Summary

Räumliche Temporale Analyse des feldweisen Flusses in der Mikrovaskulatur

Published: November 18, 2019
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Summary

Um den mikrovaskulären Fluss aus Hochgeschwindigkeits-Kapillarflussbildsequenzen zu quantifizieren, haben wir die Software STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow) entwickelt. Im gesamten Bildfeld und im Laufe der Zeit wertet STAFF Strömungsgeschwindigkeiten aus und generiert eine Sequenz farbcodierter Raumkarten für die Visualisierung und Tabellarische Ausgabe für quantitative Analysen.

Abstract

Veränderungen der Durchblutungsgeschwindigkeit und -verteilung sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Gewebe- und Organperfusion als Reaktion auf unterschiedliche zelluläre Bedürfnisse. Darüber hinaus kann das Auftreten von Defekten in der Mikrozirkulation ein Primärindikator für die Entwicklung mehrerer Pathologien sein. Fortschritte in der optischen Bildgebung haben die Intravital-Mikroskopie (IVM) zu einem praktischen Ansatz gemacht, der die Bildgebung auf zellulärer und subzellulärer Ebene bei lebenden Tieren mit hoher Geschwindigkeit im Laufe der Zeit ermöglicht. Doch trotz der Bedeutung der Aufrechterhaltung einer ausreichenden Gewebeperfusion ist die räumliche und zeitliche Variabilität des Kapillarflusses selten dokumentiert. Im Standardansatz wird eine kleine Anzahl von Kapillarsegmenten für die Bildgebung über einen begrenzten Zeitpunkt ausgewählt. Um den Kapillarfluss unvoreingenommen zu quantifizieren, haben wir die Räumliche Temporalanalyse des feldweisen Flusses (STAFF), ein Makro für FIJI Open Source Bildanalysesoftware, entwickelt. Mithilfe von Hochgeschwindigkeits-Bildsequenzen von vollen Blutflussfeldern innerhalb von Kapillaren erzeugt STAFF Bilder, die Bewegungen im Zeitverlauf darstellen, die für jedes Zeitintervall für jedes Gefäßsegment als Kymographen bezeichnet werden. Aus den Kymographen berechnet STAFF Geschwindigkeiten aus der Entfernung, die rote Blutkörperchen im Laufe der Zeit bewegen, und gibt die Geschwindigkeitsdaten als eine Sequenz von farbcodierten Raumkarten für die Visualisierung und tabellarische Ausgabe für quantitative Analysen aus. In normalen Mauslebern quantifizierte STAFF-Analysen tiefgreifende Unterschiede in der Strömungsgeschwindigkeit zwischen pericentral- und periportal-Regionen innerhalb von Lobulen. Noch unerwarteter sind die Unterschiede in der Strömungsgeschwindigkeit zwischen Sinusoiden, die nebeneinander stehen, und Schwankungen, die innerhalb einzelner Gefäßsegmente über Sekunden gesehen werden. STAFF ist ein leistungsstarkes neues Werkzeug, das neue Erkenntnisse liefern kann, indem es die Messung der komplexen raumzeitlichen Dynamik des Kapillarflusses ermöglicht.

Introduction

Die Mikrovaskulatur spielt eine entscheidende Rolle in der Physiologie und sorgt für eine effektive Perfusion von Geweben unter wechselnden Bedingungen. Mikrovaskuläre Dysfunktion ist verbunden mit unzähligen Erkrankungen einschließlich langfristiger kardiovaskulärer Morbidität und Mortalität, Entwicklung von Demenz und Erkrankungen von Leber und Niere und ist daher ein Schlüsselfaktor von Interesse in einem breiten Spektrum von biomedizinischen Untersuchungen1,2,3,4,5. Während mehrere Techniken zur Bewertung der Gewebeperfusion eingesetzt wurden, ermöglicht nur die intravitale Mikroskopie die Datenerfassung in der zeitlichen und räumlichen Auflösung, die notwendig ist, um den Blutfluss auf der Ebene einzelner Kapillaren zu charakterisieren.

Der mikrovaskuläre Fluss kann in der Fluoreszenzmikroskopie entweder durch Bewegung fluoreszierender Mikrosphären oder durch die Bewegung roter Blutkörperchen vor dem Hintergrund membranimpermeant Fluoreszenzmarker (z.B. fluoreszierend dextran oder albumin)6,7visualisiert werden. Der mikrovaskuläre Fluss kann in oberflächlichen Zellschichten mittels Weitfeldmikroskopie oder in der Tiefe mit der konfokalen oder multiphotonen Mikroskopie abgebildet werden. Die Kapillardurchflussraten sind jedoch so, dass der Durchgang roter Blutkörperchen in der Regel nicht mit Geschwindigkeiten unter 60 Frames/s erfasst werden kann. Da die meisten Laserscanning-Konfokal- und Multiphotonenmikroskope 1-5 s benötigen, um ein vollständiges Bildfeld zu scannen, kann diese Geschwindigkeit in der Regel nur erreicht werden, indem das Sichtfeld eingeschränkt wird, manchmal auf eine einzige Scanlinie8. Der Prozess der Begrenzung von Messungen auf ausgewählte Kapillarsegmente (1) hat das Potenzial, Selektionsverzerrungen einzuführen und (2) macht es unmöglich, räumliche und zeitliche Heterogenität in den Raten des kapillaren Blutflusses zu erfassen. Im Gegensatz dazu können Bilder von Kapillarnetzwerken mit Geschwindigkeiten von mehr als 100 fps mit Widefield-Digitalmikroskopen gesammelt werden, die mit wissenschaftlichen Komplementär-Metalloxid-Halbleiterkameras (sCMOS)9,10ausgestattet sind. Diese kostengünstigen Systeme, die in typischen biomedizinischen Laboratorien üblich sind, ermöglichen es, den mikrovaskulären Fluss über ganze zweidimensionale Netzwerke im Wesentlichen kontinuierlich abzubilden. Das Problem wird dann zu einem Analyseansatz, der in der Lage ist, aussagekräftige quantitative Daten aus den massiven und komplexen Bild-Datasets zu extrahieren, die durch die Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie generiert werden.

Um die Analyse von Vollfeld-Flow-Daten zu ermöglichen, haben wir STAFF entwickelt, eine neuartige Bildanalysesoftware, die kontinuierlich den mikrovaskulären Fluss in ganzen Mikroskopfeldern von Bildreihen messen kann, die mit hoher Geschwindigkeit11gesammelt wurden. Der Ansatz ist mit einer Vielzahl unterschiedlicher experimenteller Systeme und Bildgebungsmodalitäten kompatibel und die STAFF Bildanalyse-Software wird als Makro-Toolset für die FIJI-Implementierung von ImageJ12implementiert. Das zugrunde liegende Prinzip, das hier verwendet wird, um den mikrovaskulären Fluss zu visualisieren, ist, dass zuerst ein gewisser Kontrast vorgesehen werden muss, um die roten Blutkörperchen innerhalb von Kapillaren abbilden zu können. In unseren Studien wird der Kontrast durch eine massenhaft fluoreszierende Sonde bereitgestellt, die von den roten Blutkörperchen ausgeschlossen wird. Die Strömungsgeschwindigkeit kann dann aus der Verschiebung der roten Blutkörperchen quantifiziert werden, die als negativer Fleck innerhalb des fluoreszierend markierten Plasmas in Bildern erscheinen, die mit hoher Geschwindigkeit von einem lebenden Tier gesammelt wurden8. Wir verwenden dann STAFF, um Entfernungsdiagramme entlang jedes Kapillarsegments über mehrere Zeitintervalle zu erstellen, die als Kymographen bezeichnet werden, und dann die in den Kymographen13vorhandenen Steigungen zu erkennen, und von diesen Hängen aus berechnen wir die Raten des mikrovaskulären Flusses. Der Ansatz kann auf Bilder angewendet werden, die von jedem Kapillarbett gesammelt wurden, auf das für die Bildgebung zugegriffen werden kann. Hier beschreiben wir die Anwendung von IVM und STAFF auf Studien des Blutflusses in der Leber.

Protocol

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Indiana University genehmigt und durchgeführt und hielten sich an den NRC-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Tieren. 1. Chirurgische Präparation für die Intravital-Mikroskopie HINWEIS: Dies ist keine Überlebensoperation. Sobald Abschnitt 1 “Chirurgische Präparation für die intravitale Mikroskopie” begonnen hat, können die Arbeiten bis …

Representative Results

Die STAFF-Analyse erzeugt eine vollständige Zählung der mikrovaskulären Geschwindigkeiten über ganze Mikroskopfelder hinweg über Zeiträume von Sekunden bis Minuten. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3und Abbildung 4dargestellt. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für eine Zeitreihe des mikrovaskulären Netzwerks in der Leber einer Maus…

Discussion

Dieses Protokoll enthält mehrere wichtige Schritte. Erstens ist die Minimierung der Bewegung während der intravitalen Bildgebung der Leber wichtig für die Erzeugung von Filmen, die für die Kapillarflussanalyse mit STAFF verwendet werden können. Aufgrund der Nähe des Zwerchfells treten kurze Phasen der Atmungs-induzierten Bewegung auf, wobei die gesicherte Leber nach jedem Atemzug in ihre Ausgangsposition zurückkehrt. Die Sicherung der chirurgisch exponierten Leber gegen die Abdeckungsplatte mit Gaze, dann die Bild…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die hier vorgestellten Studien wurden durch Fördermittel der National Institutes of Health (NIH U01 GM111243 und NIH NIDDK P30 DK079312) unterstützt. Intravitale Mikroskopie-Studien wurden am Indiana Center for Biological Microscopy durchgeführt. Wir danken Dr. Malgorzata Kamocka für die technische Unterstützung bei der Mikroskopie.

Materials

#5 forceps Fine Science Tools 11251-20 Dumont #5 Inox Forceps
C57BL/6 mice Jackson Labs male 9-12 weeks old
Cannula Instech BTPE-10 Polyethylene Tubing .011x.024in
CMOS camera Hamamatsu C11440-42U30 4.0LT Scientific CMOS
Coverslip-bottomed dish Electron Microscopy Sciences WillCo Dish glass bottom GWST5040
Dissecting scissors Fine Science Tools
Fiji ImageJ Image analysis software https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip
Fluorescein dextran Thermo Fisher, Invitrogen D1822 Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable
Gauze sponge Fisher 22-415-504 2×2 inch Dukal sterile gauze sponges
Heating pad Reptitherm RH-4 between mouse and stage
Heating pad Sunbeam 000732-500-000U over mouse
Inverted epifluorescence microscope Nikon Nikon TiE inverted microscope
Isis Rodent electric shaver Braun Aesculap GT420
Isofluorane Abbott GmbH PZN4831850
Luer stub adapter Fisher 14-826-19E Catheter adapter
Micro scissors Castro Viejo
Microscope objective Nikon Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion
Needle Fisher 30 Ga.x1/2"
Needle holder Olsen-Hegar
Objective heater BioScience Tools MTC-HLS-025 Temperature controller with objective heater
Rectal thermometer Braintree Scientific, INC TH-5A Mouse Body Temperature monitoring
STAFF macros https://github.com/icbm-iupui/STAFF
Suture string Harvard Bioscience 723288 silk black suture, 6-0, spool

References

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Clendenon, S. G., Fu, X., Von Hoene, R. A., Clendenon, J. L., Sluka, J. P., Winfree, S., Mang, H., Martinez, M., Filson, A., Klaunig, J. E., Glazier, J. A., Dunn, K. W. Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow in Microvasculature. J. Vis. Exp. (153), e60493, doi:10.3791/60493 (2019).

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