Summary
Vi beskriver en 3D menneskelige ekstracellulære matrix-adipocyte in vitro kultur system, der tillader dissektion af rollerne af matrix og adipocytter i at bidrage til fedtvæv metabolisk phenotype.
Abstract
Den ekstracellulære matrix (ECM) spiller en central rolle i reguleringen af vævs homøostase, engagerende i krydstale med celler og regulerer flere aspekter af cellulær funktion. ECM spiller en særlig vigtig rolle i fedtvæv funktion i fedme, og ændringer i fedtvæv ECM deposition og sammensætning er forbundet med metaboliske sygdom i mus og mennesker. Tractable in vitro-modeller, der tillader dissektion af rollerne for ECM og celler i at bidrage til den globale væv fænotype er sparsom. Vi beskriver en roman 3D in vitro model af human ECM-adipocyte kultur, der tillader undersøgelse af de specifikke roller ECM og adipocytter i reguleringen fedtvæv metabolisk phenotype. Humant fedtvæv er decellularized at isolere ECM, som efterfølgende genbefolket med preadipocytter, der derefter differentieret inden ECM i modne adipocytter. Denne metode skaber ECM-adipocyte konstruktioner, der er metabolisk aktive og bevarer egenskaber af væv og patienter, hvorfra de er afledt. Vi har brugt dette system til at demonstrere sygdomsspecifik ECM-adipocyt krydstale i humant fedtvæv. Denne kulturmodel giver et værktøj til at dissekere rollerne af ECM og adipocytter i at bidrage til globale fedtvæv metabolisk fænotype og tillader undersøgelse af rollen som ECM i reguleringen af fedtvæv homøostase.
Introduction
Den ekstracellulære matrix (ECM) giver ikke kun et mekanisk stillads til væv, men også en kompleks krydstale med celler, der er placeret i den, og regulerer forskellige processer, som er nødvendige for vævs homøostase, herunder celle spredning, differentiering, signalering og metabolisme1. Mens sund ECM spiller en væsentlig rolle vedligeholdelsen af normal vævs funktion, dysfunktionel ECM har været impliceret i flere sygdomme2.
Fedtvæv spiller en vigtig rolle i patogenesen af metabolisk sygdom. Fedme er forbundet med overdreven fedtcellerne hypertrofi og cellulære hypoksi, defekter i fedtcellerne cellulære metabolisme, og fedtvæv endoplasmatiske reticulum og oxidativ stress og inflammation. Mens dårligt forstået, disse komplekse processer konspirere at forringe fedtvæv næringsstof bufferkapacitet, fører til næringsstof overløb fra fedtvæv, toksicitet i flere væv, og systemisk metabolisk sygdom3,4 ,5. Sekvensen af begivenheder og specifikke mekanismer, der ligger til grund for fedtvæv svigt er dårligt forstået, men ændringer i fedtvæv ECM har været impliceret. ECM sammensætning er ændret inden fedtvæv i human og murine fedme, med øget aflejring af ECM protein sammen med kvalitative biokemiske og strukturelle forskelle i fedtvæv ECM forbundet med menneskelig metabolisk sygdom, herunder type 2 diabetes og hyperlipidæmi6,7,8,9,10,11.
På trods af disse observationer, rollen af fedtvæv ECM i mæthed fedtvæv dysfunktion er ikke veldefineret. Dette er til dels på grund af manglende spor tabel eksperimentelle modeller, der tillader dissektion af de specifikke roller ECM og adipocytter i reguleringen ultimative fedtvæv funktion. ECM-adipocyte kultur bedre simulerer in vivo miljøet af indfødte fedtvæv i mindst to henseender. For det første, ECM kultur giver et molekyle miljø svarende til indfødte fedtvæv, herunder indfødte collagens, elastiner, og andre matrix proteiner fraværende i standard 2D kultur. For det andet, kultur på 2D plast har vist sig at ændre fedtcellerne metabolisme via mekaniske effekter på grund af nedsat elasticitet af plastik substrat12, som ECM-kultur eliminerer.
Metoder til at ingeniør biologiske stilladser ved isolering af ECM fra afstødende fedtstoffer og andre væv er blevet undersøgt i forbindelse med regenerativ og rekonstruktiv medicin og vævsteknik13,14, 15,16,17,18. Vi har tidligere offentliggjort metode, hvor vi tilpassede disse metoder til at udvikle en in vitro 3D-model af human ECM-fedtcellerne kultur, ved hjælp af ECM og fedtcellerne stamceller (preadipocytter) afledt af menneskelige visceral fedtvæv11. I denne artikel beskriver vi disse metoder i detaljer. Den decellularization procedure for humant fedtvæv er en fire-dages proces, der involverer mekaniske og enzymatiske behandlinger til at fjerne celler og lipid, efterlader en biologisk stillads, der bevarer egenskaber af vævet, hvorfra det er afledt. Decellularized ECM understøtter adipogenisk differentiering af humane preadipocytter, og når det er rekonstitueret med adipocytter, vedligeholder mikroarkitektur og biokemiske og sygdomsspecifikke egenskaber af intakt fedtvæv og engagerer sig i metaboliske funktioner karakteristisk for indfødte fedtvæv. Denne matrix kan studses alene eller reseedet med celler, tillader undersøgelse af interaktioner og krydstale mellem cellulære og ekstracellulære komponenter af fedtvæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fedtvæv indkøbes fra mennesker, der gennemgår elektiv bariatriske kirurgi under institutionel revision Board godkendelse.
1. preadipocyte isolation og kultur reagens præparat
- 2% bovint serumalbumin (BSA) forberedes i 1x phosphatbufferet saltvandsopløsning (PBS). Steriliser, og opbevar den ved 4 °C.
- Forbered type II kollagenase: 2 mg/mL i 2% BSA i 1x PBS. Forbered umiddelbart før brug.
- Forbered røde blodlegemer (RBC) Lysing opløsning: 1,5 M NH4Cl, 100 mm NaHCO3, 10 mm dinatriumedta i deioniseret vand (Di/H2O). Opbevares ved 4 °C. Forbered 1x RBC Lysing opløsning fra 10x stamopløsning i DI/H2O umiddelbart før brug.
- Forbered vækstmedier: 15% føtal bovint serum (FBS), 1% antibiotikum-antimykotisk opløsning (ABAM) i Dulbecco's modificerede Eagle medium: næringsstof blanding F-12 (DMEM/F12). Steriliser, og opbevar den ved 4 °C.
- Forbered Preadipocyte fryse opløsning: 10% dimethylsulfoxid, 15% FBS i DMEM/F12-medier. Steriliser, og opbevar den ved 4 °C.
- Forbered differentierings medier: 10 mg/L transferrin, 33 μM biotin, 0,5 μM humant insulin opløsning, 17 μM D-pantothensyre hemicalcium salt, 100 nM dexamethason, 2 nM 3, 3 ', 5-Triiodo-L-thyroninnatrium salt (T3), 1 μM ciglitizon, 540 μM 3- Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX), 1% ABAM i DMEM/F12. Steriliser, og opbevar den ved 4 °C.
2. ECM reagens præparat
- Forbered frysning buffer opløsning: 10 mM Tris base, 5 mM EDTA, 1% ABAM, 1% phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) i DI/H2O. røre opløsning til at OPLØSE EDTA. Justér pH til 8,0 med HCl eller NaOH. opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder.
- Forbered enzymatisk opløsning #1:1% ABAM i 0,25% trypsin-EDTA. Opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder.
- Forbered skylle buffer løsning: 137 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 7 mM na2HPO4, 1,5 mm KH2po4, 1% ABAM, 1% pmsf i steriliseret Di/H2O. rør til opløse salte. Justér pH til 8,0 med HCl eller NaOH. Opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder.
- Forbered enzymatisk opløsning #2:55 mM na2HPO4, 17 mm KH2po4, 4,9 mm mgso4∙ 7h2o, 1% ABAM, 1% pmsf i Di/H2o. Opbevar 4 °c i op til 3 måneder. Rør for at opløse salte. Umiddelbart før brug tilsættes 80 U/mL lipase fra Porcin bugspytkirtlen, type VI-S; 160 U/mL deoxyribonuclease I fra kvæg bugspytkirtlen, type II-S; og 100 μg/ml ribonuklease A fra kvæg bugspytkirtlen, type III-a.
- Forbered Polar solvent ekstraktions løsning: 1% ABAM, 1% PMSF i isopropanol.
Forsigtig: isopropanol er brændbart; opbevares i et brandfarligt kabinet ved 25 °C og bortskaffes i brændbart affald. - Forbered 70% ethanol, 1% ABAM, 1% PMSF i DI/H2O. Tilsæt ABAM og pmsf lige før brug.
Forsigtig: ethanol er brandfarlig; opbevares i et brandfarligt kabinet ved 25 °C og bortskaffes i brændbart affald. - Forbered opbevaringsløsning: 1% ABAM, 1% PMSF i 1x PBS. Opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder.
3. metabolisk fænotypebestemmelse reagens præparat
- Optagelse af glucose
- Forbered serum sult medier: DMEM/F12, 1% ABAM. Filter sterilisering og opbevares ved 4 °C
- Forbered 200 nM humant insulin opløsning i 1x PBS umiddelbart før brug.
- Forbered 200 nM humant insulin, 0,1 mM 2-Deoxy-D-glucose, 1 μCi/brønd Deoxy-D-glucose, 2-[1, 2-3H (N)]-, i 1x PBS. Forbered umiddelbart før brug.
- Lipolyse
- Forbered Isoproterenol fortyndet i PBS: 3 mM stamopløsning. Fortyndes til en arbejds koncentration på 3 μM til analyse.
- Olie rød-O farvning
- Forbered 4% formalin i DI/H2O. opbevares ved stuetemperatur.
- Forbered olie rød-O-arbejdsopløsning. Fortyndet olie rød-O-opløsning (ORO) med DI/H2o i et 3:2-forhold (Oro: di/h2o). Forbered umiddelbart før brug. Filtrer gennem filtrerpapir (tabel over materialer).
4. indkøb af fedtvæv
Bemærk: visceral fedtvæv (moms) opsamles fra den større omentum i begyndelsen af operationen af kirurgen og transporteres tilbage til laboratoriet på is til øjeblikkelig behandling. Universelle forholdsregler bør anvendes ved håndtering af alle humane væv og kaustiske reagenser, herunder udførelse af alt arbejde i en laminar flow hætte, ved hjælp af komplet laboratorie sikkerhed slid, og ingen omsnøring af nåle.
- Der tilsættes 5-10 g intakt moms til 15-25 mL fryse buffer opløsning i et 50 mL konisk rør for at sænke vævsprøven. Opbevar prøverne ved-80 °C indtil decellularization, i op til 1 måned.
- Brug en separat frisk prøve af moms for preadipocyte isolation som beskrevet i afsnit 5.
5. preadipocyte isolation
- 2 g intakte moms placeres i 20 mL af kollagenase, type II, opløsning i et 50 mL konisk rør. Derefter hakning grundigt ved at indsætte steril saks i det koniske rør og hakning vævet i røret. Når det er fuldt hakket til en fin gylle, Inkubér vævet i kollagenaseopløsningen på en orbital shaker ved 130 rpm og 37 °C i 60 min.
- Filtrer den resulterende fermentat gennem en 100 μm nylon mesh i en frisk 50 mL konisk rør ved at hælde fermentat fra en konisk rør gennem et stykke mesh foldet over toppen af en frisk konisk rør. Fermentat på dette punkt bør være en gul-orange væske med moderat viskositet, med små mængder af resterende tråde af ufordøjet fibrøst væv. Masken skal fange større stykker af ufordøjet væv, som kasseres.
- Prøven centrifugeres ved 270 x g i 10 min. Fjern supernatanten, og resuspender celle pellet i 2 ml 1X RBC Lysing-opløsning med en pipette.
- Inkubér i 1 min ved 25 °C, og tilsæt derefter 10 mL 15% FBS-DMEM/F12. Centrifugeres ved 270 x g i 10 minutter.
- Supernatanten fjernes, og celle pellet opslæmmes i 10 mL 15% FBS-DMEM/F12 med en pipette. Cellesuspensionen overføres til 100 mm Petri skål med en pipette, og der inkubates ved 37 °C og 5% CO2, indtil cellerne når op på 80-100% sammenløbet, typisk 2-6 dage. Skift mediet hver 2-3 dage.
- Frigør og vask celler.
- Fjern mediet med en pipette, og Anvend 4 mL 0,25% trypsin-EDTA på vedklædige celler. Inkuber ved 37 °C i 10 min. med jævne mellemrum hvirvler pladen forsigtigt for at løsne cellerne.
- Der tilsættes 20 mL 15% FBS-DMEM/F12, og de løsrevne celler i dette medie resuspenderes med en pipette. Derefter overføres til et frisk 50 mL konisk rør og centrifugeres 270 x g i 10 min.
- Fjern supernatanten og kassér. Celle pellet vaskes én gang i 1x PBS, og derefter opslæmmes celle pellet i 20 mL frisk 15% FBS-DMEM/F12 med en pipette. Cellesuspensionen overføres til en T-150-dyrknings kolbe.
- Dyrknings celler ved 37 °C og 5% CO2. Split og Udvid celler hver 2-3 dage, da de når 80-100% sammenløbet ved at anvende 7 mL 0,25% trypsin-EDTA, udvide fra en kolbe til 8 kolber.
Bemærk: Dette kræver typisk 3-4 passager, som tillader passende ekspansion og bevarer adipogenisk potentiale og patient-og Depot-specifikke cellulære metaboliske fænotyper. Passaging preadipocytter over 4-5 passager fører til tab af adipogenisk potentiale. - Cellerne afmonteres i 8 kolber med 7 mL 0,25% trypsin-EDTA pr. kolbe som beskrevet ovenfor, og der inkubates ved 37 °C i 10 min.
- Der tilsættes 8 mL 15% FBS-DMEM/F12 pr. kolbe, og de løsrevne celler resuspenderes med en pipette. Hele cellesuspensionen fordeles jævnt i 3 50 mL koniske rør og centrifugeres ved 270 x g i 10 min.
- Resuspendere de resulterende celle pellets i 5 mL 15% FBS-DMEM/F12 i en 15 mL konisk rør og tælle celler ved hjælp af celle tæller og Trypan blå.
- Centrifugér cellesuspensionen ved 270 x g i 10 minutter. Derefter resuspension celle pellet i preadipocyte frysning opløsning til en endelig celle koncentration af 1 x 106/ml, og alikvot 1 ml af cellesuspension per 1,5 ml cryovial tube.
- Opbevar cellerne i cryovials i 1 dag ved-80 °C. Overfør derefter cryovials til flydende nitrogen til langtidsopbevaring i 3-6 måneder.
- Når den er klar til brug, tø en cryovial i et 37 °C vandbad i 3-5 min. resuspension af cellerne i 20 mL 15% FBS-DMEM/F12, og centrifugeres ved 270 x g i 10 min.
- Celle pellet opslæmmes i 20 mL 15% FBS-DMEM/F12, pipetteres i en enkelt T-150 kolbe, hvorefter den vokser til 80% sammenløbet over 2-3 dage ved 37 °C og 5% CO2.
- Cellerne afmonteres med 7 mL 0,25% trypsin-EDTA pr. kolbe som beskrevet ovenfor i trin 5,6. Resuspension ved 3.000.000 celler pr. mL (dvs. 6 x 104 celler pr. 20 μl) i 15% FBS-DMEM/F12 og anvendes som skitseret nedenfor (afsnit 7, trin 7,4).
6. fedtvæv ECM-præparat
- Dag 1: fryse-tø og enzymatisk fordøjelse #1
- Fryse-tø tidligere frosset (trin 4,2) moms prøver opbevaret i fryse buffer opløsning i 50 mL koniske rør fra-80 °C til 37 °C i et forvarmet vandbad, inkubering 20 min med blid periodisk manuel agitation. Når optøet, Overfør tilbage til-80 °C og inkubere 20 min. Gentag fryse-tø 3x, slutter ved optøning prøver i en 37 °C vandbad.
- Ved hjælp af sterile pincet overføres moms prøverne til friske 50 mL koniske rør, der indeholder 15-25 mL enzymatisk opløsning #1, hvilket sikrer, at moms prøverne er helt nedsænket. Inkubér derefter natten over på en orbital shaker (130 rpm, 37 °C).
- Dag 2: enzymatisk fordøjelse #2
- Vask prøverne 3x med 15-25 mL skylle buffer opløsning på en orbital shaker (130 rpm, 37 °C, 20 min hver vask). Hæld skylle buffer opløsningen af efter hver vask.
- Prøverne overføres til friske 50 mL koniske rør, der indeholder 15-25 mL enzymatisk opløsning #2 og inkuberes på en orbital shaker (130 rpm, 37 °C, overnight).
- Dag 3: Delipidation
- Vask prøverne 3x med 15-25 mL skylle buffer opløsning på en orbital shaker (130 rpm, 37 °C, 20 min hver vask). Hæld skylle buffer opløsningen af efter hver vask.
- Prøverne overføres til friske 50 mL koniske rør indeholdende 15-25 mL Polar solvent ekstraktionsopløsning og inkuberes på en orbital shaker (130 rpm, 25 °C, overnight). Efter dette trin, et flertal af lipid bør fjernes, og prøverne skal være hvid eller gennemskinnelige farve.
Forsigtig: den polære solventekstraktionsopløsning er brændbar og bør opbevares og anvendes ved 25 °C.
- Dag 4: vask og opbevaring
- Prøverne overføres til friske 50 mL koniske rør indeholdende 15-25 mL skylle buffer opløsning. Vask prøverne 3x på en orbital shaker (130 rpm, 37 °C, 20 min hver vask).
- Vask prøverne 3x med 15-25 mL 70% ethanol på en orbital shaker (130 rpm, 37 °C, 20 min hver vask) hælde af 70% ethanol opløsning efter hver vask.
- Vask prøverne én gang med opbevaringsløsning på en orbital shaker (130 rpm, 37 °C, 20 min hver vask).
- Ved hjælp af sterile pincet overføres prøverne til friske 50 mL koniske rør indeholdende 15-25 mL opbevaringsløsning. Sørg for, at der er tilstrækkelig opbevaringsløsning til at fordybe prøverne fuldstændigt. Opbevares ved 4 °C i op til 1 måned.
7. ECM-adipocyt præparat
- Overfør lagrede ECM fragmenter til individuelle brønde af 24-brønd plade ved hjælp af sterile pincet. Tilsæt så mange ECM-fragmenter til så mange brønde, som det er nødvendigt for den planlagte downstream-analyse (f. eks. glukoseoptagelse eller lipolyse, se nedenfor), herunder duplikater eller triplicater. Vask med 500 μL 70% ethanol 3x på en orbital shaker (130 rpm, 37 °C, 20 min hver vask).
- Rehydrere ECM ved at vaske 3x i steril 1x PBS på en orbital shaker (130 rpm, 37 °C, 20 min hver vask).
- Ved hjælp af steril saks skæres og vejes ECM i 100 mg fragmenter. Brug sterile pincet, Placer 1 100 mg fragment i hver brønd af en 24-brønd plade. Inkuber ved 25 °C i 15 minutter for at tillade, at overskydende PBS Ekstruderer fra fragmenter. Fjern forsigtigt eventuelle overskydende PBS med en pipette.
- Frø hver 100 mg ECM-fragment med 20 μL preadipocyte-cellesuspension (3.000.000 celler pr. mL, 6 x 104 celler pr. 20 μl, i 15% FBS-DMEM/F12, fra trin 5,10). Pipetten cellerne direkte ind i ECM ved at placere spidsen af pipetten i ECM og forsigtigt udvise cellesuspensionen i midten af matrixen, idet du sørger for, at cellesuspensionen ikke overløb og ender på bunden af brønden.
- Hvis cellesuspensionen er overstrøet fra ECM, hvor pipettespidsen er blevet anbragt, skal spidsen fjernes fra dette sted og indsættes et andet sted i ECM. Inkubator i 40 min ved 37 °C.
Bemærk: for RNA-ekstraktion for qrtPCR, frø hver 500 mg ECM fragmenter med 3 x 105 celler i 100 μL (3.000.000 celler pr. ml, dvs., 3 x 105 celler per 100 μl, i 15% FBS-DMEM/F12).
- Hvis cellesuspensionen er overstrøet fra ECM, hvor pipettespidsen er blevet anbragt, skal spidsen fjernes fra dette sted og indsættes et andet sted i ECM. Inkubator i 40 min ved 37 °C.
- Fyld hver brønd af 24-brønd pladen med 500 μL vækstmedier for at dække de seedede ECM-fragmenter. Kultur ved 37 °C og 5% CO2 for 72 h.
- Efter 72 h, forsigtigt aspirere 15% FBS-DMEM/F12, vippe pladen lidt for at tillade medier til at samle under fragment, og placere pipettespidsen lige støder op til ECM fragment uden at forstyrre det. Efter aspirering tilsættes 500 μL differentierings medie, skiftende medier hver 2-3 dage ved hjælp af en lignende teknik, for en samlet kultur periode på 14 dage.
- Check for differentiering ved hjælp af lys mikroskopi: celler vil akkumulere lipiderne, drej brun-gul i farve og mere sfærisk i form.
Bemærk: seedede matricer kan anvendes til metabolisk testning (f. eks. glucoseoptagelses analyse, lipolyse-assay, ORO), histologi eller Immunhistokemi (IHC) eller standard vævs billeder. For fast væv ORO farvning og billeddannelse, fryse ECM-adipocyte prøver i flydende nitrogen.
- Check for differentiering ved hjælp af lys mikroskopi: celler vil akkumulere lipiderne, drej brun-gul i farve og mere sfærisk i form.
8. metabolisk fænotypebestemmelse
- Scanning af elektronmikroskopi
- Fix prøver i 2,5% glutaraldehyd i Sorensens fosfatbuffer ved 25 °c i 12 h. Postfix i 1% osmium dinitrogentetraoxid i Sorensens fosfatbuffer ved 4 °c i 1 time.
- Serielt dehydrere prøver i ethanol. Vask i hexamethyldisalizane, og luft-tør. Monter derefter på en scannings elektronmikroskopi stub med kolloid grafit. Tør, og sputter-frakke med guld.
- Optag billeder med et scannings elektronmikroskop.
- Olie rød-O farvning
- Levende væv: olie rød-O opløsning
- Aspirér forsigtigt mediet fra brønde med en pipette. Derefter vaskes prøverne en gang med 500 μL 1x PBS per brønd.
- Der fastsættes prøver med 200 μL 4% formalin i steril deioniseret H2O ved 25 °c i 15 min. Aspirér formalin med en pipette, vask prøverne to gange med 1x PBS (500 μl hver vask).
- Der tilsættes 200 μL 60% isopropanol-prøver ved 25 °C i 5 min. aspirat 60% isopropanol med en pipette.
- Plet prøver med olie rød-O-arbejdsopløsning ved 25 °C i 5 min. Aspirér olie rød-O med en pipette og vask derefter prøverne 3x med 1x PBS (500 μL hver vask). Derefter billede med et optisk mikroskop.
- Fast væv: olie rød-O bejdset kit
- Flash-fryse ECM-adipocyt prøver i optimal skæring temperatur (OCT) sammensatte og sektion (5 μm) på en kryostat.
- Placer diaset i 85% propylenglycol i DI/H2o i 2 min. Placer DIASET i Oro stain ved 60 °c i 6 min. Placer steh lide i 85% PROPYLENGLYCOL i di/h2o i 1 min. Skyl lysbilledet to gange med di/h2o.
- Placer diaset i modificeret Mayer's Hematoxylin fra Oil Red-O-farvnings sættet i 1 min. Skyl lysbilledet to gange med ledningsvand. Skyl sliden to gange med DI/H2O.
- Monter dæksedlen ved hjælp af vandigt monterings medium og billede på et mikroskop.
- RNA-ekstraktion fra ECM til qrtPCR
Bemærk: for at maksimere RNA-udbyttet skal du bruge 500 mg ECM-fragmenter seedet med 3 x 105 preadipocytter i 100 μl og differentiere som ovenfor i 6-brønd plader i 3 ml differentierings medier pr. brønd.- Når de er differentieret, overføres hver enkelt ECM-adipocyt prøve til et 50 mL konisk rør på is ved hjælp af sterile pincet.
- Vask Tom brønd med 500 μL buffer RLT. Tilsæt buffer RLT til 50 mL konisk slange med tilsvarende ECM-adipocyt prøve.
- Ved hjælp af steril saks, fint hakkes hver ECM-adipocyte prøve inden for 50 mL konisk rør, mens du holder røret på isen, indsætte saksen i koniske rør for at hakle vævet.
- Helt fryse og tø de koniske rør fra-80 °C til 37 °C 3x.
- Centrifuge koniske rør ved 500 x g og 4 °c i 10 min.
- Fjern forsigtigt supernatanten med en pipette og brug den til RNA-ekstraktion med et fibrøst vævs RNA-ekstraktions udstyr (tabel over materialer).
- Levende væv: olie rød-O opløsning
- Glucoseoptagelses analyse
- Differentiere 6 x 104 preadipocytter i 100 mg ECM fragmenter i 0,5 ml differentierings medium i 24-brønd plader som beskrevet ovenfor (punkt 5).
- Efter 14 dages differentiering, Fjern mediet og vask ECM-adipocytter en gang med 1x PBS. Tilsæt 0,5 mL/brønd serum sult medium og kultur ved 37 °C og 5% CO2 for 12 h.
- Fjern medium og vask celler to gange med 1x PBS. Tilsæt 0,5 mL/brønd 2% BSA i PBS og kultur ved 37 °C og 5% CO2 i 2 timer.
- Vask cellerne én gang med 1x PBS, tilsæt 0,5 mL/brønd 1x PBS med eller uden 200 nM insulin, og Inkuber ved 37 °C i 40 min.
- Aspirate 1x PBS, tilsæt 0,5 mL/brønd 1X PBS med 0,1 mM 2-deoxy-D-glucose, 2 μCi/mL deoxy-D-glucose, 2-[1, 2-3H (N)], med eller uden 200 Nm insulin, og Inkuber ved 37 °c og 5% Co2 for 40 min. Brug standardforholdsregler for håndtering og bortskaffelse af alle radioaktive reagenser og affald, som bemyndiget af lokale institutionelle regulatoriske vedtægter.
- Fjern mediet med en pipette og vask cellerne 3x med 1x PBS. Tilsæt 420 μL 1% SDS-opløsning i DI/H2O, og lyse celler med kraftig pipettering. Inkuber 25 °C i 10 min.
- Saml 5 μL fra hver brønd for Bradford protein assay. Overfør 400 μL af det resterende celle lysat til 2 mL scintillationsvæske i et scintillationshætte glas. Tæl 3H-2dg-aktivitet på scintillationstælleren. Analysér data som antal pr. minut normaliseret til protein, mg/mL.
- Lipolyse-analyse
- Differentiere 6 x 104 preadipocytter i 100 mg ECM fragmenter i 0,5 ml af human differentiering medium i 24-brønd plader som beskrevet ovenfor (punkt 5).
- Efter 14 dages differentiering, Fjern medium og vask celler to gange med varm 1x PBS. Tilsæt 0,5 mL serum-sult medium (uden insulin) med eller uden 3 μM Isoproterenol og kultur adipocytter ved 37 °C og 5% CO2 for 72 h.
- Saml kultur supernatanter, som kan opbevares ved-80 °C, indtil de er klar til analyse. Saml ECM i mikrocentrifugerør til DNA-kvantitation for datanormalisering.
- Pipet 2 μL af hver supernatanten i en 96-brønd mikropladen. Reserver brønde til blanke (destilleret H2O) og glycerol standardopløsning, der er fastsat i triglycerid bestemmelse kit.
- Tilsæt 270 μL frit glycerol reagens fra triglycerid bestemmelse kit til hver brønd, pipette til mix. Inkuber pladen ved 37 °C i 5 minutter.
- Måle absorbans ved 540 nm på et spektrofotometer af mikropladen.
- Beregn koncentrationen af glycerol og normalisere med DNA fra ECM:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forberedelse af fedtvæv ECM, såning med preadipocytter, og in vitro-differentiering i modne adipocytter resultere i klare sekventielle morfologiske ændringer i væv, der tillader visuel vurdering af fremskridt i hele protokollen (figur 1) . Preadipocytter, der anvendes til frø af ECM, isoleres ved hjælp af kollagenasefordøjelse fra separate moms prøver (figur 2). Scanning elektronmikroskopi af ECM-adipocyte konstruktioner på hvert trin i behandlingen afslører decellularization af ECM og efterfølgende rekapitulation af lipid-holdige adipocytter ved frø og differentiering (figur 3). Kollagen 1-specifik immun histokemi af decellularized ECM afslører vedligeholdelse af kollagen mikroarkitektur, mens olie rød-O farvning af levende og fast/sektioneret 3D ECM-adipocyte konstruktioner afslører lipid-holdige adipocytter (figur 4 A). qrtpcr fra adipocytter differentieret i ECM viser markant docetaxels opregulering af adipogenisk gener i forhold til udifferentierede preadipocytter dyrket i ECM (figur 4B). Metabolisk fænotypebestemmelse af ECM-adipocyt konstruktioner studere alle kombinationer af ECM og adipocytter fra diabetisk (DM) og ikke-diabetiker (NDM) emner afslører nedsat glukoseoptagelse og lipolytic funktion i ECM-adipocyte konstruktioner fra DM i forhold til NDM væv, rekapitulerende DM-specifikke metaboliske defekter vi har tidligere rapporteret i humane adipocytter i standard 2D kultur11. Vigtigere, NDM ECM redder insulin-stimuleret glukoseoptagelse og lipolytisk kapacitet i DM adipocytter (figur 4C)11. Tilsammen viser disse data sygdomsspecifik regulering af fedtcellerne cellulære metabolisme af ECM. Yderligere oplysninger er rapporteret i Baker et al.11.
Figur 1: workflow for ECM-adipocyte forberedelse. Dag 1: hele visceral fedtvæv prøver gennemgår tre fryse-tø cyklusser efterfulgt af natten inkubation med enzymatisk fordøjelsesvæske #1. Dag 2: efter fordøjelsen med enzymatisk opløsning #1, er prøverne fordøjet natten over med enzymatisk fordøjelsesvæske #2. På dette tidspunkt, prøver vil blive delvist delipidateret. Dag 3: efter enzymatisk fordøjelse #2 gennemgår prøverne natten inkubation med Polar solventekstraktionsopløsning, som vil fuldføre delipidationen. Efter dag 3, prøver skal være fuldt delipidateret og hvid/gennemskinnelige farve. Prøverne vaskes grundigt med skyllebufferopløsning derefter 70% ethanol og opbevares i opbevaringsløsning i 40 °c, indtil den er klar til frø med preadipocytter. Dag 4: preadipocytter er seedet i afpudsede moms efterfulgt af adipogenisk differentiering for 14 dage. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: workflow for preadipocyte isolation. MOMSEN er hakket, fordøjet med kollagenase, filtreret, centrifugeret, og den resulterende stromovaskulær celle pellet belagt og dyrket for at udvide preadipocytter. Se Baker et al. 201721 for yderligere oplysninger om human preadipocyte isolation og 2D fedtcellerne kultur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: scanning af elektronmikroskopi billeder. Intakt fedtvæv, decellularized fedtvæv, og decellularized fedtvæv genbefolket med preadipocytter og differentieret i adipogenisk medier for 14 dage. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: karakterisering af adipocytter i ECM. (A) decellularized fedtvæv ECM vedligeholder mikroarkitektur og understøtter fedtcellerne differentiering: Top: kollagen 1 Immunhistokemi af hele menneskelig moms før og efter decellularisering demonstrere vedligeholdelse af mikroarkitektur midten: 3D Konfokal photomicrografer af levende menneskelige adipocytter inden for ECM; intakt decellularized menneskelig moms farvet med olie rød-O før frø med preadipocytter, 4 dage efter såning, og 14 dage efter såning med preadipocytter efterfulgt af adipogenisk differentiering; blå: DAPI farvning af cellekerner; rød: olie rød-O farvning af intracellulære lipid; bund: formalin-fast, paraffin-indlejret, 5 μm sektioneret, olie rød-O-plettet menneskelig moms før decellularization, umiddelbart efter decellularization, og efter decellularization, preadipocyte-såning, og 14 dage af adipogenisk differentiering, demonstrere cytoplasmisk lipid ophobning i adipocytter inden ECM. (B) adipocytter i ECM upregulate adipogenisk genekspression: qrtpcr analyse sammenligne adipogenisk gen transskription niveauer i RNA fra Human vat adipocytter differentieret i moms ECM for 14 dage i forhold til udifferentierede preadipocytter i moms ECM dyrkes for 72 h i nonadipogenic medier. Data er betyde ± SEM. acly: ATP citrat lyase, atgl: fedtvæv triglycerid lipase, FASN: fedtsyre syntase, pparg: peroxysomproliferativ aktiveret receptor gamma; koordinere: fold forskel i transskription niveau i modne adipocytter i forhold til udifferentieret preadipocyte referent = 1; alle fold forskelle signifikant (p < 0,001, parret t-test); ECM fra 10, preadipocytter/adipocytter fra n = 11. (C) ECM regulerer fedtcellerne metabolisme i en DM-specifik måde: 3D-ECM fra DM eller NDM emner seedet med preadipocytter fra DM eller NDM, differentieret i adipocytter, og studerede med metabolisk phenotyping. Data søjler mærket med patient kilde (NDM, DM) af ECM og adipocytter (ECM/AD); f. eks. angiver NDM/NDM både ECM-og preadipocytter afledt af NDM-patienter, mens NDM/DM betegner ECM fra NDM-patienter kombineret med preadipocytter fra DM-patienter. Data er betyde ± SEM. Ordinater: glukoseoptagelse (CPM), normaliseret til ECM/Cell lysat proteinkoncentration (mg/ml); lipolyse: kultur supernatanten glycerol koncentration (mg/ml) normaliseret til ECM/Cell lysat DNA-koncentration (ng/ml); * p < 0.050, * * p < 0.100 sammenligne indikeret datapunkt med tilsvarende datapunkt (basal eller insulin-stimuleret for glukoseoptagelse, basal eller Isoproterenol-stimuleret til lipolyse) i DM/DM-armen, ved hjælp af blandet model analyse justering for gentagne foranstaltninger ECM fra n = 9 NDM, 8 DM-forsøgspersoner, preadipocytter fra 10 NDM, 9 DM-forsøgspersoner for glukoseoptagelse; ECM fra 6 NDM, 6 DM emner, preadipocytter fra 6 NDM, 6 DM emner for lipolyse. Dette tal er blevet tilpasset fra O'Rourke og Lumeng11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ECM-adipocyte kulturmodel giver et værdifuldt værktøj til at dissektere de enkelte roller af ECM og celler i diktere ultimative væv fænotype. ECM-isolations protokollen er ganske reproducerbar, men variabilitet i decellulariseringsproces kan observeres. Den dag 3 delipidation Step er et kritisk punkt i protokollen. Ved afslutningen af den overnight ekstraktion skal delipidation af matrixen dokumenteres ved den polære solvent opløsning, der bliver gul, mens matrixen skal overgå fra en gul-orange farve karakteristisk for intakt fedtvæv til gennemskinnelige/ hvid (figur 1). Hvis disse farveændringer ikke forekommer, er delipidation sandsynligvis ikke fuldført. Interpatient variabilitet i delipidation effektivitet er fælles, men til dato har vi ikke observeret nogen sammenhæng af effektiviteten af delipidation med subject DM status, alder, BMI, eller andre kliniske variabler. Store prøver (større end 20 g) vil ikke blive underkastet en effektiv delipidation; behandling af prøver < 20 g kan forhindre dette problem. Hvis en prøve ikke er helt delipidateret efter dag 3, skal prøven opdeles i halve med steril saks, hvorefter prøverne overføres til frisk 15-20 mL Polar solvent ekstraktionsopløsning og placeres på en orbital shaker for 3-5 h. Nogle prøver kan ikke helt decellularize efter gentagelse af Polar solventekstraktion trin. Hvis et flertal af prøven er decellularized, er det muligt at skære de sektioner, der indeholder lipid, før du bruger prøven i eksperimenter.
Kontaminering kan forekomme, hvis sterilitet ikke vedligeholdes flittigt under hele processen. Alt arbejde skal udføres i en laminar flow hætte ved hjælp af standard cellekultur forholdsregler. Vi opbevarer typisk ECM i op til 3 måneder ved 4 °C og preadipocytter i op til 6 måneder i flydende nitrogen. Fastholdelse af biofuctionalitet og sygdoms-og Depot specifikke egenskaber ud over dette tidspunkt er ikke blevet afprøvet.
Confokal mikroskopi tillader visualisering af modne adipocytter i ECM, som kan forbedres med olie rød-O farvning. Scanning elektronmikroskopi (SEM) giver også en ikke-kvantitativ metode til visualisering af adipocytter inden for ECM. Af Bemærk, SEM og olie rød-O farvning foreslå unilokulære adipocytter i ECM-adipocyte konstruktioner, en morfologi, der ligner in vivo adipocytter og i modsætning til de typiske multilocular is adipocytter observeret når preadipocytter gennemgår adipogenisk differentiering på 2D-plastik (figur 3, figur 4A). Denne observation tyder på, at ECM giver en mere fysiologisk miljø for adipogenisk differentiering end standard vævskultur på plastik. Fiksering og skæring af ECM-adipocyte konstruktioner kan være svært, som OCT-indlejrede konstruktioner er skrøbelige og ikke sektion let. Skæring af indlejret væv umiddelbart efter fjernelse fra opbevaring fra-80 °C fryser og udførelse af skæring i et koldtrum (4 °C) på en præ-kølet kryostat gør skæring mulig.
ECM-adipocyte kultur giver et fysiologisk miljø, der tilnærme in vivo fedtvæv miljø og giver et bæredygtigt miljø for preadipocyte stamcelle vækst og differentiering, som det fremgår af docetaxels opregulering af adipogenisk gener i 3D-ECM-adipocyte kultur. ECM-fedtcellerne kulturer også engagere sig i fedtcellerne metaboliske funktioner, herunder glukoseoptagelse og lipolyse8. Vi rapporterer glukoseoptagelse som CPM normaliseret til enten samlede protein udvundet fra ECM-adipocyte kulturer målt med en Bradford assay, eller til DNA-indhold målt med et DNA-assay kit, og har observeret lignende resultater med begge metoder. På samme måde rapporterer vi lipolyse som mg/mL glycerol Frigivelse normaliseret til enten protein eller DNA, også med lignende resultater opnået med enten normaliserings metode. Andre foreslår at normalisere fedtcellerne metaboliske data til lipid indhold, men til dato vores forsøg på pålideligt ekstrakt lipid fra ECM konstruktioner har været mislykket. Indberetning glukoseoptagelse sats som mol af glucose per enhed af tid og lipolyse som mol af glycerol/fri fedtsyre pr tidsenhed kan tillade mere præcise sammenligninger mellem separate eksperimenter. Isolering af RNA fra ECM for qrtPCR analyse er karakteriseret ved lavere udbytter sammenlignet med celler i 2D-kultur, men forberedelsen af større ECM-fragmenter seedet med flere celler overvinder dette problem, som beskrevet i trin 8.3.1. Vi er stødt på vanskeligheder med at isolere tilstrækkelige mængder af uomdannet protein med phosphomoier intakt for Western blot analyse, hvilket repræsenterer en begrænsning af modellen.
Lignende metode til isolering af ECM fra fedtvæv og såning med preadipocytter er tidligere blevet offentliggjort, med dokumentation for, at ECM kan fremme adipogenisk differentiering fraværende klassiske adipogenisk mediatorer herunder Camp agonister, insulin og ppar-γ-agonister12,14. Vores data er den første til at demonstrere sygdomsspecifik regulering af cellulære metabolisme af ECM i fedtvæv, ved hjælp af metoder, hvor adipocytter stimuleres med klassiske adipogenisk differentierings faktorer11; lignende undersøgelser i fravær af adipogenisk stimuli er et mål for fremtidig forskning. Andre har vist lignende sygdomsspecifikke ECM-celle krydstale ved hjælp af ECM og celler isoleret fra lungevævet19,20. Alternative strategier har også været anvendt, herunder skabelse af matricer ved at blande homogeniseret fedtvæv ECM præparater i peptid silicagelrogeler12.
Mens interpatient variabilitet i humant adipocyt cellulære metabolisme observeres i både 2D-plastik og 3D-ECM kultur, når analyseret i aggregeret, disse celler manifestere sygdoms-, Depot-og kønsspecifikke forskelle i cellulær metabolisme, som beskrevet af vores gruppe og andre11,21,22,23,24, validering af nytte og generaliserbarhed af disse kultur modeller for studiet af fedtcellerne cellulære metabolisme. Vi har vist, at adipocytter differentieret i sygdoms matchede ECM (dvs. NDM adipocytter i NDM ECM, DM adipocytter i DM ECM) rekapitulere metaboliske phenotyper af isolerede NDM og DM adipocytter i standard 2D kultur, støtte ECM-adipocyte kultur som en model for at studere sygdomsspecifikke ændringer i fedtcellerne cellulære metabolisme i et mere fysiologisk miljø. Vi har ikke observeret forskelle i omfanget eller retningen af metaboliske funktioner, herunder glukoseoptagelse eller lipolyse, når ECM og adipocytter fra samme eller forskellige donorer er undersøgt. I begge tilfælde, ECM-adipocyte konstruerer manifesteret DM-specifik metabolisk fænotype (f. eks nedsat GU i DM/DM i forhold til NDM/NDM konstruktioner), med ingen klar forskel, når man sammenligner konstruktioner består af ECM og adipocytter fra samme eller forskellige donorer .
ECM-adipocyte kultur giver mulighed for undersøgelse af kombinationer af ECM og preadipocytter fra særskilte patientpopulationer og vævs depoter, tillader analyse af sygdoms-og Depot-specifikke bidrag af ECM og adipocytter til ultimative fedtvæv metaboliske Fænotype. Viser denne styrke af ECM-adipocyte kulturmodel, vi har vist, at ECM fra NDM væv har kapacitet til at redde metaboliske defekter i DM adipocytter (figur 4C)11. Foreløbige data i murine visceral og subkutant fedtvæv tyder på, at murine ECM regulerer murine fedtcellerne metabolisme på samme måde i en Depot-specifik måde (ikke-offentliggjorte data, O'Rourke RW, 2019), tyder på, at denne model system kan anvendes til at studere ECM-adipocyte krydstale i både murine og menneskelige systemer. Desuden, denne model tillader undersøgelse af isolerede manipulation af ECM som et middel til at regulere fedtvæv fænotype. Indledende undersøgelse af ECM behandlet under forhold, der inducerer glykering målrettet specifikt til ECM, for eksempel, tyder på, at disse ændringer regulerer cellulær metabolisk fænotype af celler efterfølgende seedet behandlet ECM (ikke-offentliggjorte data, O'Rourke RW, 2019), der giver en model for undersøgelse af virkningerne af målrettede manipulation af ECM på fedtcellerne fænotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen modstridende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa og Retha Geiss for at hjælpe med koordinering af studier. SEM blev udført af University of Michigan mikroskopi & billedanalyse laboratorium biomedicinsk forskning kerne facilitet. Dette projekt blev støttet af NIH Grants R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), veteraner anliggender Merit Grant I01CX001811 (RWO), pilot og gennemførligheds støtte fra Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Veterans administration VISN 10 SPARK pilot Grant (RWO). Scanning elektronmikroskopi udført af University of Michigan mikroskopi & billedanalyse laboratorium biomedicinsk forskning kerne facilitet. Figur 4 i dette manuskript blev oprindeligt udgivet i Baker et al., J Clin endo Metab 2017; 1. marts 102, stk. 3, 1032-1043. Doi: 10.1210/JC. 2016-2915, og er blevet gengivet med tilladelse fra Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. For tilladelse til at genbruge dette materiale, kan du besøge http://global.oup.com/academic/rights.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#25200056 | |
| 1.5 mL cryovial tube | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#02-682-557 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#89370-094 | |
| 100 µm nylon mesh filter | Corning Inc., Corning, NY, USA | Cat#352360 | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#D8375 | |
| 2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T6397 | |
| 24-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-700 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I5879 | |
| 96-well tissue culture plates | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10861-666 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#15240062 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#B4639 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#A8806 | |
| Buffer RLT | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#79216 | |
| Ciglitizone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#C3974 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]- | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | Cat#NET328A250UC | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4513 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#D4902 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP231 | Flammable, caustic |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#BP118 | |
| D-pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#21210 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12 | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#11320033 | |
| Ethanol | Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA | Cat#DSP-MD.43 | Flammable |
| EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#10437028 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#G5882 | Caustic |
| Hexamethyldisalizane | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#440191 | Flammable, caustic |
| Human insulin solution | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#I9278 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A415 | Flammable |
| Isoproterenol | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#I5627 | Flammable |
| KCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S25484 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#P5655 | |
| Lipase from porcine pancreas, type VI-S | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#L0382 | |
| MgSO4*7H2O | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#230391 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#S233 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#A661 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK | Cat# AGR1180 | |
| Oil Red-O Solution (ORO) | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#O1391 | |
| Oil Red-O Stain Kit | American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA | Cat#KTORO-G | |
| Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#201030 | Caustic |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#93482 | Caustic |
| Phosphate Buffered Saline Solution (PBS) | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SH3025601 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#R5125 | |
| RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit | Qiagen, Hilden, Germany | Cat#74704 | |
| Scintillation Fluid | Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#SX18 | |
| Scintillation Counter | |||
| Scissors, forceps, sterile | |||
| Sorensen's phosphate buffer | Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ | CAS #: 10049-21-5 | |
| T-150 culture flask | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10062-864 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA | Cat#4369016 | |
| Temperature-controlled orbital shaker | |||
| Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer | Benchmark Scientific | Cat#D1030 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA | Cat#T3309 | |
| Triglyceride Determination Kit | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#TR0100 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | VWR International LLC., Radnor, PA, USA | Cat#10027-446 | |
| Type II collagenase | Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | Cat#17101015 | |
| Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm | Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA | Cat#WHA5201150 |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
- Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
- O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
- Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
- Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
- Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
- Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
- Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
- Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
- Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
- Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
- Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).
- Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
- O'Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).
