Vi beskriver en tuberkulose molekylær bakteriel belastning assay test udført efter varme inaktivering af spyt. Varmeinaktivering gør spytprøver ikke-infektiøse og overflødiggør behovet for indeslutningsniveau 3 laboratorier for tuberkulose molekylære test.
Tuberkulose er forårsaget af Mycobacterium tuberkulose (Mtb), et patogen klassificeret af Fn (FN) som et farligt biologisk stof i kategori B. Af hensyn til arbejdstagernes sikkerhed skal håndtering af alle prøver, der formodes at bære Mtb, udføres i et indeslutningsniveau (CL) 3 laboratorium. TB molekylære bakterielle belastning assay (TB-MBLA) test er en omvendt transkantificeret polymerase kædereaktion (RT-qPCR) test, der kvantificerer Mtb bakteriebelastning ved hjælp af primere og dobbelt-mærket sonder for 16S rRNA. Vi beskriver brugen af varmeinaktivering til at gøre TB-prøver ikke-infektiøse, samtidig med at RNA bevares for TB-MBLA. En 1 ml aliquot af spytprøven i tætlukkede 15 ml centrifugerør koges i 20 min ved enten 80 °C, 85 °C eller 95 °C for at inaktivere Mtb bacilli. Dyrkning af varmeinaktiverede og kontrol (levende) prøver i 42 dage bekræftede død TB. Den inaktiverede prøve tilsat 100 μL af ekstraktionskontrollen og RNA ekstraheres efter standard-RNA-isolationsproceduren. Der blev ikke observeret vækst i de varmebehandlede prøvers kulturer. Det isolerede RNA udsættes for RT-qPCR i realtid, som forstærker et specifikt mål i Mtb 16S rRNA-genet, hvilket giver resultater i form af kvantificeringscyklusser (Cq). En standardkurve bruges til at oversætte Cq til bakteriebelastning eller estimerede kolonidannende enheder pr. ml (eCFU/ml). Der er en omvendt sammenhæng mellem Cq og den bakterielle belastning af en prøve. Begrænsningen er, at varmeinaktivering lyser nogle celler, udsætter RNA til RNases, der forårsager et tab på <1 log10eCFU/mL (dvs. <10 CFU/mL). Yderligere undersøgelser vil bestemme andelen af patienter med meget lav byrde, der forårsager falske negative resultater på grund af varmeinaktivering.
Forårsaget af Mycobacterium tuberkulose (Mtb), over 7 x 106 nye tilfælde af tuberkulose (TB) er rapporteret globalt, hvoraf over 1 x 106 dør om året1,2. For at vende tendensen lancerede Verdenssundhedsorganisationen (WHO) en tilgang med tre søjler, herunder udvikling af effektive diagnose- og behandlingsværktøjer3. Klassificeret som et farligt biologisk stof B af FN, arbejder med prøver formodes positiv for Mtb kræver en indeslutning niveau (CL) på 3. CL3 laboratorier er dyre at bygge og vedligeholde. Derfor har de fleste lande centraliseret tb-kulturtjenester på regionalt eller nationalt plan. Det betyder, at smear mikroskopi er det mest tilgængelige diagnostiske værktøj i de perifere sundhedsfaciliteter.
Der er WHO’s godkendelse til at gennemføre hurtige molekylære test som Xpert MTB/RIF på niveau 4 sundhedsfaciliteter, for det meste beliggende på distriktsniveau4,5. Nogle distrikter er ret store og mindre tilgængelige for nogle mennesker. Mens gavnlige, Xpert MTB / RIF virker ved at opdage Mtb DNA. DNA er et stabilt molekyle , der overlever længe efter, at cellerne er døde, og som derfor ikke er en god standard for måling af levedygtige celler, der er afgørende for overvågning af behandlingsrespons5,6. RNA-baserede analyser er et alternativ til nøjagtig måling af levedygtige celler7,8,9,10,11,12,13. RNA findes i forskellige arter med varierende stabilitet: ribosomal RNA (rRNA), overførsel RNA (tRNA), og messenger RNA (mRNA). Messenger RNA er forbundet med genekspression og dermed den tættest forbundet med celleaktivitet og levedygtighed14. Det er vigtigt at bemærke, at fravær af genekspression ikke svarer til celledød , fordi patogener som Mtb vides at eksistere i inaktive (hvilende), men levedygtige tilstande15,16. Stabile RNA-arter såsom rRNA er derfor bedre markører for både aktive og inaktive tilstande af levedygtige celler.
Ved hjælp af Escherichia coliviste Sheridan , at 16S rRNA proportionalt steg med bakterievækst målt ved kolonidannende enheder (CFU) tæller17. Der var et samtidig tælling i CFU-tal og 16S rRNA, når E. coli bakterier blev udsat for antibiotika. Faldet i rRNA efter celledød var en indikator for , at det kunne anvendes som markør forcellelevedygtigheden 13,17. Ved at trække på dette princip blev tb molekylære bakterielle belastning assay (TB-MBLA) udviklet til målretning M. tuberkulose 16S rRNA til at måle levedygtige TB bacillary belastning som en markør for behandlingsrespons for patienter på anti-TB behandling11,18,19. Vi har videreudviklet og optimeret TB-MBLA til at indarbejde en cellulær ekstraktionskontrol, der afspejler lysis af M. tuberkulose bacilli og er robust i forskellige miljømæssige indstillinger20. TB-MBLA-proceduren kræver, at de første trin af RNA-isolation fra Mtb udføres i et CL3-laboratorium, indtil Mtb-cellerne er helt lysed for at sikre arbejdstagernes sikkerhed. Den omfatter også konservering af prøver med henblik på retrospektiv batchanalyse, der skal holdes på -80 °C i guanidinthiocyanat, et niveau 4-giftigt stof. Til dette formål har vi brugt varme til at inaktivere Mtb og gøre prøver sikkert for TB-MBLA, der skal udføres i smear mikroskopi niveau laboratorier.
Brug af varme i laboratorie-og kliniske anvendelser har eksisteret i århundreder21,22. Men nogle mikroorganismer som Mtb er svære at dræbe, og kortere udsættelse for varme er utilstrækkelig til at dræbe alle cellerne23,24. En undersøgelse viste, at 20 min opvarmning af TB kulturer ved 80 °C dræbt alle Mtb bacilli uden at ødelægge DNA er nødvendige for PCR25. Efterfølgende opvarmes en række dna-ekstraktionsteknikker i laboratoriet i øjeblikket til 95 °C. Vi har anvendt det samme princip for at vise, at kogende TB-prøver ved enten 80 °C, 85 °C eller 95 °C inaktiverer Mtb, samtidig med at der bevares tilstrækkeligt RNA til at udføre TB-MBLA. Inaktiveret kultur eller spyt kan holdes i tæt lukkede beholdere ved stuetemperatur eller nedkølet i 7 dage uden at reducere mængden af kvantificerbar rRNA.
TB-MBLA, der i øjeblikket anvendes som en forskningsanvendelse (RUO) test er fleksibel og er blevet anvendt til forskellige prøvetyper, herunder spyt, lungevæv, og cerebral spinalvæske. Det er endnu ikke anvendt på bronkialveolær væske, blod, og andre prøvetyper. Ved hjælp af spyt som prøve viser resultater fra multisite evaluering i Afrika (ikke-offentliggjorte data) og tidligere publikationer18,26, at følsomheden af MBLA er i overensstemmelse med mycobacterium vækst indikatorrør (MGIT) flydende kultur. Men, TB-MBLA er hurtigere, hvilket giver resultater i timer i modsætning til dage eller uger af kultur, specifikke, ikke påvirket af ikke-TB mikroorganismer i prøven, og giver et kvantitativt mål for sygdommens sværhedsgrad. WHO har for nylig anerkendt TB-MBLA som en kandidat til at erstatte smøre mikroskopi og kultur til overvågning af TB behandling2.
I denne artikel beskriver vi i detaljer varmen inaktivering og TB-MBLA protokol offentliggjort i Sabiiti et al.27. Denne detaljerede protokol vil give en one-stop visuel ressource for TB-MBLA brugere over hele kloden.
Denne artikel viser, at varmebehandling i 20 min ved 80 °C, 85 °C og 95 °C inaktiverer tuberkuloseprøverne effektivt, hvilket gør det muligt at udføre TB-MBLA på et ikke-CL3-anlæg uden risiko for infektion hos laboratoriearbejdere. Resultaterne bekræfter observationer foretaget i tidligere undersøgelser , mens de står i kontrast til nogle om effektiviteten af varmeinaktivering af Mtb25,30. F.eks. viser nogle rapporter, at opvarmning ved 80 °C ikke er effektiv ved prøver af høj bakteriebelastning25,31,32,33. Den høje massefylde inokulum effekt blev undgået i vores undersøgelse ved at sikre, at alle spyt og rene kulturer blev opvarmet ved en 1 ml volumen pr 15 ml centrifuge rør giver tilstrækkelig plads til at udsætte hver del af prøven til kogning27.
RNA-konservering efter varmeinaktivering gør det muligt at udføre TB-MBLA. Dette fund er i strid med to undersøgelser , der viste RNA-konservering efter varmeinaktivering12,34. Vi viste, at RNA i varmeinaktiverede prøver er stabil ved 37 °C i 4 dage, hvilket indebærer, at laboratorierne kunne batchtest ved at opretholde inaktiverede prøver ved stuetemperatur i en uge. Ved at anvende RNA-ekstraktionssæt, der kræver køling eller frysning, opfylder evnen til at opretholde varmeinaktiverede prøver ved stuetemperatur behovet for, at både kølekæden og kategori 3-laboratorier ne udfører TB-MBLA i begrænsede ressourceindstillinger.
Mindre end 1log bakteriel belastning gik tabt ved hjælp af 16S rRNA som markør. Selv om der var en forskel mellem levende og varme inaktiveret prøve, mængden tabt til varme inaktivering er for lille til at kompromittere downstream resultater. Stigende temperatur øgede ikke mængden af tabt RNA, hvilket betyder, at det observerede tab er uafhængigt af varmebehandlingen. Varmebehandling ved høje temperaturer forårsager sandsynligvis cellelyse, hvilket udsætter RNA for nedbrydning af RNases. Faktisk øgede udefrakommende tilsætning af RNase A til varmen inaktiveret fraktion hastigheden af RNA nedbrydning. Kogning reducerede ikke aktiviteten af RNase, hvilket indebærer, at det er et meget modstandsdygtigt protein.
Det er vigtigt at bemærke, at en gennemsnitlig RNA-nedbrydning på 1,5 log10 eCFU/ml ikke er et stort tab. Til dette formål antager vi, at opvarmning en lille del af Mtb bacilli, og dermed udsætter en lille mængde RNA for RNase. Ved hjælp af TEM viste vi, at Mtb celle morfologi og integritet af cellevæggene er næppe påvirket af opvarmning ved 95 °C. Det betyder , at det kan kræve forskellige fysiologiske faktorer og tilstrækkelig forsyning af RNases såsom i værten til væsentligt nedbrydeRNA35,36. Desuden er en strukturel ribosom, 16S rRNA er potentielt mindre modtagelige for RNase37,38. En enkelt Mtb celle indeholder ~ 700 ribosomer/0,1 mm3 af cytoplasma37,hvilket indebærer, at der er større mængder af rRNA per celle. Således kan mindre mængder af RNase have en mindre virkning38. Tilstedeværelsen af et stort antal ribosomer giver TB-MBLA en fordel med hensyn til følsomhed og evne til at opdage patienter med lav byrde.
Der var en stærk sammenhæng mellem bakteriel belastning målt ved TB-MBLA og MGIT kultur TTP. Dette bekræfter bakteriel belastning som føreren af kultur positivitet til en vis grad. Fordelen ved TB-MBLA er imidlertid, at det direkte kvantificerer den bakiliære belastning, der er til stede i prøven, og ikke kræver Mtb-celleproliferation før påvisning. Dette står i kontrast til kultur, hvis tid til positivitet afhænger af niveauet af bakteriel belastning og hastigheden af Mtb celleproliferation. Fremtidige undersøgelser vil evaluere TB-MBLA arbejdsgangen, herunder varme inaktivering, i rutinemæssige kliniske indstillinger. Undersøgelsen vil også undersøge prøver med en række bakterielle belastninger for at forstå det antal, der kan ændre sig fra positiv til negativ (dvs. dem med færre bakterier efter varme inaktivering).
TB-MBLA-protokollen for molekylær kvantificering af bakteriebelastningen er den første af sin art i bakteriologi. Metoden kvantificerer direkte Mtb-bakteriebelastningen fra patientspyt og kræver ingen kultur at gøre det. Dette gør det hurtigere og øger dens potentiale til at informere en klinisk beslutning om patientens fremskridt. Varmeinaktiveringstrinnet reducerer risikoen for infektion og øger anvendeligheden af TB-MBLA i indstillinger, der ikke har et kategori 3-laboratorium. Efter varmeinaktivering af prøven er der tre protokoltrin til at opnå TB-MBLA-resultater: RNA-ekstraktion, omvendt transkriptase (RT)-qPCR og qPCR-resultatanalyse.
Jo højere effektiviteten af isolering af Mtb RNA fra en patientprøve, jo højere kvalitet af resultaterne. Det er vigtigt at bemærke, at kvaliteten af spytprøven påvirker mængden af RNA isoleret. For eksempel betragtes spytspyt spyt spyt sputum som lav kvalitet og har været forbundet med lav bacillary belastning. Det betyder, at det er vigtigt at uddanne patienten til kvalitetssputumexpectoration. For at vurdere ekstraktionsprocessens effektivitet tilsættes der en ekstraktionskontrol (dvs. det kendte antal ikke-Mtb-celler) i prøven før RNA-ekstraktion. Udtagning af ekstraktionskontrollen bekræfter effektiviteten af RNA-ekstraktionsprocessen. RNA-isolationsprocessen kan ikke være gyldig, medmindre ekstraktionskontrollen er hentet. I betragtning af, at Mtb er en modstandsdygtig organisme gør mekanisk lysis en afgørende del af processen. Homogenisering af prøven ved høj hastighed (600 rpm) ved tilstedeværelse af perler (dvs. lysing matrix) effektivt lyser cellerne. Rensning af lysatet giver et ekstrakt, der indeholder både RNA og DNA. Fjernelse af DNA er et afgørende sidste skridt i RNA-ekstraktionen. TB-MBLA har til formål at måle levedygtige bacilli ved at kvantificere RNA. Således, manglende fjernelse genomisk DNA betyder, at resultaterne vil have et signal fra DNA, som ikke er en god markør for celle levedygtighed6.
RT-qPCR er en duplex, der kører dobbeltmærkede sonder til Mtb og sudsugningskontrol. Det omfatter tre trin: 30 min omvendt transskription ved omvendt transkriptase ved 50 °C, 15 min denaturering ved 95 °C og 40 cyklusser af forstærkning ved 94 °C og 60 °C. Erhvervelse af fluorescens fra sonderne sker ved 60 °C (dvs. fragmentetforlængelsesstadiet). Det er vigtigt at bemærke, at TB-MBLA er blevet optimeret ved hjælp af en bestemt qPCR-maskine, så operatører, der bruger andre qPCR-platforme, bør optimere forholdene for deres udstyr. Effektiviteten af DNA-fjernelse kontrolleres ved at køre en enkelt reaktion pr. prøve i mangel af RT. Et positivt resultat af denne reaktion betyder ufuldstændig fjernelse af DNA. Høj byrde prøver, der har store mængder af DNA kan kræve dobbelt så meget DNase enzym til helt at fjerne DNA. Heldigvis, i høj bacillary belastning prøver, tilstedeværelsen af små mængder af DNA er mindre tilbøjelige til at påvirke resultatet fra RNA. Ribosomal RNA, TB-MBLA målet, forekommer naturligt i dobbelt så meget DNA37. I PCR, en no template control (NTC), som er det vand, der anvendes til at opløse PCR reagenser, kontrol for krydskontaminering med udefrakommende DNA eller RNA. Et positivt signal i NTC indebærer krydskontaminering og resultatet betragtes som ugyldigt. Det betyder, at alle løsninger, der er sammensat ved hjælp af dette vand, skal kasseres, og at nye er fremstillet med et friskt glas vand. Det er tilrådeligt at holde PCR vand i separate aliquots for at undgå forurening af alt vandet. En positiv kontrol (Mtb RNA) bruges til at kontrollere for den samlede effektivitet af PCR.
Resultatanalyse indebærer omdannelse af PCR Cqs til bakteriebelastning (dvs. de anslåede kolonidannende enheder pr. ml) ved hjælp af standardkurven. Indstilling og optimering af standardkurven er afgørende for dette trin. En standardkurveeffektivitet på 0,95-1 anbefales. Standardkurver for MTb og ekstraktionskontrol skal opsættes og optimeres, før patienter eller andre testprøver køres på maskinen. Standardprøver leveres med TB-MBLA-sættet. En tigangefortynding af RNA-ekstraktet anbefales til PCR. Dette indebærer, at resultatet af bakteriebelastningen skal ganges med en faktor på 10 for at opnå det endelige resultat for bakteriebelastning pr. ml. Det er vigtigt at bemærke, at Cqs over 30 betragtes som negative for TB-MBLA. Der kræves mindst to prospektive resultater af bakteriebelastningen målt på forskellige tidspunkter for at foretage en konklusion om behandlingsrespons. Det anbefales på det kraftigste, at et af de to resultater skal være baseline, før behandlingen påbegyndes. Men hvis patienten påbegyndt bakteriel belastning vurdering sker midtvejs gennem behandlingen, skal der være en anden gang punkt bakteriel belastning måling for at evaluere behandlingsrespons. TB-MBLA kan skelne bakteriel belastning i et rum på 3 dage på behandling, men det ideelle er to bakterielle belastning målinger taget 7 dage fra hinanden.
Mens protokollen genererer informative kvantitative resultater for behandlingsrespons, er den stadig i vid udstrækning manuel og kræver betydelige hænder til tiden for RNA-ekstraktion. Teknikere i travle laboratorier har måske ikke denne gang. Der er planer om at automatisere RNA-ekstraktions- og PCR-processerne.
The authors have nothing to disclose.
Undersøgelsen blev muliggjort ved finansiering fra European and Developing Countries Clinical Trials Partnership (EDCTP) – Pan African Biomarker Expansion program (PanBIOME) grant SP.2011.41304.008. Støtte blev også opnået University of St Andrews School of Medicine forskningslegat. Offentliggørelsen af dette manuskript og TB-MBLA protokol som en visuel ressource er blevet muliggjort af finansieringen fra Scottish Funding Council og Global Challenges Research Fund til University of St Andrews. Takket være Maputo Maternal hospital og Mavalane Health Centre, som leverede de kliniske spytprøver, og Maputo Tuberkulose Behandling Unit team, der hjalp med varmen inaktivering eksperimenter af kliniske spyt prøver.
Heat inactivation: | |||
15 mL Centrifuge tubes | Fisher-Scientific | 10136120 | 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved |
15 mL Wire Tube rack | Fisher-Scientific | 11749128 | Other brands with similar make can be used |
Water bath | Fisher-Scientific | 15700619 | Other brands with similar make can be used |
RNA extraction: | |||
Chloroform | Sigma | 372978-1L | Not necessary in other RNA extraction kit brands |
Ethanol, absolute 99-100% | Sigma | 51976-500ML-F | Larger volume available |
Extraction control | SOI group St Andrews | VitalbacteriaEC | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit |
FASTRNA Pro blue Kit | MP Biomedicals | 116025050 | Supplied with lysing matrix tubes |
Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Qiagen, Fisherscientific can also supply same product |
Precellys 24 homogeniser | VWR | 432-3750 | FastPrep MP Biomedicals can be used too |
Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus | Fisher-Scientific | 15352117 | Other brands with similar capacity can be used |
Thermomixer | Eppendorf | BLD-455-010C | Works with 1-2 mL tubes |
TURBO DNA-free | Fisher-Scientific | AM1907M | Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures. |
RT-qPCR: | |||
Primers and Taqman probes | SOI group St Andrews | VitalbacteriaPP | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX. |
QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit | Qiagen | 204845 | PCR mix plus the RT enzyme |
RotorGene Q 5plex machine | Qiagen | 9001580 | Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc can be used |
Strip Tubes and Caps, 0.1 ml | Qiagen | 981103 | Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed. |
Non-heat inactivation Sample preservation materials | |||
1M Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | 93313 | Supplied ready to use |
2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Many competent suppliers |
Guanidine thiocyanate (GTC) | Promega | V2791 | Promega brand recommended for quality |
Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Ensures that GTC solution is free of nucleases |
General materials (used but not specific to TB-MBLA) | |||
500 mL plastic containers | 734-5087 | Nalgene brand recommeded | |
Biological waste discard jars | Many competent suppliers | ||
Chemical waste discard jars | Many competent suppliers | ||
Disposable gloves, chemical resistant | Many competent suppliers | ||
Freezer (-20 °C) | Many competent suppliers | ||
Freezer (-80 °C) | Many competent suppliers | ||
Fridge (0-8 °C) | Many competent suppliers | ||
Fume hood | For safe handling of toxic reagents | ||
Laboratory scales | For accurate measurement of reagents | ||
Measuring cylinders, plastic | To ensure accurate measurement of reagents | ||
PCR reaction tubes | Should be suitable to the PCR instrument used | ||
Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, | DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended | ||
Qiagility loading plates | Qiagen | 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates | |
QIAgility Pipetting Robot | Qiagen | Important for high throughput pipetting | |
Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes | Chemical-resistant and autoclavable recommended | ||
RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) | Fisher Scientific | 10666421 | Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme |
Safety goggles, chemical resistant | Fisher Scientific | Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents. | |
Sterile Pasteur pipettes, 1.5 mL – 3 mL | Many competent suppliers | ||
Sterile RNAse-free microtubes | 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended | ||
TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse | Ensure it is freshly prepared or prepared within a week | ||
Vortex | Genie 2 brand recommended | ||
Transmission electron microscopy | |||
Glutaldehyde (8%) | Sigma | G7526-10ML | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
HEPES (pH 7.4, 100 mM) | Sigma | H4034-25G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
Leica FCS ultracryo | Leica | Cryomicrotome for tissue sectioning | |
Methyl cellulose | Agar Scientific | AGG6425 | Cold mounting resin |
Paraformaldehyde (4% in PBS) | Sigma | P6148-500G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
Sucrose | Sigma | 84097-250G | Preservation and mounting medium |
Uranyl acetate | Agar Scientific | AGR1260A | Universal Electron microscopy stain |