scomparse. NOT:</ Evitare di formare bolle d’aria durante la somministrazione. Ripetere la somministrazione con un intervallo di 2 min fino a 3x. NOT:</ Il numero totale di cellule da consegnare è di 150.000, in modo tale che 18 ll della sospensione cellulare possa essere consegnato a un dosaggio di 3 gradi per ogni narice, 3 volte ciascuno. Riportare il mouse alla sua gabbia e monitorarlo da vicino fino a quando non si riprende completamente dall’anestesia. 4. Risonanza Magnetica In Vivo NOT:</ La colorazione istologica del tessuto cerebrale è stata precedentemente utilizzata per confermare la corretta consegna delle cellule staminali dopo la somministrazione intranasale. Tuttavia, questo metodo può essere utilizzato solo come endpoint di uno studio, non longitudinalmente. L’utilizzo di sonde MRI per etichettare le cellule staminali terapeutiche consentirà di tracciare longitudinali, non invasivi, in vivo delle cellule che utilizzano la risonanza magnetica. È importante sottolineare che questo protocollo riduce in modo efficiente il numero di animali necessari. In questo protocollo, la scansione RM è stata eseguita nei giorni 1, 7 e 14 post-consegna di MSC. Per preparare il mouse per la risonanza magnetica, anestesizzare il mouse con isoflurane (5% isoflurane in 1 L/min di O2 per l’induzione, 1.5%–2% isoflurane per la manutenzione). Eseguire un pizzico di punta per assicurarsi che il mouse raggiunga il livello di anestesia richiesto. Posizionare il mouse sul supporto di imaging e fissarne la posizione con rubinetti o qualsiasi altro metodo adeguato. Spostare il supporto al centro della bobina di risonanza magnetica (7 T/40 cm magnete) e collegare la connessione di monitoraggio. Per acquisire scansioni ponderate T2 usando una sequenza spin-echo, impostate il tempo di ripetizione (TR) su 1500 ms e il tempo di eco (TE) su 2,8 ms. Utilizzare un campo visivo di 16 mm x 16 mm (FOV), una matrice di acquisizione 128 x 128 (MTX) e uno spessore della sezione di 0,75 x 0,8 mm2 con quattro medie di segnale e un angolo di capovolgimento di 90 gradi (FA). Ritirare il supporto del mouse dal centro della bobina MRI dopo aver completato le scansioni. Riportare il mouse alla sua gabbia e monitorarlo da vicino fino a quando non si riprende completamente dall’anestesia. Per tenere traccia e quantificare gli MSC etichettati sulle immagini ponderate T2, utilizzare il software ITK-SNAP (versione 3.8.0)7. Trasferire i dati grezzi delle scansioni MRI dal computer della macchina MRI al computer utilizzato per l’analisi in formato DICOM (digital imaging e comunicazione in medicina). Eseguire il software ITK-SNAP e caricare le immagini MRI facendo clic sul pulsante File. Quindi, fare clic su Apri immagine principale nel menu. Premere il pulsante Apri immagine nella finestra di visualizzazione, quindi individuare e aprire le immagini MRI utilizzando il pulsante Sfoglia. NOT:</ La visualizzazione delle celle etichettate nelle immagini della risonanza magnetica apparirà come aree ipointense. Se è necessario regolare il contrasto dell’immagine, selezionare Strumenti Contrasto immagine. Creare segmentazioni delle aree ipointense e della lesione o di altre parti del cervello selezionando Etichetta attiva nella sezione delle etichette di segmentazione. Utilizzare colori di etichetta diversi per segmenti diversi (se è necessaria la segmentazione di più parti). Utilizzare lo strumento Poligono nella barra degli strumenti principale per disegnare intorno alle aree ipointense che rappresentano gli MSCs con etichetta SPIO. Le aree segmentate appariranno dello stesso colore dell’etichetta attiva assegnata a quel particolare segmento. Ripetere questo passaggio di segmentazione per tutte le sezioni di risonanza magnetica. Sviluppare una mappa 3D delle aree segmentate per rappresentare la distribuzione MSC nell’intero cervello selezionando lo strumento Scalpel nella parte inferiore della barra degli strumenti 3D, che si trova nella sezione Etichette di segmentazione nella parte inferiore della casella degli strumenti TheITK-SNAP. Quindi, premere Accetta nella parte inferiore della mappa 3D creata. Per eseguire un’analisi quantitativa (media di volume e intensità) delle aree ipointense segmentate che rappresentano celle etichettate, premere il pulsante Segmentazione nel pannello superiore e selezionare Volume e statistiche. 5. Fissazione del cervello del topo e criosezione Per fissare il cervello del topo, eseguire la perfusione trascardiaca con 4% paraformaldeide (PFA) dopo l’ultima risonanza magnetica, come descritto in precedenza8. Decapitare la testa ed estrarre il cervello8. Fissare il cervello con 4% PFA per almeno 48 h a 4 gradi centigradi. Disidratare il cervello immergendolo in una soluzione di saccarosio del 30% a 4 gradi centigradi fino a quando il cervello affonda sul fondo della soluzione. Incorporare il cervello nella soluzione ottimale della temperatura di taglio (OCT) e congelare a -20 gradi centigradi. Sezionare il cervello con un microtoma criostato a fette di spessore di 14 m e montarli su vetrini. Conservare le sezioni scorrevoli a -20 gradi centigradi fino a un ulteriore utilizzo. 6. Colorazione blu prussiana NOT:</ La colorazione blu prussiana è comunemente usata per rilevare il contenuto di ferro nelle cellule con etichetta SPIO. Qui, la colorazione blu prussiana viene utilizzata per confermare che i segnali ipointensi nelle immagini della risonanza magnetica corrispondono agli MSC etichettati SPIO e non agli artefatti. La colorazione blu prussiana è uno dei metodi istochimici più sensibili utilizzati per rilevare il ferro nei tessuti e può essere utilizzato per identificare anche un singolo granulo di ferro nelle cellule. Lavare i vetrini delle sezioni cerebrali con acqua distillata per 5 min. Eseguire la colorazione blu prussiana immergendo i vetrini per 30 min nella soluzione di colorazione, che contiene parti uguali acido cloridrico (10%) e ferrocianide di potassio (10%) preparati immediatamente prima dell’uso. Lavare 3x con acqua distillata, per 5 min ciascuno. Controstale le sezioni con nucleare veloce rosso per 5 min. Sciacquare gli scivoli 2x con acqua distillata. Disidratare gradualmente le sezioni immergendo i vetrini nel 95% e 100% di alcol per 2 min ciascuno. Aggiungere il coperchio con un supporto di montaggio resinoso. Utilizzare un microscopio luminoso per rilevare le cellule colorate nelle sezioni cerebrali. NOT:</ Il ferro nelle celle etichettate apparirà come depositi di colore blu.

Representative Results

Ventiquattro ore dopo la consegna intranasale, gli MSC etichettati SPIO sono stati rilevati come forti aree ipointense mediali alla lesione corticale sulle immagini ponderate T2(Figura 2B), che indicano la migrazione mirata dello SPIO al sito dell’infortunio. Questa migrazione è rimasta visibile fino a 14 giorni dopo la consegna, poiché i segnali ipointensi sono risultati visibili senza una significativa riduzione per questo periodo di tempo (Figura 2B). Gli animali feriti trattati con PBS non hanno mostrato aree ipointense, il che indica che le aree ipointense osservate corrispondono agli MSC etichettati SPIO e non segnalano i manufatti (Figura 2A) La biodistribuzione degli MSC etichettati in vivo con la risonanza magnetica è stata visualizzata utilizzando la ricostruzione 3D (Figura 2C,D). La migrazione degli MSC verso la corteccia ferita è stata confermata istologicamente dalla colorazione blu prussiana e dal rilevamento del canale FITC dello SPIO con etichetta FITC negli MSC etichettati (Figura 3A,B). Figura 1: Diagramma di flusso schematico del protocollo e conferma in vitro dell’assorbimento SPIO da parte di MSC. (A) gli MSC sono stati incubati con SPIO per 24 h per l’etichettatura. Quindi, gli MSC etichettati sono stati consegnati in un modello di topo TBI tramite un percorso intranasale (IN). La risonanza magnetica in tempi diversi è stata eseguita per monitorare gli MSC etichettati. La conferma di un’etichettatura sufficiente degli MSC da parte dello SPIO è stata ottenuta mediante la microscopia a fluorescenza (B) e la microscopia confocale (C)utilizzando il canale FITC, poiché le nanoparticelle SPIO sono state contrassegnate con FITC. (D) Il pellet cellulare dei MSC etichettati appariva di colore scuro a causa del carico di ferro. FITC – isotica di fluoresceina; SPIO – particelle superparamagnetiche di ossido di ferro; MSC – cellule staminali mesenmale; RM – risonanza magnetica; IN – intranasale; TBI – lesione cerebrale traumatica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: La risonanza magnetica in tempo reale consente il rilevamento e il monitoraggio della migrazione MSC con etichetta TOSPI verso i siti di lesioni nel cervello dei topi indotti da TBI. (A) I topi sono stati sottoposti a TBI, seguiti da un trattamento con PBS o MSC con etichettatura SPIO, somministrati tramite una vie intranasale 24 h dopo un infortunio. Le sezioni coronali di immagini ponderate T2 mostravano i MSC etichettati come un’area ipointensa (freccia) sul bordo del sito di lesioni (area delineata) a 1, 7 e 14 giorni dopo la consegna. I topi trattati con PBS non mostrano alcuna area ipointensa. (B) Processo di segmentazione dell’area del sito di lesioni (verde) e msCs etichettati (rosso) in base alle immagini coronali di risonanza magnetica T2. (C) Ricostruzione 3D del trattamento del cervello del topo basato su immagini ponderate t2 che illustrano la biodistribuzione delle MSC con etichetta SPIO nel cervello 14 giorni dopo la consegna. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: L’analisi istologica conferma la presenza di MSC con etichetta SPIO nel cervello degli animali trattati. La colorazione blu prussiana delle sezioni cerebrali di un topo (A) trattate con topo PBS (controllo) e (C) trattate con MSC con etichetta SPIO. L’analisi della microscopia a fluorescenza del topo di controllo della corteccia di un topo di controllo( B) trattato con PBS e (D) trattato con MSC con etichetta SPIO è stata condotta 14 giorni dopo la consegna. L’analisi ha rivelato la presenza di cellule SPIO-positive con tag FITC (cellule boxed, verdi) nella corteccia ferita nel topo trattato con MSC, ma non sono stati osservati segnali FITC nella corteccia del topo trattato con PBS. Barre di scala da 50 m, se non diversamente specificato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il protocollo qui descritto rappresenta procedure generali per l’etichettatura SPIO degli MSC e il monitoraggio della risonanza magnetica degli MSC con etichetta SPIO post-intranasali. Il protocollo consente di studiare la migrazione e la biodistribuzione delle MSC post-consegna in vivo nel cervello, utilizzando un metodo non invasivo.

Le MSC sono candidati interessanti per le terapie basate sulle cellule staminali per disturbi e lesioni del SNC a causa della loro capacità di secernere fattori trofici che 1) innescano processi neuroridativi e 2) forniscono neuroprotezione, a causa dei loro effetti antinfiammatori all’interno dell’area della lesione^9,10,11,12. Anche se il monitoraggio e il rilevamento a lungo termine della risonanza magnetica e il rilevamento di MSC con etichettatura SPIO possono essere limitati a causa della diluizione di SPIO intercellulare con divisione cellulare, le cellule etichettate possono essere rilevate fino a diverse settimane dopo il trapianto nel cervello dei modelli animali¹³.

È inoltre descritto il protocollo di etichettatura delle MSC con nanoparticelle SPIO rivestite con dextran senza agenti di trasfezione. Altri protocolli sono stati utilizzati nella letteratura^14,15,16. Tuttavia, in tutti i casi, questi protocolli devono essere regolati per il tipo di cellula, la dimensione SPIO, il tempo di incubazione e la concentrazione di SPIO. È stato dimostrato che le MSC hanno un potenziale di differenziazione condronogenico compromesso, ma non adipogeni che si differenziano per l’etichettatura SPIO¹⁷. Pertanto, è altamente raccomandato che i saggi di differenziazione siano eseguiti prima della consegna delle cellule staminali per valutare l’influenza dello SPIO sulla potenza di differenziazione delle cellule staminali. In uno studio precedente, è stato dimostrato che l’etichettatura MSC con lo stesso tipo spiO e la concentrazione utilizzata in qui non hanno influenzato la potenza di differenziazione osteogenica o adipogenica delle MSC⁶.

La via intranasale della somministrazione terapeutica delle cellule staminali per disturbi e lesioni cerebrali è un approccio promettente per l’applicazione clinica delle cellule staminali. Tuttavia, i meccanismi intrinseci e molecolari che dettano i comportamenti delle cellule staminali nella cavità nasale rimangono poco chiari. Anche se il percorso intranasale è ampiamente esplorato per la consegna di piccole molecole, la dimensione e il comportamento di biodistribuzione dello stelo terapeutico differiscono da piccole molecole. Il protocollo attuale dimostra che le MSC tendono a migrare verso il sito di lesioni dopo la consegna intranasale.

In questo caso, sono state utilizzate immagini ponderate T2 per tenere traccia degli MSC con etichetta SPIO. Altri rapporti hanno usato l’imaging eco gradiente. Tuttavia, gli artefatti di suscettibilità sono spesso osservati nell’imaging eco a gradiente a causa dello SPIO intercellulare. Nel protocollo attuale, la posizione delle aree ipointense che rappresentano gli MSC con etichetta SPIO sulle immagini ponderate T2 era la stessa della posizione dello SPIO nelle sezioni cerebrali rilevate dall’esame istologico (Figura 3). Ciò indica l’adeguata sensibilità dell’imaging eco dello spin ponderato T2 per il tracciamento MSC con etichetta SPIO nel cervello.

In sintesi, il protocollo descritto è utile per gli studi di tracciamento delle cellule staminali in vivo di lesioni cerebrali e disturbi. Il tracciamento longitudinale delle cellule staminali in vivo è stato tradizionalmente eseguito sacrificando gli animali in più punti temporali. L’attuale protocollo fornisce un approccio non invasivo ed efficiente per la consegna e il monitoraggio delle MSC, che rappresenta una potenziale procedura per la terapia basata sulle cellule staminali per lesioni cerebrali e disturbi in ambienti clinici.

Materials

Cell culture supplies (Plastics)	ThermoFisher Scientific	Varies	Replaceable with any source
Disposable Microtome Blade	VWR	95057-832
D-MEM/F-12 (1X) with GlutaMAX	GIBCO	10565-018
Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.)	Sakura Finetek	4583
Fetal Bovine Serum (FBS)	GIBCO	12662-029
Fluorescence Wild Field Microscope	Olympus	Olympus BX43
Forcept	Fine Science Tools	11293-00	Surgery
Gentamicin (10 mg/mL)	GIBCO	15710-064
Hair clipper	Pet Club	PC-400
Head Trauma Contusion device	Precision Systems and Instrumentation	Model TBI-0310
Hyaluronidase from bovine testes	MilliporeSigma	H3506
ITK-SNAP Software	Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah	ITK-SNAP 3.8.0
Ketamine (Ketavet)	Pfizer	778-551
Mice	National Laboratory Animal Center, Taiwan	C57BL6	Wild type mice strain used in the study
Microdrill	Nakanishi	NE50	Combine with Burrs for generating the bone window
Microtome	Leica	RM2265
Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells	GIBCO	S1502-100
MRI scanner	Bruker Biospec
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Corning Cellgro/ThermoFisher	21-031-CV
Povidone-iodine 7.5%	Purdue product L.P.		Surgical scrub
Prussian Blue Stain	Abcam	ab150674
Scissor	Fine Science Tools	14084-08	Surgery
Stereotaxic frame	Kopf Instruments	Model 900
Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles	BioPAL	Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51	stem cells labeling for in vivo tracking using MRI
Suture monofilament	Ethicon	G697	Suture
Timer	Wisewind		Replaceable with any source
TrypLE	GIBCO	12604-013
Xylazine (Rompun)	Bayer	QN05 cm92