Summary
Травма воздушного шара сонной артерии крыс имитирует клиническую процедуру ангиопластики, выполняемую для восстановления кровотока в атеросклеротических сосудах. Эта модель индуцирует реакцию артериальной травмы, разбавляя артериальную стенку, и опротестов интимальный слой эндотелиальных клеток, в конечном счете вызывая ремоделирование и интимальный гиперпластический ответ.
Abstract
Сердечно-сосудистые заболевания остаются основной причиной смерти и инвалидности во всем мире, отчасти из-за атеросклероза. Атеросклеротический налет сужает область светимой поверхности артерий, тем самым уменьшая достаточный приток крови к органам и дистальным тканям. Клинически, процедуры реваскуляризации, такие как ангиопластика воздушного шара с или без размещения стента, направлены на восстановление кровотока. Хотя эти процедуры восстановить кровоток за счет уменьшения бремени бляшек, они повреждают стенку сосуда, который инициирует артериальный ответ исцеления. Длительное заживление ответ вызывает артериальный ререноз, или повторное сужение, в конечном счете, ограничивая долгосрочный успех этих процедур реваскуляризации. Таким образом, доклинические модели животных являются неотъемлемой частью для анализа патофизиологических механизмов вождения ререноза, и дают возможность проверить новые терапевтические стратегии. Модели Murine дешевле и проще в эксплуатации, чем крупные модели животных. Воздушный шар или проволоки травмы являются два общепринятых методов травмы, используемые в моделях murine. Модели травмы воздушного шара, в частности, имитируют клиническую процедуру ангиопластики и наносят адекватный ущерб артерии для развития ререноза. В этом мы описываем хирургические детали для выполнения и гистограммологически анализа модифицированной, контролируемой давлением крысы сонной артерии модели повреждения воздушного шара. Кроме того, этот протокол подчеркивает, как местное периавентиционное применение терапевтических средств может быть использовано для ингибирования неоинтимальной гиперплазии. Наконец, мы представляем флуоресцентную микроскопию светового листа как новый подход к визуализации и визуализации артериальной травмы в трех измерениях.
Introduction
Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) остается основной причиной смерти во всеммире 1. Атеросклероз является основной причиной большинства связанных с ССЗ заболеваемости и смертности. Атеросклероз является накопление бляшек внутри артерий, что приводит к сужению люмена, препятствуя надлежащей перфузии крови к органам и дистальныхтканей 2. Клинические вмешательства для лечения тяжелого атеросклероза включают воздушный шар ангиопластики с или без стентирования размещения. Это вмешательство включает в себя продвижение воздушного шара катетер к месту налета, и надувание воздушного шара для сжатия налета к артериальной стенке, расширение области светимости. Эта процедура повреждает артерию, однако, инициируя реакцию артериальнойтравмы 3. Длительная активация этой реакции травмы приводит к артериальному реренозу, или повторному сужению, вторичной по отношению к неоинтимальной гиперплазии и ремоделирования сосудов. Во время ангиопластики интимальный слой оголается эндотелиальных клеток, что приводит к немедленному набору тромбоцитов и локальному воспалению. Локальная сигнализация вызывает фенотипические изменения в сосудистых гладких мышечных клетках (VSMC) и адвентитиальных фибробластах. Это приводит к миграции и распространению VSMC и фибробластов внутрь люмена, что приводит к неоинтимальнойгиперплазии 4,5. Циркулирующие клетки-предшественники и иммунные клетки также способствуют общему объему ререноза6. Там, где это применимо, лекарственно-элутные стенты (DES) являются действующим стандартом для ингибирования ререноза7. DES ингибировать артериальной ре-эндотелиализации, однако, создавая тем самым про-тромботической среде, что может привести к позднему тромбозустента 8. Таким образом, модели животных являются неотъемлемой частью как для понимания патофизиологии ререноза, так и для разработки более эффективных терапевтических стратегий для продления эффективности процедур реваскуляризации.
Несколько больших и малых животныхмоделей 9 используются для изучения этой патологии. К ним относятсявоздушный шар травмы 3,10 илипроволоки травмы 11 светимой стороне артерии, а такжечастичная перевязка 12 илиманжеты размещения 13 вокруг артерии. Воздушный шар и проволоки травмы как denude эндотелиальный слой артерии, имитируя то, что происходит клинически после ангиопластики. В частности, модели травм воздушных шаров используют те же инструменты, что и в клинических условиях (т.е. воздушный шар катетер). Травма воздушного шара лучше всего выполняется в крысиных моделях, так как крысиные артерии являются подходящим размером для коммерчески доступных катетеров воздушного шара. В этом мы описываем управляемой давлением сегментальной артериальной травмы, устоявшейся, модифицированной версии травмы воздушного шара сонной артерии крысы. Этот подход, контролируемый давлением, тесно имитирует клиническую процедуру ангиопластики и позволяет воспроизвести образование неоинтимальной гиперплазии черездве недели после травмы 14,15. Кроме того, это давление контролируемых артериальных травм приводит к полному восстановлению эндотелиального слоя на 2 недели после операции16. Это прямо контрастирует с оригинальной моделью повреждения воздушного шара, описанной Clowes, где эндотелиальный слой никогда не возвращается к полному охвату3.
После операции, терапии могут быть применены к или направлены на поврежденную артерию через несколько подходов. Метод, описанный в этом, использует периавентитное применение небольшой молекулы, встроенной в раствор плуронического геля. В частности, мы применяем раствор 100 МКм циннамического альдегида в 25% гель Pluronic-F127 к артерии сразу после травмы, чтобы ингибировать образование неоинтимальной гиперплазии15. Pluronic-F127 является нетоксичным, термо-реверсивный гель, способный поставлять наркотики локально контролируемым образом17. Между тем, артериальная травма является локальной, поэтому местная администрация позволяет проверить активный принцип при минимизации внецелегового воздействия. Тем не менее, эффективная доставка терапевтических с помощью этого метода будет зависеть от химии небольшой молекулы или биологических используется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл.
1. Предоперационные процедуры
- Стерилизовать хирургические инструменты. Автоклав всех хирургических инструментов перед операцией. При выполнении нескольких операций в один и тот же день, стерилизовать инструменты между операциями с помощью сухой стерилизатор бисера.
- Приготовьте терапевтический 25% гель Pluronic-127 (разбавленный в стерильной дистиллированной воде).
- Установите катетер 2F Fogarty воздушный шар к insufflator и поместите воздушный шар конце катетера в 1 мл шприц заполнен солевым раствором.
- Индуцировать анестезию, поместив крысу в камеру с 5% изофлюран.
- Удалите крысу из камеры и замитмить вес крысы. Используйте ножницы для бритья меха в области брюшной шеи.
- Поместите крысу обратно в камеру с 5% изофлюран для обеспечения индукции анестезии.
- Поместите крысиный суп на хирургическую платформу, вставив лицо в конус носа так, чтобы лицо крысы было направлено к хирургу.
- Снижение ингаляционной анестезии до 1,5% изофлюрана. Проявите глубину анестезии с помощью рефлекса на ногах на всех четырех ногах.
- Лента все четыре ноги вниз к хирургической платформе.
- Включите тепловую лампу.
- Инъекция атропина (0,01 мг/кг) подкожно для уменьшения секреции дыхательных путей.
- Инъекция карпрофена (5 мг/кг) подкожно для профилактического ведения боли. Если противовоспалительные препараты не приемлемы для эксперимента, обратитесь к шагам 3.2.2 и 3.2.3.
- Нанесите смазку глазной мази на оба глаза с помощью стерильного ватного тампона, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время операции.
- Шваб шеи три раза круговыми движениями чередующихся между 70% этилового спирта следуют бетадин из центра бритой области наружу, чтобы стерилизовать разрез сайта.
- Проникнуть в линию разреза s.c. с 0,25% bupivacaine.
- Натеьте стерильные хирургические перчатки перед обработкой стерильных хирургических инструментов и принадлежностей.
- Выложить все автоматические хирургические инструменты на стерильный хирургический лист.
- Вырезать три независимых 1 дюймовый пряди стерильных 7-0 Prolene шва.
- Поместите ватные тампоны и марлю на хирургический лист.
- Drape крысы с стерильным хирургическим листом, который только подвергает стерилизованной области шеи.
- Вырезать дополнительное небольшое отверстие в листе, который подвергает часть конуса носа. Это будет место для лентой вниз воздушный шар катетер во время травмы.
2. Оперативные процедуры
- В течение всей хирургической процедуры, оценить глубину анестезии путем мониторинга частоты дыхания (скорость должна быть последовательной и считается нормальной), а также на ноте щепотку каждые 15 минут. Если частота дыхания увеличивается или есть реакция на щепотку нося, то приостанавливать хирургические манипуляции и увеличить изофлюран до 2,5%.
- Разоблачить общую сонную артерию (CCA).
- Сделайте поверхностный, прямой, продольный разрез декольте между челюстными костями крысы. Разрез будет примерно 1,5-2 см в длину.
- Сделайте разрез через соединительной ткани под кожей, пока мышечный слой подвергается. Вытесните слюнные железы под кожей, чтобы получить доступ к мышечной ткани.
- Грубо отделить соединительной ткани от мышцы, вставив закрытые ножницы между мышечным слоем и соединительной ткани и осторожно открывая ножницы, потянув кожу вверх.
- Рассеките две видимые мышцы (стернохиоид и стерномастоид) продольно вдоль левой стороны трахеи до тех пор, пока третья мышца (омохиоид), которая проходит перпендикулярно двум поверхностным мышцам наблюдается.
- Используйте типсы для создания окна, отделяющее эту перпендикулярную мышцу (омохиоид) от продольной мышцы (стернохиоид), бегущей на вершине трахеи. Аккуратно выполните это разделение, чтобы предотвратить тупую травму трахеи.
- Достигните типсов под перпендикулярной мышцей и вырежьте, чтобы отделить две продольные мышцы и разоблачить CCA.
- Рассекает CCA.
- Рассекает CCA вблизи бифуркации до внутренней сонной артерии (ICA) и внешней сонной артерии (ECA) подвергаются воздействию.
- Рассекает превосходную щитовидную артерию (STA), которая ветвиется из ЭКА.
- Используя предварительно вырезать Prolene швы, ligate STA и ECA вблизи их соответствующих бифуркации. Оставьте большую часть шва в одну сторону узла и захватить каждый шов с изогнутым гемостата.
- Закончите рассечение вокруг ICA, достичь типсов под и вокруг ICA, и использовать не дробления сосудистого зажима для достижения дистального контроля. Зажим затылочной артерии вместе с ICA.
- Рассекает CCA проксимальной бифуркации, обеспечивая отделить блуждающий нерв от CCA.
- Достичь типсов под и вокруг CCA и использовать не дробления сосудистого зажима для достижения проксимального контроля. Поместите зажим не менее 5 мм от бифуркации.
- Выполните травму воздушного шара.
- Маневр изогнутые гемостаты проведения каждой перевязки ветки артерии подвергать бифуркации между ЭКА и верхней ветви.
- Аккуратно вскрыть ткани при бифуркации, а затем сделать разрез артериотомии между ЭКА и верхней ветви с помощью ножниц микродиссекции.
- Используйте ватный тампон, чтобы вытолкнуть всю кровь из CCA и очистить место артериотомии.
- Вставьте неинфлированный воздушный шар катетер через артериотомию и заранее в CCA до проксимального конца шара мимо бифуркации.
- Лента катетер к носу конуса, чтобы воздушный шар не выскользнуть из артерии во время инфляции.
- Медленно надуть воздушный шар до 5 атмосфер давления и оставить в CCA на 5 минут, чтобы вызвать артериальную травму. Убедитесь, что давление остается постоянным в течение всего 5 минут.
- Через 5 минут сдуть воздушный шар и аккуратно удалить из CCA через артериотомию.
- Промыть CCA, осторожно сжимая на зажим на CCA. Не снимите зажим.
- Ligate ECA проксимальной артериотомии, а затем удалить зажимы из CCA и ICA для восстановления кровотока через CCA в ICA. Убедитесь, что нет видимых кровотечений вокруг артериотомии и что CCA пульсирует.
- Применить 100 йл терапевтических или Pluronic гель транспортного средства только periadventitially вдоль раненых CCA. Сделайте это, применяя 50 КЛ на левой стороне CCA, а затем 50 йл на правой стороне CCA, чтобы обеспечить равномерное покрытие травмированной артерии.
- Закройте место ранения.
- Вырезать избыток prolene швов.
- Закройте рану, используя прерванные 4-0 или 6-0 vicryl слоев вдоль соединительной ткани.
- Закончите закрывать рану с помощью бега 4-0 нейлонового шва вдоль кожи.
3. Послеоперационные процедуры
- Поместите крысу в одиночку в чистую клетку с половиной клетки под лампой для отопления и контролировать, пока крыса не приходит достаточно сознания для поддержания стерни лежа. Держите крысу в отдельной клетке до тех пор, пока животное не будет полностью начеку и мобильным перед передачей обратно в свою первоначальную клетку.
- Мониторинг крысы ежедневно в течение следующих трех дней, а затем три раза в неделю до эвтаназии. Euthanize использованием изофлуран передозировки следуют двусторонние торакотомии, как описано ниже.
- Используйте Национальный центр по доработке и сокращению животных в исследованиях (NC3Rs) гримасы масштаба для выявления послеоперационных уровней боли. Если какое-либо животное, как представляется, испытывают боль или развивать какой-либо неврологический компромисс, жертвовать немедленно.
- Для животных, которые не получают карпрофен, управлять ацетаминофен 6 мг/ мл в питьевой воде 24 ч до операции через 48 ч после операции. Ацетаминофен обеспечивает анальгезию с минимальными противовоспалительными эффектами.
- Кроме того, другие стратегии анальгетики с минимальными противовоспалительными эффектами могут быть использованы, такие как бупренорфин или бупренорфин расширенный релиз. Проконсультируйтесь с ветеринарной командой в вашем учреждении.
4. Урожай тканей и визуализация
- Через две недели после операции усыпляйте крысу при передозировке анестезии (5% изофлюран). Кроме того, усытворять крыс в более ранней точке времени для анализа различных аспектов реакции артериальной травмы.
- После того, как дыхание перестает выполнять двустороннюю торакотомию в качестве вторичного метода эвтаназии.
- Сделайте боковой разрез через брюшную полость, а затем разрежьте вверх, через диафрагму и ребра, обнажая грудную полость.
- Перелить и починить артерии.
- Вставьте канюлю 18 G, прикрепленную к системе гравитационной перфузии-фиксации через левый желудочек. Поддерживайте эквивалентное давление между крысами, отмечая высоту перфузионой системы по отношению к скамейке (высота 120 см, эквивалентная 91 ± 3 мм рт. ст.).
- Зажим канюли вместе с желудочков с помощью изогнутого гемостата.
- Сделайте разрез в правом атриуме, открыв сосудистую цепь, и начните перфузию с PBS с последующим 2-4% параформальдегидом (около 250 мл каждый).
- Подготовка параформальдегида разбавленной в PBS день жертвоприношения, или, по крайней мере, в ночь перед жертвоприношением. При подготовке в день жертвоприношения, обеспечить параформальдегид остыл до комнатной температуры до начала перфузии. Хранить параформальдегид при 4 градусов по Цельсию.
- После фиксации, извлечь левую и правую сонные артерии и хранить при 4 градусов по Цельсию в течение 2 ч в 2-4% параформальдегида.
- Передача артерий до 30% сахарозы и хранить на ночь при 4 градусов по Цельсию.
- После 16-24 ч, вставлять артерии в оптимальной температуре резки (OCT) соединения и заморозить OCT-встроенных блоков артерии.
- Состояние артерий в ОКТ при комнатной температуре в течение 10 мин. Поместите артерию параллельно плоскости криомольда, наполненной ОКТ, обозначая сторону криомольда, к которой обращена артериальная бифуркация. Snap-заморозка в жидком азоте.
- Храните замороженные блоки в долгосрочной перспективе при -80 градусов по Цельсию.
- Раздел замороженных блоков с использованием криостата.
- Соберите шесть 5 мкм толщиной артериальных поперечных сечений на слайд, с слайдом 1, начиная с бифуркации.
- Раздел замороженных блоков до гиперплазии больше не видны (около 100 слайдов).
- Гематоксилин и эозин (Н И Е) пятно слайды18
- Найдите область травмы, окрашивая один из каждых десяти слайдов по всей артерии, начиная с бифуркации (например, слайды 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 и 100).
- Пятно дополнительные слайды вокруг места травмы, чтобы найти слайд с пиком окклюзии (например, слайды 20, 30 и 40 были видны гиперплазии, таким образом пятно слайды 15, 25, 35 и 45).
- Пятно и количественно слайд с пиком окклюзии и равноудающих слайдов до и после пика окклюзии слайд (например, пик окклюзии найти на слайде 35, то пятно и количественно слайды 25, 45 и т.д.) в общей сложности 3-10 слайдов на крысу.
- Для изображения микроскопии листа светлого листа, храните артерии всю ночь при 4 градусах Цельсия после фиксации в шаге 4.4.
- Зонд артерии с 1:500 разбавления кролика анти-CD31 первичного антитела в разбавлении (рН 7,4) в течение 3 дней. Затем counterstain артерии с 1:500 разбавления анти-кролик Alexa Fluor 647 вторичных антител в течение 2дней 19.
- Очисти артерию с помощью iDISCO20.
- Изображение артерии с помощью светового листа флуоресценции микроскоп21. Рендер изображения с помощью программного обеспечения (например, Imaris)19.
- Количественная неоинтимальная гиперплазия. Выполните количественную оценку в ослепленной манере, если это возможно.
- Используйте программное обеспечение ImageJ для отслеживания периметра инима, внутренней эластичной ламины (IEL) и внешней эластичной ламины (EEL) артерии на каждом из 3-10 слайдов, определенных выше (шаг 4.8.3).
- Количественная оценка площади каждого отслеживаемого региона в ImageJ и экспорт этих значений. След intima дает область люмена, след IEL дает область IEL, а след EEL дает область EEL.
- Среднее значение, полученное из 3-10 слайдов, чтобы получить среднюю травму (% окклюзии, intima:media (I:M) соотношение, неоинтимальной гиперплазии) на крысиную сонную артерию.
Неоинтимальная гиперплазия - область IEL - Люменская область
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показаны все материалы и хирургические инструменты, используемые для выполнения этой операции. Гематоксилин и эозин (Н И Е) окрашивание двухнедельных травмированных артериальных поперечных сечений позволяет четко визуализировать неоинтимальную гиперплазию. На рисунке 2 показаны репрезентативные изображения окрашенных В И Е артериальных поперечных сечений здоровой, раненной и обработанной артерии. На рисунке 2 также описывается, как количественно оценить уровень неоинтимальной гиперплазии в травмированной артерии с помощью ImageJ, широко используемого программного обеспечения для обработки изображений. Используя этот подход, периметр неоинтимы, а также внутренняя и внешняя эластичная ламина прослеживаются для количественной оценки соответствующих областей. Метод сегментной травмы, контролируемый давлением, который мы описываем, приводит к соотношению инима к медиа 0,80 со стандартным отклонением 0,29 (2 различных хирурга и n'11 крыс). Лечение периаддентиальным применением ЦА в Плуроническом приводит к ингибированию неоинтимальной гиперплазии, как мы уже показывали ранее (61% снижение процентов окклюзии)15.
Рисунок 3 служит иллюстрацией для создания оптимальной артериотомии при бифуркации ЭКА и СТА. Наконец, на рисунке 4 показано, как флуоресцентная микроскопия светового листа может быть использована для визуализации всей области повреждения по всей длине артерии. CD31 окрашивание для визуализации эндотелиальных клеток, выстилающих интимальный слой, может быть выполнено на фиксированных артериях. Артерии могут быть встроены в 1% агарозы и очищены с помощью метода iDISCO для гомогенизации рефракционного индексаобразца 20. Затем артерии могут быть изображены в световом листе флуоресценции микроскопа и изображения могут быть вынесены с помощью программного обеспечения для количественной оценки I:M соотношение. Используя этот подход, мы получили соотношение I:M 0,86, что в согласии с результатами Н И Е.
| Номер раздела | Ссылки |
| 10 секций | 27 |
| 8 секций | 28 |
| 6-10 секций | 29 |
| 6 секций | 30 |
| 5 секций | 31 |
| 3 секции | 32 |
Таблица 1. Обычно используется количество артериальных поперечных сечений для анализа гиперплазии.
Рисунок 1. Хирургические инструменты и инструменты. В порядке по часовой стрелке, начиная с верхнего левого угла изображения: (A) Хлопчатобумажные тампоны; (B)Бетадин решение; (C)Марля; (D)70% раствор этилового спирта; (E) 1cc шприцы с иглой; (F)Атропин; (G)Отказники; изогнутые скрепки, используемые здесь; (H)Римадил; (I)Микро-серрефный зажим, применяя хлипы; (J)держатель иглы; (K) 4-0 нейлоновый шов; (L)4-0 викрилового шва; (M)Стерильные шторы; (N) Ножницы Майо; (O)Стандартные типсы; (P)Тонкие изогнутые типсы; ()Ножницы микроперегибки; (R)Микро крепостные зажимы; (S)Тонкие ножницы; (T)Т-контакты; (U) Изогнутые гемостаты; (V) Три 7-0 Prolene швы сократить примерно до 1 дюйма; (W) 100 л 25% гель pluronic-127; (X)Смазка глазной мази; (Y) 2 французский воздушный шар тиснение катетера в стерильном солевом растворе; (В)Инфуфлатор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Гематоксилин и эозин (H и E) окрашивание и анализ крысиной сонной артерии поперечных сечений. (A)Поперечное сечение здоровой, невредимой правой сонной артерии. IEL - Внутренняя эластичная Ламина, EEL - Внешняя эластичная Ламина. (B)Поперечное сечение двухнедельной травмированной левой сонной артерии, обработанной автомобилем Pluronic-F127. (C)Поперечное сечение двухнедельного травмированного левого сонной артерии, обработанной 100 циннамическим альдегидом. Шкала бар 100 мкм. (D) Раздел схема замороженных артерий для количественной оценки травмы. Слайд 1 начинается с бифуркации, а шесть артериальных секций шириной 5 мкм взяты на слайд. Раздел обычно продолжает скользить 70, как травма обычно происходит до этого слайда. (E) Поперечное сечение травмированной левой сонной артерии, обработанной Плуроническим транспортным средством(B). Внутренняя черная линия прослеживает неоинтиму и очерчивает светимую область. Средняя желтая линия очерчивает область внутренней эластичной ламины, или инимы туники. Внешняя синяя линия очерчивает область внешней эластичной ламины, или туники adventitia. Шкала бар 100 мкм. (F) Расчеты, используемые для измерения процентов окклюзии сосудов и intima:media (I:M) соотношение на основе измерений, полученных из (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Создание артериотомии. Иллюстрация шагов по созданию правильной артериотомии и избежанию ложного тракта. CCA - Общая сонная артерия, ЭКА - Внешняя сонная артерия, ICA - Внутренняя сонная артерия, ОА - затылочной артерии, STA - Превосходная тиреоидная артерия. Изолировать бифуркацию между филиалами ECA и STA. Рассекаете эту бифуркацию до тех пор, пока область не изменится на более яркий цвет, что указывает на истончение артериальной стенки, а затем создайте артериотомию с помощью ножниц микропересмешки. Поднимите артериотомию с помощью тонких типсов, чтобы помочь в вставке воздушного шара. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4. Свет листа флуоресценции микроскопии для визуализации артериальной травмы. Продольные поперечные сечения по длине общей сонной артерии от 14-недельной крысы Спраг Доули с репрезентативным поперечным сечением ниже. Артерии окрашены CD31 и противоявлены AF647. (A)Поперечные сечения здоровой, невредимой правой сонной артерии. Белый - CD31, Зеленый - Эластичная Ламина, L и Lumen, Шкала бар - 200-500 мкм. (B) Поперечные сечения раненых, левая сонная артерия обработана автомобилем Pluronic-F127. Наконечники стрел указывают на области неоинтимальной гиперплазии. (C) Инима к средствам массовой информации (I:M) соотношение невредимых и раненых сонной артерии, с точным значением отметил для каждой группы (n'1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Травма воздушного шара сонной артерии крыс является одним из наиболее широко используемых и изученных моделей ререноза животных. Оба оригинальных модели травмывоздушного шара 3 и модифицированного давления контролируемыхсегментальных травм вариации 10 сообщили многие аспекты реакции артериальной травмы, которая также происходит в организме человека, с несколькими ограничениями в том, что фибрин богатых тромб редко развивается и местное воспаление является минимальным по сравнению с другими моделями травмы, такие как в гиперхолестериномический кролик или свиныемодели 9,22. Крысы также могут быть принесены в жертву в разное время точки для количественной оценки и анализа различных аспектов реакции артериальной травмы. Например, более ранние точки времени могут быть использованы для изучения аспектов ранней реакции на травмы, такие как пролиферацию клеток, фенотипический переключатель сосудистых гладких мышечных клеток и ранний иммунный ответ. Ранее мы показали, что инфильтрация лейкоцитов и пролиферация клеток являются максимальными между 3 днями и 1неделей 16. Промежуточные точки времени могут быть использованы для оценки скорости повторного эндотелиализации. Двухнедельный момент времени является самой ранней предложенной точкой времени для измерения неоинтимальной гиперплазии, поскольку артерия в основном повторно эндотелиализирована вэтой точке 16. Основным ограничением для перевода этой модели является то, что травма выполняется в здоровой артерии, в то время как эта процедура происходит у пациентов с атеросклеротической болезнью. Это ограничение существует отчасти из-за предыдущего отсутствия доступных моделей атеросклероза крыс23,24. Тем не менее, достижения в области технологий редактирования генов позволили для разработки надежныхатеросклеротических моделей крыс 24, которые могут дать новые идеи в изучении патофизиологии ререноза.
Сравнительно, мыжские крысы дают более робастную травму чем женские крысы, которые типично развивают более менее неоинтимальной гиперплазии по возможности из-за защитного влиянияэстрогена 25. Тем не менее, описанная модель по-прежнему подходит для изучения артериального заживления у женщин. Мужские крысы стареют 12-16 недель, между 300-400 г дают наиболее надежное и воспроизводимое неоинтимальное образование. Крысы моложе 12 недель могут быть использованы; однако, артерии этих более молодых крыс могут быть слишком малы для шарика 2F легко войти артерию в зависимости от напряжения крысы. Крысы весом менее 200 граммов не следует оперировать с этой моделью, как воздушный шар не легко помещается через артериотомию и может на самом деле разорвать артерию, если принудительно. Кроме того, использование крыс старше 16 недель может дать переменный ответ в неоинтимальной формирования. Различные штаммы крыс могут быть использованы для выполнения этой модели травмы, с Sprague Доули крыс наиболее часто используется во всей литературе26. Чтобы начать операцию, сначала получить надлежащее выравнивание и ориентацию участка разреза в шее, чувствуя для челюсти кости и с помощью крысиного носа, чтобы найти средней линии. После первоначального разреза, рассекают ткани до тех пор, пока две продольные мышцы (стернохиоид и стерномастоид) работает параллельно друг другу визуализированы. Используйте мышцы шеи (массажисты) в качестве нижнего предела окна операции, к голове. Отделите параллельные мышцы, которые бегут к телу, друг от друга, пока мышца, которая работает перпендикулярно этим двум визуализируется. Резка перпендикулярной мышцы позволит легко опровержения двух параллельных мышц, подвергая сонной артерии. Поскольку анатомия может незначительно отличаться от каждого животного, наряду с их позиционированием, может быть небольшая артериальная ветвь, которая лежит на вершине ICA. Эта небольшая ветвь может быть зажата вместе с ICA; однако, когда эта небольшая ветвь не зажата не должно быть никаких проблем с выполнением процедуры. Кроме того, убедитесь, что вскрыть блуждающий нерв как от ICA и CCA, прежде чем какие-либо зажима и зашивания происходит. Важно быть нежным и избежать повреждения нерва в этой точке. Если животное дергается после надевания зажима, который может быть ответом блуждающего нерва, в контактах с металлическим зажимом; рассмотреть вопрос о корректировке зажима.
Возможно, самый сложный шаг всей процедуры делает артериотомию. Это потому, что можно сделать "ложную" артериотомию, и вставка воздушного шара через эту "ложную" артериотомию приведет к тому, что воздушный шар фактически будет работать над артерией, а не внутри артерии. Если это происходит, то сделать новую артериотомию ближе к бифуркации в CCA является возможным решением, но если воздушный шар был вынужден в артерию, то операция не может быть спасительным. Чтобы предотвратить «ложную» артериотомию(рисунок 3),рассекните адвентитиальный слой на бифуркации ЭКА и STA с использованием тонких типсов до тех пор, пока внешний вид значительно покраснеет, чем близлежащие регионы, и эта часть артерии, кажется, выступает. После этого используйте микро-ножницы для создания артериотомии, быстро вставив один зубец ножниц в очищенную область при бифуркации, а затем резки. После сделать артериотомию, используйте тонкие типсы, чтобы поднять открытие артерии и нажмите воздушный шар в люмен. Воздушный шар должен легко скользить через артериотомию и в CCA. В зависимости от крыс позиционирования это может быть полезно для руководства воздушный шар в CCA с помощью тонкой типсов мягко тянуть вверх на внешней стороне CCA, направляя воздушный шар катетер в CCA. После того, как воздушный шар вставляется в CCA, лента катетер вниз, чтобы воздушный шар не выходит из артерии, как это в настоящее время надувается.
Периавентиального применения терапевтических позволяет для местных и направленных доставки наркотиков только в месте травмы. Этот подход ограничивает потенциальные внецелесосудовые эффекты, а также ограничения досирования по сравнению с чем-то, поставленным системно устными, внутриперитонеальными или внутривенными администрациями. Pluronic-F127 термо-реверсивный, что означает, что он жидкий при холодной температуре и гели при комнатной температуре. Это позволяет легко подготовить терапевтический раствор в жидком растворе перед плуроническими гелями, в то время как гель можно равномерно применять к артерии сразу после травмы. В то время как в верхней части CCA легко доступны для эффективного покрытия всей области травмы CCA должны быть аккуратно подняты, чтобы покрыть нижнюю часть CCA. Тем не менее, исследователи должны обеспечить, чтобы власть исследования надлежащим образом объяснить потенциальную изменчивость между обработанными животными. Важно иметь оценку ожидаемого размера эффекта и стандартного отклонения результата к власти исследования надлежащим образом. Ограничение периаддентиального метода родов заключается в том, что он не является клинически релевантным подходом, так как артерия пациента не подвергается воздействию во время ангиопластики, которая выполняется как перкутанная процедура. Тем не менее, периавентиционное применение позволяет предварительное тестирование молекул и биопрепаратов, доставленных локальнок месту травмы 15,27,28,29,30.
Нынешний стандартный метод количественной оценки неоинтимальной гиперплазии основан на морфометрическом анализе окрашенных слайдов H и E. Поврежденная сонная артерия физически вырезается на горки в 5 мкм ломтиками. Эти слайды затем окрашены с помощью Н И Е и изображения принимаются с помощью светового микроскопа. Программное обеспечение ImageJ затем используется для измерения областей и периметров, делимитированных intima, внутренней ламины и внешней ламины. Несмотря на то, что мы сообщили о повышенной точности использования 10слайдов для количественной оценки гиперплазии 19, нет консенсуса существует в литературе о том, сколько слайдов для измерения, с сообщил методологии варьируются от 3 до 10 равномерно размегментных разделов ( Таблица1)31,32,33,34,35,36. Коэффициент I:M 0,8 со стандартным отклонением 0,29 (n-11) можно ожидать с помощью этой методологии (диапазон: 0,54-1,51). Мы и другие ранее сообщали световой лист флуоресценции микроскопии (LSFM) обеспечивает новый подход к визуализацииартериальной травмы 19,37. LSFM позволяет визуализацию всей сонной артерии в плоскости x, y и z. LSFM позволяет для оптической нарезки для генерации артериальных поперечных сечений для анализа, что дает более точные оценки гиперплазии (коэффициент изменения: 28% LSFM против 41% по гистологии), чем традиционные гистологическиеподходы 19,37. Как видно на рисунке 4, коэффициент I:M, полученный LSFM (0,86, n'1), сопоставим с результатами, полученными в результате классического гистологического анализа (0,8 ± 0,29).
В заключение, давление контролируемых сегментальных травм recapitulates артериальной травмы ответ, который происходит после клинических процедур реваскуляризации, что делает его идеальной моделью для изучения патофизиологии ререноза. Применение периавентиального препарата является полезным методом доставки доказательств концепции для анализа терапевтической эффективности доставки местных лекарств и может информировать о разработке целенаправленных системных подходов к доставке лекарств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что в связи с публикацией этой рукописи нет конфликта интересов.
Acknowledgments
N.E.B. была поддержана грантом на обучение от Национального института наук об охране окружающей среды (5T32ES007126-35, 2018), и допретантной стипендией Американской ассоциации сердца (20PRE35120321). Е.С.M.B. был ученым KL2, частично поддерживаемым Программой ученых-ученых КООН по клинической и трансляционной науке (KL2TR002490, 2018) и Национальным институтом сердца, легких и крови (K01HL145354). Авторы благодарят д-ра Пабло Ариэля из Лаборатории микроскопии КООН за помощь в работе с LSFM. Микроскопия светового листа флуоресценции была проведена в Лаборатории микроскопии. Лаборатория микроскопии, Кафедра патологии и лабораторной медицины, частично поддерживается P30 CA016086 Онкологический центр Основной грант поддержки КООН Lineberger Всеобъемлющий онкологический центр.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | Fisher | 14955450 | |
| 1 mL Syringe with needle | BD | 309626 | |
| 2 French Fogarty Balloon Embolectomy Catheter | Edwards LifeSciences | 120602F | |
| 4-0 Ethilon (Nylon) Suture | Ethicon Inc | 662H | |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon Inc | J214H | |
| 7-0 Prolene Suture | Ethicon Inc | 8800H | |
| 70% ethyl alcohol | |||
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21245 | |
| Atropine Sulfate | Vedco Inc | for veterinary use | |
| Cotton Swabs | Puritan | 806-WC | |
| Curved Hemostats | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Fine Curved Forceps | Fine Science Tools | 11203-25 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Gauze | Covidien | 2252 | |
| IHC-Tek Diluent (pH 7.4) | IHC World | IW-1000 | |
| Insufflator | Merit Medical | IN4130 | |
| Iodine solution | |||
| Lubricating Eye Ointment | Dechra | for veterinary use | |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps | Fine Science Tools | 18057-14 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 12003-15 | |
| Pluronic-127 (diluted in sterile water) | Sigma-Aldrich | P2443 | 25% prepared |
| Rabbit Anti-CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Retractor | Bent paper clips work well | ||
| Rimadyl (Carprofen) | Zoetis Inc | for veterinary use | |
| Saline solution | |||
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Sterile Drape | Dynarex | 4410 | |
| T-Pins |
References
- American Heart Association. Cardiovascular Disease: A Costly Burden for America, Projections Through 2035. American Heart Association CVD Burden Report. , (2017).
- Singh, R. B., Mengi, S. A., Xu, Y. J., Arneja, A. S., Dhalla, N. S. Pathogenesis of atherosclerosis: A multifactorial process. Experimental and Clinical Cardiology. 7 (1), 40-53 (2002).
- Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Mechanisms of stenosis after arterial injury. Laboratory Investigation. 49 (2), 208-215 (1983).
- Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. I. Smooth muscle growth in the absence of endothelium. Laboratory Investigation. 49 (3), 327-333 (1983).
- Sartore, S., et al. Contribution of adventitial fibroblasts to neointima formation and vascular remodeling: from innocent bystander to active participant. Circulation Research. 89 (12), 1111-1121 (2001).
- Tanaka, K., et al. Circulating progenitor cells contribute to neointimal formation in nonirradiated chimeric mice. The FASEB Journal. 22 (2), 428-436 (2008).
- Henry, M., et al. Carotid angioplasty and stenting under protection. Techniques, results and limitations. The Journal of Cardiovascular Surgery. 47 (5), Torino. 519-546 (2006).
- Kounis, N. G., et al. Thrombotic responses to coronary stents, bioresorbable scaffolds and the Kounis hypersensitivity-associated acute thrombotic syndrome. Journal of Thoracic Disease. 9 (4), 1155-1164 (2017).
- Jackson, C. L.
- Shears, L. L., et al. Efficient inhibition of intimal hyperplasia by adenovirus-mediated inducible nitric oxide synthase gene transfer to rats and pigs in vivo. Journal of the American College of Surgeons. 187 (3), 295-306 (1998).
- Takayama, T., et al. A murine model of arterial restenosis: technical aspects of femoral wire injury. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Zhang, L. N., Parkinson, J. F., Haskell, C., Wang, Y. X. Mechanisms of intimal hyperplasia learned from a murine carotid artery ligation model. Current Vascular Pharmacology. 6 (1), 37-43 (2008).
- Jahnke, T., et al. Characterization of a new double-injury restenosis model in the rat aorta. Journal of Endovascular Therapy. 12 (3), 318-331 (2005).
- Gregory, E. K., et al. Periadventitial atRA citrate-based polyester membranes reduce neointimal hyperplasia and restenosis after carotid injury in rats. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (10), 1419-1429 (2014).
- Buglak, N. E., Jiang, W., Bahnson, E. S. M. Cinnamic aldehyde inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal hyperplasia in Zucker Diabetic Fatty rats. Redox Biology. 19, 166-178 (2018).
- Bahnson, E. S., et al. Long-term effect of PROLI/NO on cellular proliferation and phenotype after arterial injury. Free Radical Biology and Medicine. 90, 272-286 (2016).
- Gilbert, J. C. W., Davies, M. C., Hadgraft, J. The behaviour of Pluronic F127 in aqueous solution studied using fluorescent probes. International Journal of Pharmaceutics. 40 (1-2), 93-99 (1987).
- Tulis, D. A. Histological and morphometric analyses for rat carotid balloon injury model. Methods in Molecular Medicine. 139, 31-66 (2007).
- Buglak, N. E., et al. Light Sheet Fluorescence Microscopy as a New Method for Unbiased Three-Dimensional Analysis of Vascular Injury. Cardiovascular Research. , (2020).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. , (2018).
- Touchard, A. G., Schwartz, R. S. Preclinical restenosis models: challenges and successes. Toxicologic Pathology. 34 (1), 11-18 (2006).
- Xiangdong, L., et al. Animal models for the atherosclerosis research: a review. Protein Cell. 2 (3), 189-201 (2011).
- Chen, H., Li, D., Liu, M. Novel Rat Models for Atherosclerosis. Journal of Cardiology and Cardiovascular Sceinces. 2 (2), 29-33 (2018).
- Xing, D., Nozell, S., Chen, Y. F., Hage, F., Oparil, S. Estrogen and mechanisms of vascular protection. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (3), 289-295 (2009).
- Tulis, D. A. Rat carotid artery balloon injury model. Methods in Molecular Medicine. 139, 1-30 (2007).
- Pellet-Many, C., et al. Neuropilins 1 and 2 mediate neointimal hyperplasia and re-endothelialization following arterial injury. Cardiovascular Research. 108 (2), 288-298 (2015).
- Wu, B., et al. Perivascular delivery of resolvin D1 inhibits neointimal hyperplasia in a rat model of arterial injury. Journal of Vascular Surgery. 65 (1), 207-217 (2017).
- Tan, J., Yang, L., Liu, C., Yan, Z. MicroRNA-26a targets MAPK6 to inhibit smooth muscle cell proliferation and vein graft neointimal hyperplasia. Scientific Reports. 7, 46602 (2017).
- Pearce, C. G., et al. Beneficial effect of a short-acting NO donor for the prevention of neointimal hyperplasia. Free Radical Biology and Medicine. 44 (1), 73-81 (2008).
- Cao, T., et al. S100B promotes injury-induced vascular remodeling through modulating smooth muscle phenotype. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (11), 2772-2782 (2017).
- Madigan, M., Entabi, F., Zuckerbraun, B., Loughran, P., Tzeng, E. Delayed inhaled carbon monoxide mediates the regression of established neointimal lesions. Journal of Vascular Surgery. 61 (4), 1026-1033 (2015).
- Khurana, R., et al. Angiogenesis-dependent and independent phases of intimal hyperplasia. Circulation. 110 (16), 2436-2443 (2004).
- Tsihlis, N. D., Vavra, A. K., Martinez, J., Lee, V. R., Kibbe, M. R. Nitric oxide is less effective at inhibiting neointimal hyperplasia in spontaneously hypertensive rats. Nitric Oxide. 35, 165-174 (2013).
- Chen, J., et al. Inhibition of neointimal hyperplasia in the rat carotid artery injury model by a HMGB1 inhibitor. Atherosclerosis. 224 (2), 332-339 (2012).
- Mano, T., Luo, Z., Malendowicz, S. L., Evans, T., Walsh, K. Reversal of GATA-6 downregulation promotes smooth muscle differentiation and inhibits intimal hyperplasia in balloon-injured rat carotid artery. Circulation Research. 84 (6), 647-654 (1999).
- Becher, T., et al. Three-Dimensional Imaging Provides Detailed Atherosclerotic Plaque Morphology and Reveals Angiogenesis after Carotid Artery Ligation. Circulation Research. 126 (5), 619-632 (2020).
