Summary

Uma lesão de balão segmental controlada por pressão da artéria de rato com aplicação terapêutica periadventicional

Published: July 09, 2020
doi:

Summary

A lesão do balão carótida do rato imita o procedimento clínico de angioplastia realizado para restaurar o fluxo sanguíneo em vasos ateroscleróticos. Este modelo induz a resposta à lesão arterial distending da parede arterial, e desnuding a camada intimal de células endoteliais, causando, em última análise, remodelação e uma resposta hiperplástica intimal.

Abstract

As doenças cardiovasculares continuam sendo a principal causa de morte e incapacidade em todo o mundo, em parte devido à aterosclerose. A placa aterosclerótica reduz a área luminal da superfície nas artérias, reduzindo assim o fluxo sanguíneo adequado para órgãos e tecidos distais. Clinicamente, procedimentos de revascularização, como angioplastia de balão com ou sem colocação de stent, visam restaurar o fluxo sanguíneo. Embora esses procedimentos restabeleçam o fluxo sanguíneo reduzindo a carga da placa, eles danificam a parede do vaso, que inicia a resposta de cura arterial. A resposta de cura prolongada causa restenose arterial, ou re-estreitamento, limitando o sucesso a longo prazo desses procedimentos de revascularização. Portanto, modelos de animais pré-clínicos são fundamentais para analisar os mecanismos fisiodológicos que conduzem a restenose, e proporcionam a oportunidade de testar novas estratégias terapêuticas. Os modelos murinos são mais baratos e fáceis de operar do que os grandes modelos animais. Lesões de balão ou arame são as duas modalidades de lesão comumente aceitas usadas em modelos murinos. Os modelos de lesão de balão, em particular, imitam o procedimento de angioplastia clínica e causam danos adequados à artéria para o desenvolvimento da restenose. Aqui descrevemos os detalhes cirúrgicos para a realização e análise histologicamente do modelo de lesão do balão carótida de rato modificado e controlado por pressão. Além disso, este protocolo destaca como a aplicação periadventicial local da terapêutica pode ser usada para inibir a hiperplasia neointimal. Por fim, apresentamos a microscopia de fluorescência da folha de luz como uma nova abordagem para a imagem e visualização da lesão arterial em três dimensões.

Introduction

A doença cardiovascular (DCV) continua sendo a principal causa de morte em todo o mundo1. A aterosclerose é a causa básica da maior morbidade e mortalidade relacionadas à DCV. Aterosclerose é o acúmulo de placa dentro das artérias que resulta em um lúmen estreito, dificultando a perfusão sanguínea adequada aos órgãos e tecidos distais2. As intervenções clínicas para o tratamento da aterosclerose grave incluem angioplastia de balão com ou sem colocação de stent. Esta intervenção envolve o avanço de um cateter de balão para o local da placa, e a inflação do balão para comprimir a placa até a parede arterial, ampliando a área luminal. Este procedimento danifica a artéria, no entanto, iniciando a resposta da lesão arterial3. A ativação prolongada desta resposta à lesão leva à restenose arterial, ou re-estreitamento, secundária à hiperplasia neointimal e à remodelação do vaso. Durante a angioplastia, a camada intimal é desnudada de células endoteliais que levam ao recrutamento imediato de plaquetas e inflamação local. A sinalização local induz alterações fenotípicas nas células musculares lisas vasculares (VSMC) e nos fibroblastos adventitas. Isso leva à migração e proliferação de VSMC e fibroblastos para dentro do lúmen, levando à hiperplasia neointimal4,5. As células progenitoras circulantes e as células imunes também contribuem para o volume global de restenose6. Quando aplicável, os stents que eluem drogas (DES) são o padrão atual para inibir a restenose7. O DES inibe a re-endotelialização arterial, no entanto, criando assim um ambiente pró-trombótico que pode resultar em trombose tardia do stent8. Portanto, os modelos animais são fundamentais tanto para a compreensão da fisiopatologia da restenose, quanto para o desenvolvimento de melhores estratégias terapêuticas para prolongar a eficácia dos procedimentos de revascularização.

Vários modelos animais grandes e pequenos9 são utilizados para estudar essa patologia. Estes incluem lesão de balão3,10 ou lesão de fio11 do lado luminal de uma artéria, bem como ligadura parcial12 ou colocação de manguito13 ao redor da artéria. A lesão do balão e do arame desnude a camada endotelial da artéria, imitando o que ocorre clinicamente após a angioplastia. Em particular, os modelos de lesão de balão utilizam ferramentas semelhantes às do cenário clínico (ou seja, cateter de balão). A lesão do balão é melhor realizada em modelos de ratos, uma vez que as artérias de rato são um tamanho apropriado para cateteres de balão comercialmente disponíveis. Aqui descrevemos uma lesão arterial segmental controlada por pressão, uma versão bem estabelecida e modificada da lesão do balão da artéria carótida do rato. Esta abordagem controlada por pressão imita de perto o procedimento de angioplastia clínica, e permite a formação de hiperplasia neointimal reprodutível duas semanas após a lesão14,15. Além disso, esta lesão arterial controlada por pressão resulta em restauração completa da camada endotelial por 2 semanas após a cirurgia16. Isso contrasta diretamente com o modelo original de lesão do balão, descrito por Clowes, onde a camada endotelial nunca retorna à cobertura completa3.

Após a cirurgia, a terapêutica pode ser aplicada ou direcionada para a artéria ferida através de várias abordagens. O método descrito aqui usa a aplicação periadventitial de uma pequena molécula embutida em uma solução de gel plurônico. Especificamente, aplicamos uma solução de aldeído cinnâmico de 100 μM em gel plurônico-F127 na artéria imediatamente após lesão para inibir a formação de hiperplasia neointimal15. Pluronic-F127 é um gel termo-reversível não tóxico capaz de entregar drogas localmente de forma controlada17. Enquanto isso, a lesão arterial é local, portanto a administração local permite testar um princípio ativo, minimizando os efeitos fora do alvo. No entanto, a entrega efetiva de um uso terapêutico deste método dependerá da química da pequena molécula ou do uso biológico.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill. 1. Procedimentos pré-operatórios Esterilizar instrumentos cirúrgicos. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia. Se realizar múltiplas cirurgias no mesmo dia, esterilize os instrumentos entre as cirurgias utilizando um esterilizador de contas secas. Prepare o terapêutico em 25% de gel p…

Representative Results

A Figura 1 mostra todos os materiais e ferramentas cirúrgicas utilizados para a realização desta cirurgia. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) de seções transversais arterials feridas de duas semanas permite uma visualização clara da hiperplasia neointimal. A Figura 2 mostra imagens representativas de seções arterials manchadas de H&E de uma artéria saudável, ferida e tratada. A Figura 2 também descreve como qua…

Discussion

A lesão do balão da artéria carótida de rato é um dos modelos animais de restenose mais utilizados e estudados. Tanto o modelo de lesão do balãooriginal 3 quanto a variação de lesão segmental controlada pela pressão modificada10 informaram muitos aspectos da resposta à lesão arterial que também ocorre em humanos, com as poucas limitações sendo que o trombo rico em fibrina raramente se desenvolve e a inflamação local é mínima em comparação com outros mo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A N.E.B. foi apoiada por uma bolsa de treinamento do Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental (5T32ES007126-35, 2018), e uma bolsa de pré-doutorado da American Heart Association (20PRE35120321). E.S.M.B. foi um estudioso da KL2 parcialmente apoiado pelo Programa de Acadêmicos do UnC Clinical and Translational Science Award-K12 (KL2TR002490, 2018), e pelo National Heart, Lung, and Blood Institute (K01HL145354). Os autores agradecem ao Dr. Pablo Ariel, do Laboratório de Serviços de Microscopia da UNC, por ajudar na LSFM. A Microscopia de Fluorescência de Folha de Luz foi realizada no Laboratório de Serviços de Microscopia. O Laboratório de Serviços de Microscopia, Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial, é apoiado em parte pela bolsa de apoio do Centro de Câncer P30 CA016086 ao Centro de Câncer Integral UNC Lineberger.

Materials

1 mL Syringe Fisher 14955450
1 mL Syringe with needle BD 309626
2 French Fogarty Balloon Embolectomy Catheter Edwards LifeSciences 120602F
4-0 Ethilon (Nylon) Suture Ethicon Inc 662H
4-0 Vicryl Suture Ethicon Inc J214H
7-0 Prolene Suture Ethicon Inc 8800H
70% ethyl alcohol
Anti-Rabbit Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific A21245
Atropine Sulfate Vedco Inc for veterinary use
Cotton Swabs Puritan 806-WC
Curved Hemostats Fine Science Tools 13009-12
Fine Curved Forceps Fine Science Tools 11203-25
Fine Scissors Fine Science Tools 14090-11
Gauze Covidien 2252
IHC-Tek Diluent (pH 7.4) IHC World IW-1000
Insufflator Merit Medical IN4130
Iodine solution
Lubricating Eye Ointment Dechra for veterinary use
Mayo Scissors Fine Science Tools 14010-15
Micro Serrefines Fine Science Tools 18055-05
Microdissection Scissors Fine Science Tools 15004-08
Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps Fine Science Tools 18057-14
Needle Holder Fine Science Tools 12003-15
Pluronic-127 (diluted in sterile water) Sigma-Aldrich P2443 25% prepared
Rabbit Anti-CD31 Abcam ab28364
Retractor Bent paper clips work well
Rimadyl (Carprofen) Zoetis Inc for veterinary use
Saline solution
Standard Forceps Fine Science Tools 11006-12
Sterile Drape Dynarex 4410
T-Pins

References

  1. American Heart Association. Cardiovascular Disease: A Costly Burden for America, Projections Through 2035. American Heart Association CVD Burden Report. , (2017).
  2. Singh, R. B., Mengi, S. A., Xu, Y. J., Arneja, A. S., Dhalla, N. S. Pathogenesis of atherosclerosis: A multifactorial process. Experimental and Clinical Cardiology. 7 (1), 40-53 (2002).
  3. Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Mechanisms of stenosis after arterial injury. Laboratory Investigation. 49 (2), 208-215 (1983).
  4. Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. I. Smooth muscle growth in the absence of endothelium. Laboratory Investigation. 49 (3), 327-333 (1983).
  5. Sartore, S., et al. Contribution of adventitial fibroblasts to neointima formation and vascular remodeling: from innocent bystander to active participant. Circulation Research. 89 (12), 1111-1121 (2001).
  6. Tanaka, K., et al. Circulating progenitor cells contribute to neointimal formation in nonirradiated chimeric mice. The FASEB Journal. 22 (2), 428-436 (2008).
  7. Henry, M., et al. Carotid angioplasty and stenting under protection. Techniques, results and limitations. The Journal of Cardiovascular Surgery. 47 (5), 519-546 (2006).
  8. Kounis, N. G., et al. Thrombotic responses to coronary stents, bioresorbable scaffolds and the Kounis hypersensitivity-associated acute thrombotic syndrome. Journal of Thoracic Disease. 9 (4), 1155-1164 (2017).
  9. Jackson, C. L. Animal models of restenosis. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (3), 122-130 (1994).
  10. Shears, L. L., et al. Efficient inhibition of intimal hyperplasia by adenovirus-mediated inducible nitric oxide synthase gene transfer to rats and pigs in vivo. Journal of the American College of Surgeons. 187 (3), 295-306 (1998).
  11. Takayama, T., et al. A murine model of arterial restenosis: technical aspects of femoral wire injury. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
  12. Zhang, L. N., Parkinson, J. F., Haskell, C., Wang, Y. X. Mechanisms of intimal hyperplasia learned from a murine carotid artery ligation model. Current Vascular Pharmacology. 6 (1), 37-43 (2008).
  13. Jahnke, T., et al. Characterization of a new double-injury restenosis model in the rat aorta. Journal of Endovascular Therapy. 12 (3), 318-331 (2005).
  14. Gregory, E. K., et al. Periadventitial atRA citrate-based polyester membranes reduce neointimal hyperplasia and restenosis after carotid injury in rats. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (10), 1419-1429 (2014).
  15. Buglak, N. E., Jiang, W., Bahnson, E. S. M. Cinnamic aldehyde inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal hyperplasia in Zucker Diabetic Fatty rats. Redox Biology. 19, 166-178 (2018).
  16. Bahnson, E. S., et al. Long-term effect of PROLI/NO on cellular proliferation and phenotype after arterial injury. Free Radical Biology and Medicine. 90, 272-286 (2016).
  17. Gilbert, J. C. W., Davies, M. C., Hadgraft, J. The behaviour of Pluronic F127 in aqueous solution studied using fluorescent probes. International Journal of Pharmaceutics. 40 (1-2), 93-99 (1987).
  18. Tulis, D. A. Histological and morphometric analyses for rat carotid balloon injury model. Methods in Molecular Medicine. 139, 31-66 (2007).
  19. Buglak, N. E., et al. Light Sheet Fluorescence Microscopy as a New Method for Unbiased Three-Dimensional Analysis of Vascular Injury. Cardiovascular Research. , (2020).
  20. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  21. Ariel, P. . UltraMicroscope II – A User Guide. , (2018).
  22. Touchard, A. G., Schwartz, R. S. Preclinical restenosis models: challenges and successes. Toxicologic Pathology. 34 (1), 11-18 (2006).
  23. Xiangdong, L., et al. Animal models for the atherosclerosis research: a review. Protein Cell. 2 (3), 189-201 (2011).
  24. Chen, H., Li, D., Liu, M. Novel Rat Models for Atherosclerosis. Journal of Cardiology and Cardiovascular Sceinces. 2 (2), 29-33 (2018).
  25. Xing, D., Nozell, S., Chen, Y. F., Hage, F., Oparil, S. Estrogen and mechanisms of vascular protection. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (3), 289-295 (2009).
  26. Tulis, D. A. Rat carotid artery balloon injury model. Methods in Molecular Medicine. 139, 1-30 (2007).
  27. Pellet-Many, C., et al. Neuropilins 1 and 2 mediate neointimal hyperplasia and re-endothelialization following arterial injury. Cardiovascular Research. 108 (2), 288-298 (2015).
  28. Wu, B., et al. Perivascular delivery of resolvin D1 inhibits neointimal hyperplasia in a rat model of arterial injury. Journal of Vascular Surgery. 65 (1), 207-217 (2017).
  29. Tan, J., Yang, L., Liu, C., Yan, Z. MicroRNA-26a targets MAPK6 to inhibit smooth muscle cell proliferation and vein graft neointimal hyperplasia. Scientific Reports. 7, 46602 (2017).
  30. Pearce, C. G., et al. Beneficial effect of a short-acting NO donor for the prevention of neointimal hyperplasia. Free Radical Biology and Medicine. 44 (1), 73-81 (2008).
  31. Cao, T., et al. S100B promotes injury-induced vascular remodeling through modulating smooth muscle phenotype. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1863 (11), 2772-2782 (2017).
  32. Madigan, M., Entabi, F., Zuckerbraun, B., Loughran, P., Tzeng, E. Delayed inhaled carbon monoxide mediates the regression of established neointimal lesions. Journal of Vascular Surgery. 61 (4), 1026-1033 (2015).
  33. Khurana, R., et al. Angiogenesis-dependent and independent phases of intimal hyperplasia. Circulation. 110 (16), 2436-2443 (2004).
  34. Tsihlis, N. D., Vavra, A. K., Martinez, J., Lee, V. R., Kibbe, M. R. Nitric oxide is less effective at inhibiting neointimal hyperplasia in spontaneously hypertensive rats. Nitric Oxide. 35, 165-174 (2013).
  35. Chen, J., et al. Inhibition of neointimal hyperplasia in the rat carotid artery injury model by a HMGB1 inhibitor. Atherosclerosis. 224 (2), 332-339 (2012).
  36. Mano, T., Luo, Z., Malendowicz, S. L., Evans, T., Walsh, K. Reversal of GATA-6 downregulation promotes smooth muscle differentiation and inhibits intimal hyperplasia in balloon-injured rat carotid artery. Circulation Research. 84 (6), 647-654 (1999).
  37. Becher, T., et al. Three-Dimensional Imaging Provides Detailed Atherosclerotic Plaque Morphology and Reveals Angiogenesis after Carotid Artery Ligation. Circulation Research. 126 (5), 619-632 (2020).

Play Video

Cite This Article
Buglak, N. E., Bahnson, E. S. M. A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application. J. Vis. Exp. (161), e60473, doi:10.3791/60473 (2020).

View Video