Vi beskriver en tuberkulosemolekylær bakteriell belastningsanalysetest utført etter varmeinaktivering av sputum. Varmeinaktivering gjør sputumprøver ikke-smittsomme og hindrer behovet for inneslutningsnivå 3 laboratorier for tuberkulosemolekylære tester.
Tuberkulose er forårsaket av Mycobacterium tuberculosis (Mtb), et patogen klassifisert av FN (FN) som en farlig kategori B biologisk stoff. Av hensyn til arbeidernes sikkerhet må håndtering av alle prøver som antas å bære Mtb utføres i et inneslutningsnivå (CL) 3-laboratorium. TB molekylær bakteriell belastninganalyse (TB-MBLA) test er en omvendt transkripsjonase kvantitativ polymerase kjedereaksjon (RT-qPCR) test som kvantifiserer Mtb bacillary belastning ved hjelp av primere og dual-merkede sonder for 16S rRNA. Vi beskriver bruken av varmeinaktivering for å gjøre TB-prøver ikke-smittsomme samtidig som vi beholder RNA for TB-MBLA. En 1 ml aliquot av sputumprøven i tett lukkede 15 ml sentrifugerør kokes i 20 min ved enten 80 °C, 85 °C eller 95 °C for å deaktivere Mtb bacilli. Dyrking av varmeinaktiverte og kontroll (levende) prøver i 42 dager bekreftet dødsfallet til TB. Den inaktiverte prøven blir deretter spiked med 100 μL av ekstraksjonskontrollen og RNA ekstraheres etter standard RNA-isolasjonsprosedyre. Det ble ikke observert noen vekst i kulturer av varmebehandlede prøver. Den isolerte RNA er utsatt for sanntid RT-qPCR, som forsterker et bestemt mål i Mtb 16S rRNA genet, noe som gir resultater i form av kvantifisering sykluser (Cq). En standardkurve brukes til å oversette Cq til bakteriell belastning, eller estimertkoloniformingsenheter per ml (eCFU/ml). Det er et omvendt forhold mellom Cq og bakteriell belastning av en prøve. Begrensningen er at varmeinaktivering lyser noen celler, utsette RNA for RNases som forårsaker tap av <1 logg10eCFU/ml (dvs. <10 CFU/ml). Videre studier vil avgjøre andelen svært lav byrde pasienter som forårsaker falske negative resultater på grunn av varmeinaktivering.
Forårsaket av Mycobacterium tuberculosis (Mtb), over 7 x 106 nye tilfeller av tuberkulose (TB) rapporteres globalt hvorav over 1 x 106 dør per år1,2. For å reversere trenden lanserte Verdens helseorganisasjon (WHO) en tre-søyle tilnærming, inkludert utvikling av effektive diagnostiske og behandlingsverktøy3. Klassifisert som et farlig biologisk stoff B av FN, krever arbeid med prøver som antas positivt for Mtb et inneslutningsnivå (CL) på 3. CL3 laboratorier er dyre å bygge og vedlikeholde. Derfor har de fleste land sentralisert tb kulturtjenester på regionalt eller nasjonalt nivå. Dette betyr at smøremikroskopi er det mest tilgjengelige diagnostiske verktøyet i de perifere helsefasilitetene.
Det er WHO godkjenning for å implementere raske molekylære tester som Xpert MTB / RIF på nivå 4 helseinstitusjoner, for det meste ligger på distriktsnivå4,5. Noen distrikter er ganske store og mindre tilgjengelige for noen mennesker. Mens gunstig, Xpert MTB / RIF fungerer ved å oppdage Mtb DNA. DNA er et stabilt molekyl som overlever lenge etter at cellene har dødd, og er dermed ikke en god standard for måling av levedyktige celler som er kritiske for overvåking av behandlingsrespons5,6. RNA-baserte analyser tilbyr et alternativ for nøyaktig måling av levedyktige celler7,,8,9,10,11,12,13. RNA finnes i forskjellige arter av varierende stabilitet: ribosomal RNA (rRNA), overføring RNA (tRNA) og messenger RNA (mRNA). Messenger RNA er forbundet med genuttrykk og dermed den mest nært forbundet med celleaktivitet og levedyktighet14. Det er viktig å merke seg at fravær av genuttrykk ikke tilsvarer celledød fordi patogener som Mtb er kjent for å eksistere i inaktive (sovende), men levedyktige tilstander15,16. Stabile RNA-arter som rRNA er derfor bedre markører for både aktive og inaktive tilstander av levedyktige celler.
Ved hjelp av Escherichia coliviste Sheridan at 16S rRNA proporsjonalt økt med bakteriell vekst målt ved kolonidannende enheter (CFU) teller17. Det var en samtidig nedgang i CFU-tellinger og 16S rRNA da E. coli-bakterier ble utsatt for antibiotika. Fallet i rRNA etter celledød var en indikator på at den kunne brukes som markør for cellelevedyktighet13,17. Tegning fra dette prinsippet, TB molekylær bakteriell belastning analyse (TB-MBLA) ble utviklet for målretting M. tuberkulose 16S rRNA å måle levedyktig TB bacillary belastning som en markør for behandlingsrespons for pasienter på anti-TB terapi11,18,19. Vi har videreutviklet og optimalisert TB-MBLA for å innlemme en cellulær ekstraksjonskontroll som reflekterer lysis av M. tuberkulose bacilli og er robust i ulike miljømiljøer20. TB-MBLA-prosedyren krever at de første trinnene i RNA-isolasjon fra Mtb utføres i et CL3-laboratorium til Mtb-cellene er helt lysed for å sikre arbeidernes sikkerhet. Det inkluderer også prøvebevaring for retrospektiv batched analyse som skal opprettholdes ved -80 °C i guanidin tiocyanat, et nivå 4 giftig stoff. For dette formål har vi brukt varme til å inaktivere Mtb og gjøre prøver trygge for TB-MBLA som skal utføres i smøremikroskopinivålaboratorier.
Bruk av varme i laboratorie- og kliniske applikasjoner har eksistert i århundrer21,,22. Imidlertid er noen mikroorganismer som Mtb vanskelig å drepe, og kortere eksponering for varme er utilstrekkelig til å drepe alle cellene23,24. En studie viste at 20 min oppvarming av TB kulturer på 80 °C drepte alle Mtb bacilli uten å ødelegge DNA som trengs for PCR25. Deretter varmes en rekke laboratorie-DNA-ekstraksjonsteknikker for tiden til 95 °C. Vi har brukt det samme prinsippet for å vise at kokende TB-prøver ved enten 80 °C, 85 °C eller 95 °C inaktiverer Mtb samtidig som det bevares tilstrekkelig RNA for tb-MBLA som skal utføres. Inaktivert kultur eller sputum kan opprettholdes i tett lukkede beholdere ved romtemperatur eller nedkjølt i 7 dager uten å redusere mengden kvantifiserbar rRNA.
TB-MBLA, som for tiden brukes som en forskningsbrukstest (RUO) er tilpasningsdyktig og har blitt brukt på forskjellige prøvetyper, inkludert sputum, lungevev og cerebral spinalvæske. Det er ennå ikke brukt på bronkial alveolær væske, blod og andre prøvetyper. Ved hjelp av sputum som prøve, resultater fra multisite evaluering i Afrika (upubliserte data) og tidligere publikasjoner18,26 viser at følsomheten til MBLA er i samsvar med mycobacterium vekst indikatorrør (MGIT) flytende kultur. TB-MBLA er imidlertid raskere, noe som gir resultater i timer i motsetning til dager eller uker med kultur, spesifikke, ikke påvirket av ikke-TB mikroorganismer i prøven, og gir et kvantitativt mål på sykdomsalvorlighetsgrad. WHO har nylig anerkjent TB-MBLA som en kandidat til å erstatte smøremikroskopi og kultur for overvåking av TB-behandling2.
I denne artikkelen beskriver vi i detalj varmeinaktivering og TB-MBLA-protokollen publisert i Sabiiti et al.27. Denne detaljerte protokollen vil gi en one-stop visuell ressurs for TB-MBLA-brukere over hele verden.
Denne artikkelen viser at varmebehandling i 20 min ved 80 °C, 85 °C og 95 °C inaktiverer tuberkuloseprøver effektivt, noe som gjør det mulig for TB-MBLA å bli utført i et ikke-CL3-anlegg uten risiko for infeksjon hos laboratoriearbeidere. Funnene bekrefter observasjoner gjort i tidligere studier mens de står i kontrast til noen om effektiviteten av varmeinaktivering av Mtb25,30. For eksempel indikerer noen rapporter at oppvarming ved 80 °C ikke er effektiv på høye bacillary lastprøver25,31,32,33. Den høytetthets inoculum effekten ble unngått i vår studie ved å sikre at alle sputum og rene kulturer ble oppvarmet på en 1 ml volum per 15 ml sentrifuge rør gir tilstrekkelig plass til å utsette alle deler av prøven til koking27.
RNA-bevaring etter varmeinaktivering gjør det mulig for TB-MBLA å bli utført. Dette funnet er enig med to studier som viste RNA bevaring etter varmeinaktivering12,34. Vi viste at RNA i varmeinaktiverte prøver er stabil ved 37 °C i 4 dager, noe som tyder på at laboratorier kan batchtester ved å opprettholde inaktiverte prøver ved romtemperatur i en uke. Ved å bruke RNA-ekstraksjonssett som krever kjøling eller frysing, hindrer evnen til å opprettholde varmeinaktiverte prøver ved romtemperatur behovet for både kjølekjede og kategori 3 laboratorier for å utføre TB-MBLA i ressursbegrensede innstillinger.
Mindre enn 1log bakteriell belastning gikk tapt ved hjelp av 16S rRNA som en markør. Selv om det var forskjell på levende og varmeinaktivert prøve, er mengden tapt for varmeinaktivering for liten til å kompromittere nedstrøms resultater. Økende temperatur økte ikke mengden RNA tapt, noe som tyder på at det observerte tapet er uavhengig av varmebehandlingen. Varmebehandling ved høye temperaturer forårsaker mest sannsynlig cellelyse, utsette RNA for nedbrytning av RNases. Faktisk økte eksogene tillegg av RNase A til varmeinaktivert fraksjon frekvensen av RNA nedbrytning. Koking reduserte ikke aktiviteten til RNase, noe som antyder at det er et veldig motstandsdyktig protein.
Det er viktig å merke seg at en gjennomsnittlig RNA-nedbrytning på 1,5 log10 eCFU/ml ikke er et stort tap. For dette formål hypoteser vi at oppvarming lysers en liten andel av Mtb bacilli, og dermed utsette en liten mengde RNA til RNase. Ved hjelp av TEM viste vi at Mtb celle morfologi og integritet av celleveggene er neppe påvirket av oppvarming ved 95 °C. Dette betyr at det kan kreve ulike fysiologiske faktorer og tilstrekkelig tilførsel av RNases som i verten for å betydelig forringe RNA35,36. Videre, å være en strukturell ribosom, 16S rRNA er potensielt mindre utsatt for RNase37,38. En enkelt Mtb celle inneholder ~ 700 ribosomer / 0,1 mm3 av cytoplasma37, noe som tyder på at det er høyere mengder rRNA per celle. Dermed kan mindre mengder RNase ha en mindre innvirkning38. Eksistensen av høyt antall ribosomer gir en fordel for TB-MBLA når det gjelder følsomhet og evne til å oppdage lavbyrde TB-pasienter.
Det var en sterk sammenheng mellom bakteriell belastning målt ved TB-MBLA og MGIT kultur TTP. Dette bekrefter bakteriell belastning som driver av kulturpositivitet til en viss grad. Fordelen med TB-MBLA er imidlertid at den direkte kvantifiserer bacillary belastning som finnes i prøven og ikke krever Mtb cellespredning før deteksjon. Dette står i kontrast til kultur hvis tid til positivitet avhenger av nivået av bakteriell belastning og hastigheten på Mtb cellespredning. Fremtidige studier vil evaluere TB-MBLA-arbeidsflyten, inkludert varmeinaktivering, i rutinemessige kliniske omgivelser. Studien vil også utforske prøver med en rekke bakterielle belastninger for å forstå antallet som kan endres fra positiv til negativ (dvs. de med færre bakterier etter varmeinaktivering).
TB-MBLA-protokollen for molekylær kvantifisering av bakteriell belastning er den første av sitt slag i bakteriologi. Metoden kvantifiserer direkte Mtb bacillary belastning fra pasient sputum og krever ingen kultur for å gjøre det. Dette gjør det raskere og øker potensialet til å informere en klinisk beslutning om pasientens fremgang. Varmeinaktiveringstrinnet reduserer risikoen for infeksjon og øker anvendelsen av TB-MBLA i innstillinger som ikke har et kategori 3-laboratorium. Etter varmeinaktivering av prøven er det tre protokolltrinn for å oppnå TB-MBLA-resultater: RNA-ekstraksjon, revers transkripsjonase (RT)-qPCR og qPCR-resultatanalyse.
Jo høyere effektivitet for å isolere Mtb RNA fra en pasientprøve, desto høyere kvalitet på resultatene. Det er viktig å merke seg at kvaliteten på sputumprøven påvirker mengden RNA isolert. For eksempel anses spyttsputum av lav kvalitet og har vært forbundet med lav bacillary belastning. Dette betyr at opplæring av pasienten for kvalitetssputumexpectorasjon er viktig. For å vurdere effektiviteten av utvinningsprosessen, er en ekstraksjonskontroll (dvs. det kjente antallet ikke-Mtb-celler) spiked inn i prøven før RNA-ekstraksjon. Henting av ekstraksjonskontrollen bekrefter effektiviteten av RNA-utvinningsprosessen. RNA-isolasjonsprosessen kan ikke være gyldig med mindre ekstraksjonskontrollen er hentet. Gitt det faktum at Mtb er en spenstig organisme gjør mekanisk lysis en avgjørende del av prosessen. Homogenisering av prøven ved høy hastighet (600 rpm) i nærvær av perler (dvs. lysing matrise) effektivt lyser cellene. Rensing av lysatgir et ekstrakt som inneholder både RNA og DNA. Fjerning av DNA er et avgjørende siste trinn i RNA-utvinningen. TB-MBLA har som mål å måle levedyktig bacilli ved å kvantifisere RNA. Dermed betyr unnlatelse av å fjerne genomisk DNA at resultatene vil ha et signal fra DNA, som ikke er en god markør for cellelevedyktighet6.
RT-qPCR er en tosidig kjøring av doble merkede sonder for Mtb og ekstraksjonskontroll. Det innebærer tre trinn: 30 min omvendt transkripsjon ved omvendt transkripsjon ved 50 °C, 15 min denaturering ved 95 °C og 40 sykluser med forsterkning ved 94 °C og 60 °C. Oppkjøp av fluorescens fra sondene skjer ved 60 °C (dvs. fragmentforlengelsesstadiet). Det er viktig å merke seg at TB-MBLA er optimalisert ved hjelp av en bestemt qPCR-maskin, slik at operatører som bruker andre qPCR-plattformer, bør optimalisere betingelsene for utstyret sitt. Effektiviteten av DNA-fjerning styres ved å kjøre en enkelt reaksjon per prøve i fravær av RT. Et positivt resultat fra denne reaksjonen betyr ufullstendig fjerning av DNA. Høye byrdeprøver som har store mengder DNA kan kreve dobbelt så mye mengde DNase-enzym for å fjerne DNA fullstendig. Heldigvis, i høye bacillary lastprøver, er tilstedeværelsen av små mengder DNA mindre sannsynlig å påvirke resultatet fra RNA. Ribosomal RNA, TB-MBLA-målet, forekommer naturlig i dobbelt så stor mengde DNA37. I PCR, en ingen mal kontroll (NTC), som er vannet som brukes til å oppløse PCR reagenser, kontroller for krysskontaminering med eksogene DNA eller RNA. Et positivt signal i NTC innebærer krysskontaminering og resultatet anses som ugyldig. Dette betyr at alle løsninger som utgjorde bruk av dette vannet må kastes og nye må gjøres ved hjelp av et friskt hetteglass med vann. Det anbefales å holde PCR vann i separate aliquots for å unngå forurensning av alt vannet. En positiv kontroll (Mtb RNA) brukes til å kontrollere for den generelle effektiviteten til PCR.
Resultatanalyse innebærer konvertering av PCR Cqs til bakteriell belastning (dvs. de estimerte kolonidannende enhetene per ml) ved hjelp av standardkurven. Innstilling og optimalisering av standardkurven er avgjørende for dette trinnet. En standard kurveeffektivitet på 0,95–1 anbefales. Standardkurver for MTb og ekstraksjonskontroll bør settes opp og optimaliseres før pasienter eller andre testprøver kjøres på maskinen. Standardprøver følger med TB-MBLA-settet. En tigangers fortynning av RNA-ekstraktet anbefales for PCR. Dette innebærer at bakterielastresultatet må multipliseres med en faktor på 10 for å oppnå det endelige bakterielastresultatet per ml. Det er viktig å merke seg at Cqs over 30 anses som negative for TB-MBLA. Minst to potensielle bakterielle belastningsresultater målt på forskjellige tidspunkter er nødvendig for å gjøre en slutning på behandlingsrespons. Det anbefales sterkt at ett av de to resultatene bør være baseline, før behandlingsstart. Men hvis pasienten initierte bakteriell belastningsvurdering oppstår midtveis gjennom behandlingen, må det være en andre gangspunkt bakteriell belastningsmåling for å evaluere behandlingsresponsen. TB-MBLA kan skille bakteriell belastning i et rom på 3 dager på behandling, men idealet er to bakterielle belastningsmålinger tatt 7 dager fra hverandre.
Selv om protokollen genererer informative kvantitative resultater for behandlingsrespons, er den fortsatt i stor grad manuell og krever betydelige hender i tide for RNA-ekstraksjon. Teknikere i travle laboratorier har kanskje ikke denne gangen. Det pågår ordninger for å automatisere RNA-ekstraksjonen og PCR-prosessene.
The authors have nothing to disclose.
Studien ble gjort mulig ved finansiering fra European and Developing Countries Clinical Trials Partnership (EDCTP) – Pan African Biomarker Expansion program (PanBIOME) grant SP.2011.41304.008. Støtte ble også innhentet University of St Andrews School of Medicine forskningsstipend. Utgivelsen av dette manuskriptet og TB-MBLA-protokollen som en visuell ressurs har blitt gjort mulig ved finansiering fra Scottish Funding Council og Global Challenges Research Fund til University of St Andrews. Takket være Maputo Maternal sykehus og Mavalane Health Centre som ga de kliniske sputumprøvene, og Maputo Tuberculosis Treatment Unit-teamet som hjalp til med varmeinaktiveringsforsøkene til kliniske sputumprøver.
Heat inactivation: | |||
15 mL Centrifuge tubes | Fisher-Scientific | 10136120 | 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved |
15 mL Wire Tube rack | Fisher-Scientific | 11749128 | Other brands with similar make can be used |
Water bath | Fisher-Scientific | 15700619 | Other brands with similar make can be used |
RNA extraction: | |||
Chloroform | Sigma | 372978-1L | Not necessary in other RNA extraction kit brands |
Ethanol, absolute 99-100% | Sigma | 51976-500ML-F | Larger volume available |
Extraction control | SOI group St Andrews | VitalbacteriaEC | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit |
FASTRNA Pro blue Kit | MP Biomedicals | 116025050 | Supplied with lysing matrix tubes |
Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Qiagen, Fisherscientific can also supply same product |
Precellys 24 homogeniser | VWR | 432-3750 | FastPrep MP Biomedicals can be used too |
Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus | Fisher-Scientific | 15352117 | Other brands with similar capacity can be used |
Thermomixer | Eppendorf | BLD-455-010C | Works with 1-2 mL tubes |
TURBO DNA-free | Fisher-Scientific | AM1907M | Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures. |
RT-qPCR: | |||
Primers and Taqman probes | SOI group St Andrews | VitalbacteriaPP | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX. |
QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit | Qiagen | 204845 | PCR mix plus the RT enzyme |
RotorGene Q 5plex machine | Qiagen | 9001580 | Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc can be used |
Strip Tubes and Caps, 0.1 ml | Qiagen | 981103 | Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed. |
Non-heat inactivation Sample preservation materials | |||
1M Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | 93313 | Supplied ready to use |
2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Many competent suppliers |
Guanidine thiocyanate (GTC) | Promega | V2791 | Promega brand recommended for quality |
Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Ensures that GTC solution is free of nucleases |
General materials (used but not specific to TB-MBLA) | |||
500 mL plastic containers | 734-5087 | Nalgene brand recommeded | |
Biological waste discard jars | Many competent suppliers | ||
Chemical waste discard jars | Many competent suppliers | ||
Disposable gloves, chemical resistant | Many competent suppliers | ||
Freezer (-20 °C) | Many competent suppliers | ||
Freezer (-80 °C) | Many competent suppliers | ||
Fridge (0-8 °C) | Many competent suppliers | ||
Fume hood | For safe handling of toxic reagents | ||
Laboratory scales | For accurate measurement of reagents | ||
Measuring cylinders, plastic | To ensure accurate measurement of reagents | ||
PCR reaction tubes | Should be suitable to the PCR instrument used | ||
Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, | DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended | ||
Qiagility loading plates | Qiagen | 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates | |
QIAgility Pipetting Robot | Qiagen | Important for high throughput pipetting | |
Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes | Chemical-resistant and autoclavable recommended | ||
RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) | Fisher Scientific | 10666421 | Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme |
Safety goggles, chemical resistant | Fisher Scientific | Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents. | |
Sterile Pasteur pipettes, 1.5 mL – 3 mL | Many competent suppliers | ||
Sterile RNAse-free microtubes | 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended | ||
TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse | Ensure it is freshly prepared or prepared within a week | ||
Vortex | Genie 2 brand recommended | ||
Transmission electron microscopy | |||
Glutaldehyde (8%) | Sigma | G7526-10ML | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
HEPES (pH 7.4, 100 mM) | Sigma | H4034-25G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
Leica FCS ultracryo | Leica | Cryomicrotome for tissue sectioning | |
Methyl cellulose | Agar Scientific | AGG6425 | Cold mounting resin |
Paraformaldehyde (4% in PBS) | Sigma | P6148-500G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
Sucrose | Sigma | 84097-250G | Preservation and mounting medium |
Uranyl acetate | Agar Scientific | AGR1260A | Universal Electron microscopy stain |