Présenté ici est un protocole pour la livraison non-invasive de cellules souches mésenchymales (MSC) et le suivi dans un modèle de souris de lésions cérébrales traumatiques. Les nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnetic sont employées comme sonde d’imagerie par résonance magnétique (IRM) pour l’étiquetage mSC et le suivi in vivo non invasif suivant la livraison intranasale utilisant l’IRM en temps réel.
Les thérapies à base de cellules souches pour les lésions cérébrales, telles que les lésions cérébrales traumatiques (ITC), sont une approche prometteuse pour les essais cliniques. Cependant, les obstacles techniques tels que l’administration et le suivi invasifs de cellules avec l’efficacité peu de transplantation demeurent des défis dans la thérapie translationnelle de tige-basée. Cet article décrit une technique émergente pour l’étiquetage et le suivi des cellules souches basés sur l’étiquetage des cellules souches mésenchymales (MSC) avec des nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnetic (SPIO), ainsi que la livraison intranasale des MSC étiquetés. Ces nanoparticules sont de la fluorescéine isothiocyanate (FITC) intégrée et sans danger pour étiqueter les MSC, qui sont ensuite livrés au cerveau des souris induites par TBI par la voie intranasale. Ils sont ensuite suivis in vivo de façon non invasive par imagerie par résonance magnétique en temps réel (IRM). Les avantages importants de cette technique qui combine SPIO pour l’étiquetage cellulaire et la livraison intranasale incluent (1) non-invasif, suivi in vivo de MSC après livraison pendant de longues périodes de suivi, (2) la possibilité de régimes de dosage multiples dus au non-invasif l’itinéraire de la livraison de MSC, et (3) les applications possibles aux humains, en raison de la sûreté de SPIO, nature non envahissante de la méthode de cellule-tracking par MRI, et itinéraire d’administration.
Les cellules souches mésenchymales (MSC) sont des candidats attrayants pour les thérapies à base de cellules souches dans les traitements des troubles du système nerveux central (SNC) et des blessures chez l’homme. En outre, les MSC ont été utilisés comme un véhicule pour la livraison de protéines thérapeutiques sur les sites de blessures1,2. Au cours des dernières années, des innovations prometteuses ont été développées pour établir 1) de nouvelles voies d’administration cellulaire et 2) le suivi cellulaire pour les thérapies à base de cellules souches des troubles du SNC. La livraison intranasale des cellules souches dans le cerveau dépend de la capacité des cellules à contourner la plaque cribriforme et entrer dans l’ampoule olfactive partiellement par une voie parenchymale3. La combinaison de la livraison intranasale et de l’étiquetage des MSC avec des nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnetic (SPIO) représente une approche prometteuse pour les applications cliniques des MSC dans le traitement des troubles de la SNC, puisque les nanoparticules SPIO sont des sondes sûres pour l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et permettent le suivi longitudinal sensible non invasif des MSC après la livraison par IRM3,4,5. En outre, la livraison intranasale est une voie sûre et non-invasive qui permet l’administration répétée dans un court laps de temps.
Cet article décrit une technique très sensible et non-invasive pour suivre MSCs in vivo post-intranasal delivery dans un modèle de souris de lésions cérébrales traumatiques (TBI), qui emploie des cellules étiquetées SPIO et MRI. Un avantage important de l’étiquetage SPIO est la détection sensible de SPIO dans les tissus par IRM, ce qui permet de suivre les cellules efficacement et non-invasivement. Les nanoparticules SPIO utilisées ici sont disponibles dans le commerce et étiquetées avec un fluorophophore isothiocyanate (FITC) de fluoréiocyanate (FITC), qui permet la détection de SPIO dans les tissus sans immunostaining ou traitement supplémentaire. En outre, il est possible d’effectuer un suivi longitudinal en temps réel et d’étudier la biodistribution des SDC livrés.
Le protocole décrit ici représente les procédures générales pour l’étiquetage SPIO des MSC et le suivi PAR IRM des MSC étiquetés SPIO après l’accouchement intranasal. Le protocole permet d’étudier la migration et la biodistribution des MSC après la livraison in vivo dans le cerveau, en utilisant une méthode non invasive.
Les MSC sont des candidats attrayants pour les thérapies à base de cellules souches pour les troubles et les blessures du SNC en raison de leur capacité à sécréter des facteurs trophiques qui 1) déclenchent des processus neuroréparateurs et 2) fournissent une neuroprotection, en raison de leurs effets anti-inflammatoires dans la zone des blessures9,10,11,12. Bien que le suivi et la détection à long terme par IRM des MSC étiquetés SPIO puissent être limités en raison de la dilution du SPIO intercellulaire avec division cellulaire, les cellules étiquetées peuvent être détectées pendant plusieurs semaines après la transplantation dans le cerveau des modèles animaux13.
Le protocole d’étiquetage des MSC avec des nanoparticules SPIO recouvertes de dextran sans agents de transfection est également décrit ici. D’autres protocoles ont été utilisés dans la littérature14,15,16. Cependant, dans tous les cas, ces protocoles devraient être ajustés pour le type de cellule, la taille de SPIO, le temps d’incubation, et la concentration de SPIO. Il a été démontré que les MSC avaient un potentiel de différenciation chondrogénique altéré, mais non une différenciation adipogénique sur l’étiquetage SPIO17. Par conséquent, il est fortement recommandé que les tests de différenciation soient effectués avant la livraison des cellules souches afin d’évaluer l’influence de SPIO sur la puissance de différenciation des cellules souches. Dans une étude précédente, il a été démontré que l’étiquetage MSC avec le même type de SPIO et la concentration utilisée dans l’ici n’a pas affecté la puissance de différenciation ostéogénique ou adipogénique de MSCs6.
La voie intranasale de la livraison thérapeutique de cellules souches pour des désordres et des dommages de cerveau est une approche prometteuse pour l’application clinique des cellules souches. Cependant, les mécanismes intrinsèques et moléculaires qui dictent les comportements des cellules souches dans la cavité nasale restent flous. Bien que la voie intranasale soit largement explorée pour la livraison de petites molécules, la taille et le comportement de biodistribution de la tige thérapeutique diffèrent des petites molécules. Le protocole actuel démontre que les SSM ont tendance à migrer vers le site des blessures après l’accouchement intranasal.
Ici, des images pondérées en T2 ont été utilisées pour suivre les MSC étiquetés SPIO. D’autres rapports ont utilisé l’imagerie par écho de gradient. Cependant, les artefacts de susceptibilité sont souvent observés dans l’imagerie d’écho de gradient due au SPIO intercellulaire. Dans le protocole actuel, l’emplacement des zones hypointenses représentant les MSC étiquetés SPIO sur les images pondérées en T2 était le même que celui de l’OIP dans les sections cérébrales détectées par l’examen histologique(figure 3). Cela indique la sensibilité adéquate de l’imagerie par écho de spin pondérée par T2 pour le suivi MSC étiqueté SPIO dans le cerveau.
En résumé, le protocole décrit est bénéfique pour les études in vivo de suivi des cellules souches des lésions cérébrales et des troubles. Le suivi longitudinal des cellules souches in vivo a traditionnellement été effectué en sacrifiant des animaux à plusieurs moments. Le protocole actuel fournit une approche non invasive et efficace pour l’administration et le suivi des SSM, ce qui représente une procédure potentielle pour la thérapie à base de cellules souches pour les lésions cérébrales et les troubles dans les milieux cliniques.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le Ministère des subventions du ministère des Sciences et de la Technologie, Taiwan (MOST 104-2923-B-038-004 -MY2, MOST 107-2314-B-038-063, et MOST 107-2314-B-038-042) et Taipei Medical University (TMU 105-AE1-B03, TMU 106-5400-004-400, TMU 106-5310-001-400, DP2-107-21121-01-N-05 et DP2-108-21121-01-N-05-01).
Cell culture supplies (Plastics) | ThermoFisher Scientific | Varies | Replaceable with any source |
Disposable Microtome Blade | VWR | 95057-832 | |
D-MEM/F-12 (1X) with GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | |
Embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | 12662-029 | |
Fluorescence Wild Field Microscope | Olympus | Olympus BX43 | |
Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
Gentamicin (10 mg/mL) | GIBCO | 15710-064 | |
Hair clipper | Pet Club | PC-400 | |
Head Trauma Contusion device | Precision Systems and Instrumentation | Model TBI-0310 | |
Hyaluronidase from bovine testes | MilliporeSigma | H3506 | |
ITK-SNAP Software | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at University of Utah | ITK-SNAP 3.8.0 | |
Ketamine (Ketavet) | Pfizer | 778-551 | |
Mice | National Laboratory Animal Center, Taiwan | C57BL6 | Wild type mice strain used in the study |
Microdrill | Nakanishi | NE50 | Combine with Burrs for generating the bone window |
Microtome | Leica | RM2265 | |
Mouse (C57BL/6) Mesenchymal Stem Cells | GIBCO | S1502-100 | |
MRI scanner | Bruker Biospec | ||
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Corning Cellgro/ThermoFisher | 21-031-CV | |
Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
Prussian Blue Stain | Abcam | ab150674 | |
Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 | |
Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles | BioPAL | Molday ION EverGreen, CL-50Q02-6A-51 | stem cells labeling for in vivo tracking using MRI |
Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
Timer | Wisewind | Replaceable with any source | |
TrypLE | GIBCO | 12604-013 | |
Xylazine (Rompun) | Bayer | QN05 cm92 |