Vi beskriver en tuberkulos molekylära bakteriella belastningsanalys test utförs efter värme inaktivering av sputum. Värmeinaktivering gör sputumprover icke-infektiösa och undanröjer behovet av inneslutningsnivå 3 laboratorier för tuberkulos molekylära tester.
Tuberkulos orsakas av Mycobacterium tuberkulos (Mtb), en patogen som klassificeras av FN (FN) som en farlig kategori B biologiskt ämne. För arbetstagarnas säkerhet skall hanteringen av alla prover som antas bära Mtb utföras i ett laboratorium för inneslutningsnivå (CL) 3. Tb molekylär bakteriell belastningsanalys (TB-MBLA) test är en omvänd transkriptas kvantitativ polymeras kedjereaktion (RT-qPCR) test som kvantifierar Mtb bacillary belastning med hjälp av grundfärger och dual-märkta sonder för 16S rRNA. Vi beskriver användningen av värme inaktivering för att göra TB prover noninfectious samtidigt som RNA för TB-MBLA. En 1 ml alikvot av sputumprovet i tätt tillslutna 15 ml centrifugrör kokas i 20 min vid antingen 80 °C, 85 °C eller 95 °C för att inaktivera Mtb bacilli. Odling av värmeaktiverade och kontroll (levande) prover för 42 dagar bekräftade död TB. Det inaktiverade provet spikas sedan med 100 μL av extraktionskontrollen och RNA extraheras enligt standardinsisoleringsförfarandet för RNA. Ingen tillväxt observerades i kulturerna av värmebehandlade prover. Det isolerade RNA utsätts för rt-qPCR i realtid, vilket förstärker ett specifikt mål i Mtb 16S rRNA-genen, vilket ger resultat i form av kvantifieringscykler (Cq). En standardkurva används för att översätta Cq till bakteriebelastning, eller uppskattade kolonibildande enheter per ml (eCFU/mL). Det finns ett omvänt samband mellan Cq och bakteriebelastningen av ett prov. Begränsningen är att värme inaktivering lyses vissa celler, utsätta RNA för RNases som orsakar en förlust av <1 log10eCFU/mL (dvs., <10 CFU/mL). Ytterligare studier kommer att avgöra andelen mycket låg börda patienter som orsakar falska negativa resultat på grund av värme inaktivering.
Orsakas av Mycobacterium tuberkulos (Mtb), över 7 x 106 nya fall av tuberkulos (TB) rapporteras globalt varav över 1 x 106 dör per år1,2. För att vända trenden lanserade Världshälsoorganisationen (WHO) en strategi med tre pelare, bland annat genom att utveckla effektiva diagnos- och behandlingsverktyg3. Klassificeras som ett farligt biologiskt ämne B av FN, arbetar med prover antas positivt för Mtb kräver en inneslutning nivå (CL) av 3. CL3 laboratorier är dyra att bygga och underhålla. Följaktligen har de flesta länder centraliserade tb-kulturtjänster på regional eller nationell nivå. Detta innebär att smetoskopi är det mest tillgängliga diagnostiska verktyget i de perifera vårdinrättningarna.
Det finns WHO:s godkännande att genomföra snabba molekylära tester som Xpert MTB/RIF på nivå 4 vårdinrättningar, mestadels belägna på distriktsnivå4,,5. Vissa distrikt är ganska stora och mindre tillgängliga för vissa människor. Xpert MTB/RIF fungerar visserligen fördelaktigt genom att detektera Mtb-DNA:t. DNA är en stabil molekyl som överlever långt efter att celler har dött och därför inte är en bra standard för att mäta livskraftiga celler som är kritiska för övervakning av behandlingssvar5,6. RNA-baserade analyser erbjuder ett alternativ för noggrann mätning av livskraftiga celler7,,8,,9,,10,,11,,12,13. RNA finns i olika arter av varierande stabilitet: ribosomal RNA (rRNA), överföring RNA (tRNA) och budbärare RNA (mRNA). Messenger RNA är associerad med genuttryck och därmed den närmast förknippade med cellaktivitet och livskraft14. Det är viktigt att notera att avsaknad av genuttryck inte motsvarar celldöd eftersom patogener som Mtb är kända för att existera i inaktiva (vilande) men livskraftiga stater15,16. Stabila RNA-arter som rRNA är därför bättre markörer för både aktiva och inaktiva tillstånd av livskraftiga celler.
Använda Escherichia coli, Sheridan visade att 16S rRNA proportionellt ökade med bakterietillväxt mätt med koloni bildar enheter (CFU) räknas17. Det fanns en samtidig nedgång i CFU räknas och 16S rRNA när E. coli bakterier exponerades för antibiotika. Nedgången i rRNA efter celldöd var en indikator på att det kunde användas som en markör för cellens livskraft13,17. Med utgångspunkt i denna princip utvecklades tbc-molekylär bakteriell belastningsanalys (TB-MBLA) för att rikta in sig på M. tuberkulos 16S rRNA för att mäta livskraftig TB bacillary-belastning som en markör för behandlingssvar för patienter vid anti-TB-behandling11,18,19. Vi har vidareutvecklat och optimerat TB-MBLA för att införliva en cellulär extraktionskontroll som återspeglar lys av M. tuberkulos bacilli och är robust i olika miljömiljöer20. Tb-MBLA-proceduren kräver att de första stegen av RNA-isolering från Mtb ska utföras i ett CL3-laboratorium tills Mtb-cellerna är helt lysted för att säkerställa arbetstagarnas säkerhet. Det omfattar också provbevarande för retrospektiv batchanalys som skall bibehållas vid -80 °C i guanidintiaocyanat, ett giftigt ämne på nivå 4. För detta ändamål har vi använt värme för att inaktivera Mtb och göra prover säkra för TB-MBLA som ska utföras i smetyrmikroskopi nivå laboratorier.
Användning av värme i laboratorie- och kliniska tillämpningar har funnits i århundraden21,22. Men vissa mikroorganismer som Mtb är svåra att döda, och kortare exponering för värme är otillräcklig för att döda alla celler23,24. En studie visade att 20 min uppvärmning av TB kulturer vid 80 ° C dödade alla Mtb bacilli utan att förstöra DNA som behövs för PCR25. Därefter värmer ett antal laboratorie-DNA-extraktionstekniker för närvarande till 95 °C. Vi har tillämpat samma princip för att visa att kokande tbc-prover vid antingen 80 °C, 85 °C eller 95 °C inaktiverar Mtb samtidigt som tillräckligt med RNA för tbc-MBLA bevaras. Inaktiverad odling eller sputum kan hållas i tätt tillslutna behållare vid rumstemperatur eller förvaras i kylskåp i 7 dagar utan att minska mängden kvantifierbar rRNA.
TB-MBLA, som för närvarande används som forskningsanvändning endast (RUO) test är anpassningsbar och har tillämpats på olika provtyper inklusive sputum, lungvävnad och cerebral spinal vätska. Det är ännu inte tillämpas på bronkial alveolar vätska, blod, och andra provtyper. Med hjälp av sputum som prov visar resultaten från multisiteutvärdering i Afrika (opublicerade data) och tidigare publikationer18,26 att känsligheten hos MBLA är förenlig med mycobacterium growth indicator tube (MGIT) flytande kultur. Tb-MBLA är dock snabbare, vilket ger resultat i timmar i motsats till dagar eller veckor av kultur, specifika, inte påverkas av icke-TB mikroorganismer i provet, och ger ett kvantitativt mått på sjukdomens svårighetsgrad. WHO har nyligen erkänt TB-MBLA som en kandidat för att ersätta smetyrmikroskopi och kultur för övervakning tb behandling2.
I den här artikeln beskriver vi i detalj värme inaktivering och TB-MBLA protokoll som publiceras i Sabiiti et al.27. Det här detaljerade protokollet ger en enda visuell resurs för TB-MBLA-användare över hela världen.
Denna artikel visar att värmebehandling i 20 min vid 80 °C, 85 °C och 95 °Caktiverar tuberkulosprover effektivt, vilket gör det möjligt att effektivt utföra TB-MBLA på en anläggning som inte är CL3 utan risk för infektion för laboratoriearbetare. Resultaten bekräftar observationer som gjorts i tidigare studier samtidigt som man kontrasterar mot vissa om effektiviteten av värme inaktivering av Mtb25,30. Vissa rapporter visar till exempel att uppvärmning vid 80 °C inte är effektivt på hög bacillarylastprover 25,31,,32,33. Den högdensitetsinokulat effekt undveks i vår studie genom att se till att alla sputum och rena kulturer värmdes upp med en 1 ml volym per 15 ml centrifugröret vilket ger tillräckligt utrymme för att utsätta varje del av provet till kokning27.
RNA-konservering efter värme inaktivering gör det möjligt att utföra TB-MBLA. Detta fynd överensstämmer med två studier som visade RNA-bevarande efter värme inaktivering12,34. Vi visade att RNA i värme inaktiverade prover är stabil vid 37 °C i 4 dagar, vilket innebär att laboratorier kan batch tester genom att upprätthålla inaktiverade prover vid rumstemperatur i en vecka. Genom att använda RNA-extraktionssatser som kräver kylning eller frysning, undanröjer förmågan att upprätthålla värme inaktiverade prover vid rumstemperatur behovet av att både kallkedjan och kategori 3-laboratorier utför TB-MBLA i resursbegränsade inställningar.
Mindre än 1log bakteriell belastning förlorades med 16S rRNA som markör. Även om det fanns en skillnad mellan levande och värme inaktiverat prov, är mängden förlorade till värme inaktivering för liten för att äventyra nedströms resultat. Ökande temperatur ökade inte mängden RNA förlorade, vilket innebär att den observerade förlusten är oberoende av värmebehandlingen. Värmebehandling vid höga temperaturer orsakar sannolikt celllys, utsätta RNA för nedbrytning av RNases. Faktum är att exogena tillägg av RNase A till värmen inaktiverad fraktion ökade graden av RNA nedbrytning. Kokning minskade inte aktiviteten hos RNase, vilket innebär att det är ett mycket motståndskraftigt protein.
Det är viktigt att notera att en genomsnittlig RNA-nedbrytning på 1,5 log10 eCFU/mL inte är en stor förlust. För detta ändamål ser vi till att uppvärmning en liten del av Mtb bacilli, vilket utsätter en liten mängd RNA för RNase. Med hjälp av TEM visade vi att Mtb cell morfologi och integritet cellväggarna knappast påverkas av uppvärmning vid 95 °C . Detta innebär att det kan kräva olika fysiologiska faktorer och tillräcklig tillgång på RNases såsom i värden för att avsevärt försämra RNA35,36. Dessutom är 16S rRNA potentiellt mindre känsligt för RNase37,,38. En enda Mtb cell innehåller ~ 700 ribosomer/0,1 mm3 av cytoplasman37, vilket innebär att det finns större mängder rRNA per cell. Mindre mängder RNase kan således ha en mindre inverkan38. Förekomsten av ett stort antal ribosomer ger en fördel för TB-MBLA när det gäller känslighet och förmåga att upptäcka låg belastning TB patienter.
Det fanns en stark korrelation mellan bakteriell belastning mätt med TB-MBLA och MGIT kultur TTP. Detta bekräftar bakteriebelastning som drivkraft för kultur positivitet i viss utsträckning. Fördelen med TB-MBLA är dock att den direkt kvantifierar bacillary belastning som finns i provet och inte kräver Mtb cellproliferation före detektion. Detta kontrasterar med kultur vars tid till positivitet beror på nivån av bakteriell belastning och graden av Mtb cellproliferation. Framtida studier kommer att utvärdera TB-MBLA-arbetsflödet, inklusive värmeinaktivering, i rutinmässiga kliniska inställningar. Studien kommer också att undersöka prover med en rad bakteriebelastningar för att förstå antalet som kan förändras från positiva till negativa (dvs. de med färre bakterier efter värme inaktivering).
TB-MBLA-protokollet för molekylär kvantifiering av bakteriebelastning är det första i sitt slag i bakteriologi. Metoden kvantifierar direkt Mtb bacillary belastning från patienten sputum och kräver ingen kultur för att göra det. Detta gör det snabbare och ökar dess potential att informera ett kliniskt beslut om patientens framsteg. Värmeaktiveringssteget minskar risken för infektion och ökar tillämpligheten av TB-MBLA i miljöer som inte har ett kategori 3-laboratorium. Efter värmeinaktivering av provet finns det tre protokollsteg för att uppnå TB-MBLA-resultat: RNA-extraktion, omvänd transkriptas (RT)-qPCR och qPCR-resultatanalys.
Ju högre effektivitet isolera Mtb RNA från ett patientprov, desto högre kvalitet på resultaten. Det är viktigt att notera att sputumprovets kvalitet påverkar mängden RNA-isolerat. Till exempel, salivary sputum anses låg kvalitet och har associerats med låg bacillary belastning. Detta innebär att utbildning av patienten för kvalitet sputum expectoration är viktigt. För att bedöma extraktionsprocessens effektivitet spetsas en extraktionskontroll (dvs. det kända antalet icke-Mtb-celler) i provet före RNA-extraktion. Hämtning av extraktionskontrollen bekräftar effektiviteten i RNA-extraktionsprocessen. RNA-isoleringsprocessen kan inte vara giltig om inte extraktionskontrollen har hämtats. Med tanke på att Mtb är en motståndskraftig organism gör mekanisk lys en avgörande del av processen. Homogenisering av provet vid hög hastighet (600 rpm) i närvaro av pärlor (dvs. lysingmatris) lyser effektivt cellerna. Rening av lysate ger ett extrakt som innehåller både RNA och DNA. Avlägsnande av DNA är ett avgörande sista steg i RNA-extraktionen. TB-MBLA syftar till att mäta livskraftig bacill genom att kvantifiera RNA. Således innebär underlåtenhet att ta bort genomiskt DNA att resultaten kommer att ha en signal från DNA, vilket inte är en bra markör för cellens livskraft6.
RT-qPCR är en duplex som kör dubbla märkta sonder för Mtb och extraktionskontroll. Det omfattar tre steg: 30 min omvänd transkription genom omvänd transkriptas vid 50 °C, 15 min denaturering vid 95 °C och 40 förstärkningscykler vid 94 °C och 60 °C. Förvärv av fluorescens från sonderna sker vid 60 °C (dvs. fragmentröjningsstadiet). Det är viktigt att notera att TB-MBLA har optimerats med hjälp av en viss qPCR-maskin, så operatörer som använder andra qPCR-plattformar bör optimera förutsättningarna för sin utrustning. Effektiviteten av DNA-borttagning kontrolleras för genom att köra en enda reaktion per prov i avsaknad av RT. Ett positivt resultat från denna reaktion innebär ofullständigt avlägsnande av DNA. Hög belastning prover som har stora mängder DNA kan kräva dubbla mängden DNase enzym för att helt ta bort DNA. Lyckligtvis, i höga bacillary belastning prover, förekomsten av små mängder DNA är mindre sannolikt att påverka resultatet från RNA. Ribosomal RNA, TB-MBLA målet, förekommer naturligt i dubbelt så mycket DNA37. I PCR, en ingen mall kontroll (NTC), som är det vatten som används för att lösa upp PCR reagenser, kontroller för korskontaminering med exogena DNA eller RNA. En positiv signal i NTC innebär korskontaminering och resultatet anses ogiltigt. Detta innebär att alla lösningar som utgörs av detta vatten måste kasseras och nya göras med hjälp av en färsk flaska vatten. Det är lämpligt att hålla PCR vatten i separata alikvoter för att undvika förorening av allt vatten. En positiv kontroll (Mtb RNA) används för att kontrollera den totala effektiviteten i PCR.
Resultatanalys innebär omvandling av PCR Cqs till bakteriebelastning (dvs. den uppskattade kolonin bildar enheter per ml) med hjälp av standardkurvan. Att ställa in och optimera standardkurvan är avgörande för detta steg. En standardkurva effektivitet på 0,95-1 rekommenderas. Standardkurvor för MTb och extraktionskontroll bör ställas in och optimeras innan patienter eller andra testprover körs på maskinen. Standardprover är försedda med TB-MBLA-satsen. En tiofaldig utspädning av RNA-extraktet rekommenderas för PCR. Detta innebär att resultatet för bakteriebelastningen måste multipliceras med en faktor på 10 för att erhålla det slutliga bakteriebelastningsresultatet per ml. Det är viktigt att notera att Cqs över 30 anses vara negativa för TB-MBLA. Minst två prospektiva bakteriebelastningsresultat som mäts vid olika tidpunkter krävs för att dra en slutsats om behandlingssvar. Det rekommenderas starkt att ett av de två resultaten ska vara baslinjen innan behandlingen påbörjas. Men om patienten inledde bakteriell belastning bedömning sker halvvägs genom behandling, måste det finnas en andra tidpunkt bakteriell belastning mätning för att utvärdera behandlingssvaret. TB-MBLA kan skilja bakteriebelastningen inom 3 dagar på behandling men idealet är två mätningar av bakteriebelastningen som tas med 7 dagars mellanrum.
Medan protokollet genererar informativa kvantitativa resultat för behandling svar, det är fortfarande till stor del manuell och kräver betydande händer i tid för RNA utvinning. Tekniker i upptagna laboratorier kanske inte har den här gången. Arrangemang pågår för att automatisera RNA-extraktions- och PCR-processerna.
The authors have nothing to disclose.
Studien möjliggjordes genom finansiering från European and U Countries Clinical Trials Partnership (EDCTP) – Pan African Biomarker Expansion programme (PanBIOME) grant SP.2011.41304.008. Stöd erhölls också University of St Andrews School of Medicine forskningsanslag. Publiceringen av detta manuskript och TB-MBLA-protokollet som en visuell resurs har möjliggjorts genom finansiering från Scottish Funding Council och Global Challenges Research Fund till University of St Andrews. Tack vare Maputo Maternal hospital och Mavalane Health Centre som tillhandahöll de kliniska sputumproverna, och Maputo Tuberculosis Treatment Unit team som hjälpte till med värmeinaktiveringsexperiment av kliniska sputumprover.
Heat inactivation: | |||
15 mL Centrifuge tubes | Fisher-Scientific | 10136120 | 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved |
15 mL Wire Tube rack | Fisher-Scientific | 11749128 | Other brands with similar make can be used |
Water bath | Fisher-Scientific | 15700619 | Other brands with similar make can be used |
RNA extraction: | |||
Chloroform | Sigma | 372978-1L | Not necessary in other RNA extraction kit brands |
Ethanol, absolute 99-100% | Sigma | 51976-500ML-F | Larger volume available |
Extraction control | SOI group St Andrews | VitalbacteriaEC | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit |
FASTRNA Pro blue Kit | MP Biomedicals | 116025050 | Supplied with lysing matrix tubes |
Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Qiagen, Fisherscientific can also supply same product |
Precellys 24 homogeniser | VWR | 432-3750 | FastPrep MP Biomedicals can be used too |
Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus | Fisher-Scientific | 15352117 | Other brands with similar capacity can be used |
Thermomixer | Eppendorf | BLD-455-010C | Works with 1-2 mL tubes |
TURBO DNA-free | Fisher-Scientific | AM1907M | Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures. |
RT-qPCR: | |||
Primers and Taqman probes | SOI group St Andrews | VitalbacteriaPP | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX. |
QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit | Qiagen | 204845 | PCR mix plus the RT enzyme |
RotorGene Q 5plex machine | Qiagen | 9001580 | Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc can be used |
Strip Tubes and Caps, 0.1 ml | Qiagen | 981103 | Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed. |
Non-heat inactivation Sample preservation materials | |||
1M Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | 93313 | Supplied ready to use |
2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Many competent suppliers |
Guanidine thiocyanate (GTC) | Promega | V2791 | Promega brand recommended for quality |
Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Ensures that GTC solution is free of nucleases |
General materials (used but not specific to TB-MBLA) | |||
500 mL plastic containers | 734-5087 | Nalgene brand recommeded | |
Biological waste discard jars | Many competent suppliers | ||
Chemical waste discard jars | Many competent suppliers | ||
Disposable gloves, chemical resistant | Many competent suppliers | ||
Freezer (-20 °C) | Many competent suppliers | ||
Freezer (-80 °C) | Many competent suppliers | ||
Fridge (0-8 °C) | Many competent suppliers | ||
Fume hood | For safe handling of toxic reagents | ||
Laboratory scales | For accurate measurement of reagents | ||
Measuring cylinders, plastic | To ensure accurate measurement of reagents | ||
PCR reaction tubes | Should be suitable to the PCR instrument used | ||
Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, | DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended | ||
Qiagility loading plates | Qiagen | 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates | |
QIAgility Pipetting Robot | Qiagen | Important for high throughput pipetting | |
Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes | Chemical-resistant and autoclavable recommended | ||
RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) | Fisher Scientific | 10666421 | Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme |
Safety goggles, chemical resistant | Fisher Scientific | Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents. | |
Sterile Pasteur pipettes, 1.5 mL – 3 mL | Many competent suppliers | ||
Sterile RNAse-free microtubes | 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended | ||
TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse | Ensure it is freshly prepared or prepared within a week | ||
Vortex | Genie 2 brand recommended | ||
Transmission electron microscopy | |||
Glutaldehyde (8%) | Sigma | G7526-10ML | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
HEPES (pH 7.4, 100 mM) | Sigma | H4034-25G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
Leica FCS ultracryo | Leica | Cryomicrotome for tissue sectioning | |
Methyl cellulose | Agar Scientific | AGG6425 | Cold mounting resin |
Paraformaldehyde (4% in PBS) | Sigma | P6148-500G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
Sucrose | Sigma | 84097-250G | Preservation and mounting medium |
Uranyl acetate | Agar Scientific | AGR1260A | Universal Electron microscopy stain |