हम थूक की गर्मी निष्क्रियता के बाद किए गए तपेदिक आणविक जीवाणु भार परख परीक्षण का वर्णन करते हैं। हीट इनएक्टिवेशन थूक के नमूने को गैर संक्रामक बनाता है और तपेदिक आणविक परीक्षणों के लिए रोकथाम स्तर 3 प्रयोगशालाओं की आवश्यकता को मिटादेता है।
तपेदिक माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी) के कारण होता है, जो संयुक्त राष्ट्र (यूएन) द्वारा एक खतरनाक श्रेणी बी जैविक पदार्थ के रूप में वर्गीकृत एक रोगजनक है । कामगारों की सुरक्षा के लिए, एमटीबी को ले जाने के लिए प्रकल्पित सभी नमूनों की हैंडलिंग रोकथाम स्तर (सीएल) 3 प्रयोगशाला में आयोजित की जानी चाहिए । टीबी आणविक जीवाणु भार परख (टीबी-MBLA) परीक्षण एक रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ मात्रात्मक बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-क्यूपीसीआर) परीक्षण है जो प्राइमर और 16S rRNA के लिए दोहरी लेबल जांच का उपयोग करएमटीबी बेसिलरी लोड की मात्रा निर्धारित करता है । हम टीबी-MBLA के लिए आरएनए को संरक्षित करते समय टीबी के नमूनों को गैर संक्रामक प्रदान करने के लिए गर्मी निष्क्रियता के उपयोग का वर्णन करते हैं। टीबी बेसिली को निष्क्रिय करने के लिए कसकर बंद 15 मिलीस सेंट्रलाइज ट्यूबमें थूक के नमूने का 1 मिलीएल एलिकोट 20 मिन के लिए उबला हुआ है। 42 दिनों तक गर्मी निष्क्रिय और नियंत्रण (लाइव) नमूनों की खेती से टीबी की मौत की पुष्टि हुई। निष्क्रिय नमूना तो निष्कर्षण नियंत्रण के १०० μL के साथ नुकीला है और आरएनए मानक आरएनए अलगाव प्रक्रिया के बाद निकाला जाता है । गर्मी के इलाज के नमूनों की संस्कृतियों में कोई वृद्धि नहीं देखी गई । अलग आरएनए वास्तविक समय आरटी-qPCR के अधीन है, जो एमटीबी 16S rRNA जीन में एक विशिष्ट लक्ष्य को बढ़ाता है, जो क्वांटिफिकेशन चक्र (सीक्यू) के रूप में परिणाम देता है। एक मानक वक्र का उपयोग सीक्यू को बैक्टीरियल लोड में अनुवाद करने के लिए किया जाता है, या अनुमानित कॉलोनी प्रति एमसीएल (ईसीएफयू/एमएल) इकाइयां बनारही है। सीक्यू और एक नमूने के बैक्टीरियल लोड के बीच एक व्युत्क्रम संबंध है। सीमा यह है कि गर्मी निष्क्रियता कुछ कोशिकाओं को उजागर करती है, आरएनए को RNases को उजागर करती है जो और एलटी; 1 लॉग10ईसीएफयू/एमएल (यानी, & 10 CFU/mL) का नुकसान का कारण बनती है । आगे के अध्ययन बहुत कम बोझ वाले रोगियों के अनुपात को निर्धारित करेंगे जो गर्मी निष्क्रियता के कारण झूठे नकारात्मक परिणाम पैदा करते हैं।
माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी) के कारण, विश्व स्तर पर तपेदिक (टीबी) के 7 x 106 से अधिक नए मामले सामने आते हैं जिनमें से प्रति वर्ष1,,2से अधिक 1 x 106 मर जाते हैं। इस प्रवृत्ति को पलटने के लिए विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) ने प्रभावी नैदानिक और उपचार उपकरण3विकसित करने सहित तीन स्तंभ दृष्टिकोण शुरू किया । संयुक्त राष्ट्र द्वारा एक खतरनाक जैविक पदार्थ बी के रूप में वर्गीकृत, एमटीबी के लिए सकारात्मक माना नमूनों के साथ काम करने के लिए 3 के रोकथाम स्तर (सीएल) की आवश्यकता होती है । CL3 प्रयोगशालाओं का निर्माण और रखरखाव के लिए महंगा कर रहे हैं । नतीजतन, अधिकांश देशों में क्षेत्रीय या राष्ट्रीय स्तर पर केंद्रीकृत टीबी संस्कृति सेवाएं हैं । इसका मतलब यह है कि धब्बा माइक्रोस्कोपी परिधीय स्वास्थ्य सुविधाओं में सबसे उपलब्ध नैदानिक उपकरण है।
स्तर 4 स्वास्थ्य सुविधाओं पर एक्सपीर्ट एमटीबी/आरआईएफ जैसे तेजी से आणविक परीक्षणों को लागू करने के लिए डब्ल्यूएचओ की मंजूरी है, जो ज्यादातर जिला स्तर4,,5पर स्थित है । कुछ जिले काफी बड़े और कुछ लोगों के लिए कम सुलभ हैं । जबकि फायदेमंद एक्सपीर्ट एमटीबी/आरआईएफ एमटीबी डीएनए का पता लगाकर काम करता है। डीएनए एक स्थिर अणु है जो कोशिकाओं की मृत्यु के बाद लंबे समय तक जीवित रहता है और इस प्रकार उपचार प्रतिक्रिया5,6की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण व्यवहार्य कोशिकाओं को मापने के लिए एक अच्छा मानक नहीं है । आरएनए आधारित परखव्यवहार्य कोशिकाओं7,8,,9,10,11,,1212,13के सटीक माप नहोने का विकल्प प्रदान करते हैं । आरएनए अलग-अलग स्थिरता की विभिन्न प्रजातियों में मौजूद है: राइबोसोमल आरएनए (आरएनए), स्थानांतरण आरएनए (टीआरएनए), और मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए)। मैसेंजर आरएनए जीन अभिव्यक्ति से जुड़ा हुआ है और इस प्रकार सेल गतिविधि और व्यवहार्यता14से सबसे निकटता से जुड़ा हुआ है । यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि जीन अभिव्यक्ति का अभाव कोशिका मृत्यु के बराबर नहीं है क्योंकि एमटीबी जैसे रोगजनक निष्क्रिय (निष्क्रिय) लेकिन व्यवहार्य राज्यों15,16में मौजूद हैं। इसलिए आरएनए जैसी स्थिर आरएनए प्रजातियां व्यवहार्य कोशिकाओं के सक्रिय और निष्क्रिय दोनों राज्यों के बेहतर मार्कर हैं।
एस्चेरिचिया कोलाईका उपयोग करते हुए, शेरीडान ने दिखाया कि 16S rRNA आनुपातिक रूप से कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) द्वारा मापा बैक्टीरियल विकास के साथ वृद्धि हुई17गिना जाता है । वहां CFU मायने रखता है और 16S rRNA में एक समवर्ती गिरावट थी जब ई. कोलाई बैक्टीरिया एंटीबायोटिक दवाओं के संपर्क में थे । सेल डेथ के बाद आरएनए में गिरावट एक संकेतक थी कि इसे सेल व्यवहार्यता13,17के लिए मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता था । इस सिद्धांत से ड्राइंग, टीबी आणविक जीवाणु भार परख (टीबी-MBLA) को एंटी टीबी थेरेपी11,,18,19पर रोगियों के लिए उपचार प्रतिक्रिया के मार्कर के रूप में व्यवहार्य टीबी बेसिलरी लोड को मापने के लिए एम तपेदिक 16S rRNA को लक्षित करने के लिए विकसित किया गया था ।, हमने टीबी-MBLA को एक सेलुलर निष्कर्षण नियंत्रण को शामिल करने के लिए आगे विकसित और अनुकूलित किया है जो एम तपेदिक बेसिली के लिसिस को दर्शाता है और20विभिन्न पर्यावरणीय सेटिंग्स में मजबूत है । टीबी-MBLA प्रक्रिया एमटीबी से आरएनए अलगाव के पहले कदम के लिए एक CL3 प्रयोगशाला में आयोजित किया जाना है जब तक एमटीबी कोशिकाओं को पूरी तरह से श्रमिकों की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए lysed हैं की आवश्यकता है । इसमें भूतलक्षी बैचेड विश्लेषण के लिए नमूना संरक्षण भी शामिल है जिसे ग्वानिडीन थिओसाइनेट में -80 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाएगा, जो एक स्तर 4 विषाक्त पदार्थ है। इस उद्देश्य के लिए, हमने टीबी को निष्क्रिय करने और टीबी-MBLA के लिए सुरक्षित नमूनों को धब्बा माइक्रोस्कोपी स्तर की प्रयोगशालाओं में किए जाने के लिए गर्मी का उपयोग किया है ।
प्रयोगशाला और नैदानिक अनुप्रयोगों में गर्मी का उपयोग सदियों से21,22के आसपास किया गया है । हालांकि, एमटीबी जैसे कुछ सूक्ष्मजीवों को मारना कठिन है, और गर्मी के लिए कम जोखिम23,,24सभी कोशिकाओं को मारने के लिए अपर्याप्त है। एक अध्ययन से पता चला है कि 80 डिग्री सेल्सियस पर टीबी संस्कृतियों के 20 मिनट हीटिंग ने पीसीआर25के लिए आवश्यक डीएनए को नष्ट किए बिना सभी एमटीबी बेसिली को मार डाला । इसके बाद, प्रयोगशाला डीएनए निष्कर्षण तकनीकों की एक संख्या वर्तमान में 95 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी। हमने यह दिखाने के लिए एक ही सिद्धांत लागू किया है कि टीबी-MBLA के लिए पर्याप्त आरएनए को संरक्षित करते हुए 80 डिग्री सेल्सियस, 85 डिग्री सेल्सियस या 95 डिग्री सेल्सियस निष्क्रिय एमटीबी पर उबलते टीबी के नमूने लगाए हैं। निष्क्रिय संस्कृति या थूक कमरे के तापमान पर कसकर बंद कंटेनरों में बनाए रखा जा सकता है या मात्रात्मक rRNA की मात्रा को कम किए बिना 7 दिनों के लिए प्रशीतित ।
टीबी-MBLA, वर्तमान में केवल (RUO) परीक्षण के रूप में इस्तेमाल किया अनुकूलनीय है और थूक, फेफड़ों के ऊतकों, और मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी तरल पदार्थ सहित विभिन्न नमूना प्रकार के लिए लागू किया गया है । यह अभी तक ब्रोंकियल एल्वेलर तरल पदार्थ, रक्त और अन्य नमूना प्रकारों पर लागू किया जाना है। नमूने के रूप में थूक का उपयोग करना, अफ्रीका में मल्टीसाइट मूल्यांकन (अप्रकाशित डेटा) और पिछलेप्रकाशनों 18,,26 से परिणाम बताते हैं कि MBLA की संवेदनशीलता माइकोबैक्टीरियम विकास संकेतक ट्यूब (MGIT) तरल संस्कृति के अनुरूप है। हालांकि, टीबी-MBLA तेजी से है, घंटे में परिणाम देने के रूप में दिनों या संस्कृति के हफ्तों के खिलाफ, विशिष्ट, नमूने में गैर टीबी सूक्ष्मजीवों से प्रभावित नहीं है, और रोग की गंभीरता का एक मात्रात्मक उपाय देता है । डब्ल्यूएचओ ने हाल ही में टीबी-MBLA को टीबी उपचार2की निगरानी के लिए धब्बा माइक्रोस्कोपी और संस्कृति की जगह एक उंमीदवार के रूप में मान्यता दी है ।
इस लेख में हम साबिती एट अल27में प्रकाशित गर्मी निष्क्रियता और टीबी-MBLA प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करते हैं। यह विस्तृत प्रोटोकॉल दुनिया भर में टीबी-MBLA उपयोगकर्ताओं के लिए एक बंद दृश्य संसाधन प्रदान करेगा ।
इस लेख से पता चलता है कि 80 डिग्री सेल्सियस, 85 डिग्री सेल्सियस और 95 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए गर्मी उपचार तपेदिक के नमूनों को प्रभावी ढंग से निष्क्रिय कर देता है, जिससे टीबी-MBLA के लिए प्रयोगशाला कर्मियों को संक्रमण के जोखिम के बिना गैर-CL3 सुविधा में किया जाना संभव हो जाता है। यह निष्कर्ष पिछले अध्ययनों में की गई टिप्पणियों की पुष्टि करता है जबकि एमटीबी25,30की गर्मी निष्क्रियता की प्रभावशीलता पर कुछ के विपरीत है । उदाहरण के लिए, कुछ रिपोर्टों से पता चलता है कि 80 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग उच्च बेसिलरी लोड नमूनों25,31,32,,33पर प्रभावी नहीं है। उच्च घनत्व इनोकुलम प्रभाव को हमारे अध्ययन में यह सुनिश्चित करके टाला गया था कि सभी थूक और शुद्ध संस्कृतियों को 15 मीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब प्रति 1 मिलीएल मात्रा में गर्म किया गया था ताकि नमूने के हर हिस्से को27उबलते के लिए पर्याप्त स्थान मिल सके ।
आरएनए संरक्षण गर्मी निष्क्रियता के बाद टीबी-MBLA के लिए यह संभव बनाता है प्रदर्शन किया जाएगा । यह निष्कर्ष दो अध्ययनों से सहमत है जिसने गर्मी के बाद आरएनए संरक्षण का प्रदर्शन किया12,34. हमने दिखाया कि गर्मी निष्क्रिय नमूनों में आरएनए 4 दिनों के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है, जिसका अर्थ है कि प्रयोगशालाओं एक सप्ताह के लिए कमरे के तापमान पर निष्क्रिय नमूनों को बनाए रखने के द्वारा परीक्षण बैच सकता है । आरएनए निष्कर्षण किट है कि प्रशीतन या ठंड की आवश्यकता को लागू करने से, कमरे के तापमान पर गर्मी निष्क्रिय नमूनों को बनाए रखने की क्षमता दोनों कोल्ड चेन और श्रेणी 3 प्रयोगशालाओं के लिए संसाधन सीमित सेटिंग्स में टीबी-MBLA प्रदर्शन करने के लिए की जरूरत है ।
एक मार्कर के रूप में 16S rRNA का उपयोग कर के 1लॉग बैक्टीरियल लोड से कम खो गया था । हालांकि लाइव और हीट इनएक्टिवेटेड सैंपल के बीच अंतर था, लेकिन हीट इनएक्टिवेशन के लिए खो ईस राशि डाउनस्ट्रीम परिणामों से समझौता करने के लिए बहुत छोटी है । तापमान बढ़ने से आरएनए की मात्रा में वृद्धि नहीं हुई, जिसका अर्थ है कि मनाया गया नुकसान गर्मी उपचार से स्वतंत्र है। उच्च तापमान पर गर्मी उपचार सबसे अधिक संभावना सेल lysis का कारण बनता है, RNases द्वारा गिरावट के लिए आरएनए को उजागर । दरअसल, गर्मी निष्क्रिय अंश के लिए RNase ए के बहिर्जात जोड़ आरएनए गिरावट की दर में वृद्धि हुई है । उबलते ने रनास की गतिविधि को कम नहीं किया, जिसका अर्थ है कि यह एक बहुत ही लचीला प्रोटीन है।
यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि १.५ लॉग10 ईसीएफयू/एमएल का औसत आरएनए क्षरण एक बड़ा नुकसान नहीं है । इस उद्देश्य के लिए हम परिकल्पना करते हैं कि हीटिंग एमटीबी बेसिली के एक छोटे से अनुपात को उजागर करता है, इस प्रकार आरएनए की एक छोटी राशि को RNase को उजागर करता है। TEM का उपयोग कर हमने दिखाया कि एमटीबी सेल आकृति विज्ञान और सेल दीवारों की अखंडता शायद ही 95 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग से प्रभावित होती है। इसका मतलब यह है कि इसके लिए विभिन्न शारीरिक कारकों और आरनएसेस की पर्याप्त आपूर्ति की आवश्यकता हो सकती है जैसे कि मेजबान में आरएनए35,36को काफी नीचा दिखाया जा सकता है । इसके अलावा, एक संरचनात्मक राइबोसोम होने के नाते, 16S rRNA संभावित रूप से RNase37,,38के लिए कम संवेदनशील है। एक एकल एमटीबी सेल में साइटोप्लाज्म37के ~ 700 राइबोसोम/0.1 मिमी3 होते हैं, जिसका अर्थ है कि प्रति सेल आरएनए की मात्रा अधिक होती है। इस प्रकार, रनास की छोटी मात्रा में38का प्रभाव कम हो सकता है। राइबोसोम्स की उच्च संख्या का अस्तित्व टीबी-MBLA को संवेदनशीलता और कम बोझ वाले टीबी रोगियों का पता लगाने की क्षमता के मामले में लाभ देता है ।
टीबी-एमएमएलए और एमजीआईटी कल्चर टीटीपी द्वारा मापा गया बैक्टीरियल लोड के बीच एक मजबूत संबंध था । यह कुछ हद तक संस्कृति सकारात्मकता के चालक के रूप में बैक्टीरियल लोड की पुष्टि करता है। हालांकि, टीबी-MBLA का लाभ यह है कि यह सीधे नमूने में मौजूद बेसिलरी लोड की मात्रा निर्धारित करता है और पता लगाने से पहले एमटीबी सेल प्रसार की आवश्यकता नहीं होती है। यह संस्कृति के साथ विरोधाभासों जिसका सकारात्मकता के लिए समय बैक्टीरियल लोड और एमटीबी सेल प्रसार की दर के स्तर पर निर्भर करता है । भविष्य के अध्ययन नियमित नैदानिक सेटिंग्स में गर्मी निष्क्रियता सहित टीबी-MBLA कार्यप्रवाह का मूल्यांकन करेंगे । अध्ययन भी बैक्टीरियल भार की एक श्रृंखला के साथ नमूनों का पता लगाने के लिए संख्या है कि सकारात्मक से नकारात्मक करने के लिए बदल सकता है समझने के लिए (यानी, कम बैक्टीरिया के साथ उन गर्मी निष्क्रियता के बाद) ।
बैक्टीरियल लोड के आणविक मात्राीकरण के लिए टीबी-MBLA प्रोटोकॉल जीवाणु विज्ञान में अपनी तरह का पहला है । विधि सीधे रोगी थूक से एमटीबी बेसिलरी लोड की मात्रा निर्धारित करती है और ऐसा करने के लिए कोई संस्कृति की आवश्यकता नहीं है। यह इसे तेजी से बनाता है और रोगी प्रगति के बारे में एक नैदानिक निर्णय को सूचित करने की क्षमता बढ़ जाती है। हीट इनएक्टिवेशन स्टेप संक्रमण के खतरे को कम करता है और उन सेटिंग्स में टीबी-MBLA की प्रयोज्यता को बढ़ाता है जिनमें श्रेणी 3 प्रयोगशाला नहीं है। नमूने की गर्मी निष्क्रियता के बाद, टीबी-MBLA परिणाम प्राप्त करने के लिए तीन प्रोटोकॉल कदम हैं: आरएनए निष्कर्षण, रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ (आरटी)-क्यूपीसीआर, और क्यूपीसीआर परिणाम विश्लेषण।
रोगी के नमूने से एमटीबी आरएनए को अलग करने की दक्षता जितनी अधिक होगी, परिणामों की गुणवत्ता उतनी ही अधिक होगी। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि थूक नमूने की गुणवत्ता अलग आरएनए की मात्रा को प्रभावित करती है। उदाहरण के लिए, लार थूक को कम गुणवत्ता माना जाता है और कम बेसिलरी लोड से जुड़ा हुआ है। इसका मतलब यह है कि गुणवत्ता थूक गर्भवती के लिए रोगी प्रशिक्षण महत्वपूर्ण है। निष्कर्षण प्रक्रिया की दक्षता का आकलन करने के लिए, एक निष्कर्षण नियंत्रण (यानी, गैर-एमटीबी कोशिकाओं की ज्ञात संख्या) आरएनए निष्कर्षण से पहले नमूने में नुकीला है। निष्कर्षण नियंत्रण की पुनर्प्राप्ति आरएनए निष्कर्षण प्रक्रिया की दक्षता की पुष्टि करती है। आरएनए अलगाव प्रक्रिया तब तक मान्य नहीं हो सकती जब तक कि निष्कर्षण नियंत्रण प्राप्त नहीं किया जाता है। इस तथ्य को देखते हुए कि एमटीबी एक लचीला जीव है यांत्रिक lysis प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण हिस्सा बनाता है । मोतियों (यानी, लाइसिंग मैट्रिक्स) की उपस्थिति में उच्च गति (600 आरपीएम) पर नमूने का समरूपीकरण कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से प्राप्त करता है। lysate की शुद्धि आरएनए और डीएनए दोनों युक्त एक उद्धरण पैदावार । डीएनए को हटाना आरएनए निष्कर्षण का एक महत्वपूर्ण अंतिम कदम है। टीबी-MBLA का उद्देश्य आरएनए की मात्रा निर्धारित करके व्यवहार्य बैसिली को मापना है । इस प्रकार, जीनोमिक डीएनए को हटाने में विफलता का मतलब है कि परिणामों में डीएनए से एक संकेत होगा, जो सेल व्यवहार्यता6के लिए एक अच्छा मार्कर नहीं है ।
आरटी-क्यूपीसीआर एमटीबी और निष्कर्षण नियंत्रण के लिए दोहरी लेबल वाली जांच चलाने वाला डुप्लेक्स है। इसमें तीन चरण शामिल हैं: रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन द्वारा 50 डिग्री सेल्सियस, 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन डेनेचर और 94 डिग्री सेल्सियस और 60 डिग्री सेल्सियस पर प्रवर्धन के 40 चक्र शामिल हैं। जांच से फ्लोरेसेंस का अधिग्रहण 60 डिग्री सेल्सियस (यानी, टुकड़ा विस्तार चरण) पर होता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि टीबी-MBLA को एक विशेष क्यूपीसीआर मशीन का उपयोग करके अनुकूलित किया गया है, इसलिए अन्य क्यूपीसीआर प्लेटफार्मों का उपयोग करने वाले ऑपरेटरों को अपने उपकरणों के लिए शर्तों का अनुकूलन करना चाहिए। डीएनए हटाने की दक्षता आरटी की अनुपस्थिति में प्रति नमूना एक प्रतिक्रिया चलाकर नियंत्रित की जाती है। इस प्रतिक्रिया से एक सकारात्मक परिणाम डीएनए को अधूरा हटाने का प्रतीक है । उच्च बोझ वाले नमूनों में डीएनए की उच्च मात्रा होती है, डीएनए को पूरी तरह से हटाने के लिए DNase एंजाइम की मात्रा दोगुनी हो सकती है। सौभाग्य से, उच्च बेसिलरी लोड नमूनों में, डीएनए की छोटी मात्रा की उपस्थिति आरएनए से परिणाम को प्रभावित करने की संभावना कम होती है। रिबसोमल आरएनए, टीबी-MBLA लक्ष्य, स्वाभाविक रूप से डीएनए३७की मात्रा से दोगुनी में होता है । पीसीआर में, एक नो टेम्पलेट कंट्रोल (एनटीसी), जो पीसीआर एजेंटों को भंग करने के लिए उपयोग किया जाने वाला पानी है, एक्सोजेनस डीएनए या आरएनए के साथ क्रॉस संदूषण के लिए नियंत्रण करता है। एनटीसी में एक सकारात्मक संकेत पार संदूषण और परिणाम अमान्य माना जाता है का तात्पर्य है । इसका मतलब यह है कि इस पानी का उपयोग कर गठित सभी समाधानों को त्याग दिया जाना चाहिए और पानी की एक ताजा शीशी का उपयोग करके नए लोगों को बनाया जाना चाहिए । सभी पानी के दूषित होने से बचने के लिए पीसीआर पानी को अलग-अलग एलिकोट्स में रखने की सलाह दी जाती है। पीसीआर की समग्र दक्षता के लिए नियंत्रण के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण (एमटीबी आरएनए) का उपयोग किया जाता है।
परिणाम विश्लेषण मानक वक्र का उपयोग करके पीसीआर सीक्यू एस को बैक्टीरियल लोड (यानी, अनुमानित कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों प्रति एमएमएल) में परिवर्तित करना शामिल है। मानक वक्र की स्थापना और अनुकूलन इस चरण के लिए महत्वपूर्ण है। 0.95-1 की एक मानक वक्र दक्षता की सिफारिश की जाती है। एमटीबी और निष्कर्षण नियंत्रण के लिए मानक घटता स्थापित किया जाना चाहिए और रोगियों या अन्य परीक्षण नमूनों को मशीन पर चलाने से पहले अनुकूलित किया जाना चाहिए। टीबी-एमएमएएलए किट के साथ मानक नमूने दिए जाते हैं। पीसीआर के लिए आरएनए निकालने की दस गुना कमजोर पड़ने की सिफारिश की जाती है। इसका तात्पर्य यह है कि बैक्टीरियल लोड परिणाम को प्रति एमएम एल अंतिम बैक्टीरियल लोड परिणाम प्राप्त करने के लिए 10 के कारक से गुणा करना होगा। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि टीबी-MBLA के लिए 30 से ऊपर के सीक्यूको को नकारात्मक माना जाता है । उपचार प्रतिक्रिया पर अनुमान लगाने के लिए विभिन्न समय बिंदुओं पर मापा गया न्यूनतम दो संभावित बैक्टीरियल लोड परिणाम आवश्यक हैं। यह दृढ़ता से सिफारिश की जाती है कि उपचार शुरू होने से पहले दो परिणामों में से एक बेसलाइन होना चाहिए। हालांकि, यदि रोगी ने उपचार के माध्यम से बैक्टीरियल लोड मूल्यांकन शुरू किया है, तो उपचार प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए दूसरी बार बिंदु बैक्टीरियल लोड माप होना चाहिए। टीबी-MBLA उपचार पर 3 दिनों की जगह में बैक्टीरियल लोड को अलग कर सकता है लेकिन आदर्श दो बैक्टीरियल लोड माप 7 दिनों के अलावा लिया जाता है।
जबकि प्रोटोकॉल उपचार प्रतिक्रिया के लिए जानकारीपूर्ण मात्रात्मक परिणाम उत्पन्न करता है, यह अभी भी काफी हद तक मैनुअल है और आरएनए निष्कर्षण के लिए समय पर पर्याप्त हाथों की मांग करता है। व्यस्त लैब में टेक्नीशियन इस बार नहीं हो सकते। आरएनए निकालने और पीसीआर प्रक्रियाओं को स्वचालित करने की व्यवस्था चल रही है।
The authors have nothing to disclose.
यह अध्ययन यूरोपीय और विकासशील देशों के नैदानिक परीक्षण साझेदारी (EDCTP) से वित्तपोषण द्वारा संभव बनाया गया था – पैन अफ्रीकी बायोमार्कर विस्तार कार्यक्रम (PanBIOME) अनुदान एसपी. 2011.41304.008। यूनिवर्सिटी ऑफ सेंट एंड्रयूज स्कूल ऑफ मेडिसिन रिसर्च ग्रांट भी सहायता प्राप्त की गई । एक दृश्य संसाधन के रूप में इस पांडुलिपि और टीबी-MBLA प्रोटोकॉल के प्रकाशन स्कॉटिश फंडिंग काउंसिल और ग्लोबल चैलेंजरिसर्च फंड से सेंट एंड्रयूज विश्वविद्यालय के लिए धन से संभव बनाया गया है । मापुटो मातृ अस्पताल और मावालेन स्वास्थ्य केंद्र के लिए धन्यवाद जिसने नैदानिक थूक नमूने प्रदान किए, और मापुटो तपेदिक उपचार इकाई टीम जिसने नैदानिक थूक नमूनों के गर्मी निष्क्रियता प्रयोगों में मदद की।
Heat inactivation: | |||
15 mL Centrifuge tubes | Fisher-Scientific | 10136120 | 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved |
15 mL Wire Tube rack | Fisher-Scientific | 11749128 | Other brands with similar make can be used |
Water bath | Fisher-Scientific | 15700619 | Other brands with similar make can be used |
RNA extraction: | |||
Chloroform | Sigma | 372978-1L | Not necessary in other RNA extraction kit brands |
Ethanol, absolute 99-100% | Sigma | 51976-500ML-F | Larger volume available |
Extraction control | SOI group St Andrews | VitalbacteriaEC | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit |
FASTRNA Pro blue Kit | MP Biomedicals | 116025050 | Supplied with lysing matrix tubes |
Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Qiagen, Fisherscientific can also supply same product |
Precellys 24 homogeniser | VWR | 432-3750 | FastPrep MP Biomedicals can be used too |
Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus | Fisher-Scientific | 15352117 | Other brands with similar capacity can be used |
Thermomixer | Eppendorf | BLD-455-010C | Works with 1-2 mL tubes |
TURBO DNA-free | Fisher-Scientific | AM1907M | Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures. |
RT-qPCR: | |||
Primers and Taqman probes | SOI group St Andrews | VitalbacteriaPP | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX. |
QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit | Qiagen | 204845 | PCR mix plus the RT enzyme |
RotorGene Q 5plex machine | Qiagen | 9001580 | Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc can be used |
Strip Tubes and Caps, 0.1 ml | Qiagen | 981103 | Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed. |
Non-heat inactivation Sample preservation materials | |||
1M Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | 93313 | Supplied ready to use |
2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Many competent suppliers |
Guanidine thiocyanate (GTC) | Promega | V2791 | Promega brand recommended for quality |
Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Ensures that GTC solution is free of nucleases |
General materials (used but not specific to TB-MBLA) | |||
500 mL plastic containers | 734-5087 | Nalgene brand recommeded | |
Biological waste discard jars | Many competent suppliers | ||
Chemical waste discard jars | Many competent suppliers | ||
Disposable gloves, chemical resistant | Many competent suppliers | ||
Freezer (-20 °C) | Many competent suppliers | ||
Freezer (-80 °C) | Many competent suppliers | ||
Fridge (0-8 °C) | Many competent suppliers | ||
Fume hood | For safe handling of toxic reagents | ||
Laboratory scales | For accurate measurement of reagents | ||
Measuring cylinders, plastic | To ensure accurate measurement of reagents | ||
PCR reaction tubes | Should be suitable to the PCR instrument used | ||
Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, | DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended | ||
Qiagility loading plates | Qiagen | 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates | |
QIAgility Pipetting Robot | Qiagen | Important for high throughput pipetting | |
Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes | Chemical-resistant and autoclavable recommended | ||
RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) | Fisher Scientific | 10666421 | Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme |
Safety goggles, chemical resistant | Fisher Scientific | Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents. | |
Sterile Pasteur pipettes, 1.5 mL – 3 mL | Many competent suppliers | ||
Sterile RNAse-free microtubes | 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended | ||
TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse | Ensure it is freshly prepared or prepared within a week | ||
Vortex | Genie 2 brand recommended | ||
Transmission electron microscopy | |||
Glutaldehyde (8%) | Sigma | G7526-10ML | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
HEPES (pH 7.4, 100 mM) | Sigma | H4034-25G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
Leica FCS ultracryo | Leica | Cryomicrotome for tissue sectioning | |
Methyl cellulose | Agar Scientific | AGG6425 | Cold mounting resin |
Paraformaldehyde (4% in PBS) | Sigma | P6148-500G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
Sucrose | Sigma | 84097-250G | Preservation and mounting medium |
Uranyl acetate | Agar Scientific | AGR1260A | Universal Electron microscopy stain |