Räumliche Temporale Analyse des feldweisen Flusses in der Mikrovaskulatur
Summary
Um den mikrovaskulären Fluss aus Hochgeschwindigkeits-Kapillarflussbildsequenzen zu quantifizieren, haben wir die Software STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow) entwickelt. Im gesamten Bildfeld und im Laufe der Zeit wertet STAFF Strömungsgeschwindigkeiten aus und generiert eine Sequenz farbcodierter Raumkarten für die Visualisierung und Tabellarische Ausgabe für quantitative Analysen.
Abstract
Veränderungen der Durchblutungsgeschwindigkeit und -verteilung sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Gewebe- und Organperfusion als Reaktion auf unterschiedliche zelluläre Bedürfnisse. Darüber hinaus kann das Auftreten von Defekten in der Mikrozirkulation ein Primärindikator für die Entwicklung mehrerer Pathologien sein. Fortschritte in der optischen Bildgebung haben die Intravital-Mikroskopie (IVM) zu einem praktischen Ansatz gemacht, der die Bildgebung auf zellulärer und subzellulärer Ebene bei lebenden Tieren mit hoher Geschwindigkeit im Laufe der Zeit ermöglicht. Doch trotz der Bedeutung der Aufrechterhaltung einer ausreichenden Gewebeperfusion ist die räumliche und zeitliche Variabilität des Kapillarflusses selten dokumentiert. Im Standardansatz wird eine kleine Anzahl von Kapillarsegmenten für die Bildgebung über einen begrenzten Zeitpunkt ausgewählt. Um den Kapillarfluss unvoreingenommen zu quantifizieren, haben wir die Räumliche Temporalanalyse des feldweisen Flusses (STAFF), ein Makro für FIJI Open Source Bildanalysesoftware, entwickelt. Mithilfe von Hochgeschwindigkeits-Bildsequenzen von vollen Blutflussfeldern innerhalb von Kapillaren erzeugt STAFF Bilder, die Bewegungen im Zeitverlauf darstellen, die für jedes Zeitintervall für jedes Gefäßsegment als Kymographen bezeichnet werden. Aus den Kymographen berechnet STAFF Geschwindigkeiten aus der Entfernung, die rote Blutkörperchen im Laufe der Zeit bewegen, und gibt die Geschwindigkeitsdaten als eine Sequenz von farbcodierten Raumkarten für die Visualisierung und tabellarische Ausgabe für quantitative Analysen aus. In normalen Mauslebern quantifizierte STAFF-Analysen tiefgreifende Unterschiede in der Strömungsgeschwindigkeit zwischen pericentral- und periportal-Regionen innerhalb von Lobulen. Noch unerwarteter sind die Unterschiede in der Strömungsgeschwindigkeit zwischen Sinusoiden, die nebeneinander stehen, und Schwankungen, die innerhalb einzelner Gefäßsegmente über Sekunden gesehen werden. STAFF ist ein leistungsstarkes neues Werkzeug, das neue Erkenntnisse liefern kann, indem es die Messung der komplexen raumzeitlichen Dynamik des Kapillarflusses ermöglicht.
Introduction
Die Mikrovaskulatur spielt eine entscheidende Rolle in der Physiologie und sorgt für eine effektive Perfusion von Geweben unter wechselnden Bedingungen. Mikrovaskuläre Dysfunktion ist verbunden mit unzähligen Erkrankungen einschließlich langfristiger kardiovaskulärer Morbidität und Mortalität, Entwicklung von Demenz und Erkrankungen von Leber und Niere und ist daher ein Schlüsselfaktor von Interesse in einem breiten Spektrum von biomedizinischen Untersuchungen1,2,3,4,5. Während mehrere Techniken zur Bewertung der Gewebeperfusion eingesetzt wurden, ermöglicht nur die intravitale Mikroskopie die Datenerfassung in der zeitlichen und räumlichen Auflösung, die notwendig ist, um den Blutfluss auf der Ebene einzelner Kapillaren zu charakterisieren.
Der mikrovaskuläre Fluss kann in der Fluoreszenzmikroskopie entweder durch Bewegung fluoreszierender Mikrosphären oder durch die Bewegung roter Blutkörperchen vor dem Hintergrund membranimpermeant Fluoreszenzmarker (z.B. fluoreszierend dextran oder albumin)6,7visualisiert werden. Der mikrovaskuläre Fluss kann in oberflächlichen Zellschichten mittels Weitfeldmikroskopie oder in der Tiefe mit der konfokalen oder multiphotonen Mikroskopie abgebildet werden. Die Kapillardurchflussraten sind jedoch so, dass der Durchgang roter Blutkörperchen in der Regel nicht mit Geschwindigkeiten unter 60 Frames/s erfasst werden kann. Da die meisten Laserscanning-Konfokal- und Multiphotonenmikroskope 1-5 s benötigen, um ein vollständiges Bildfeld zu scannen, kann diese Geschwindigkeit in der Regel nur erreicht werden, indem das Sichtfeld eingeschränkt wird, manchmal auf eine einzige Scanlinie8. Der Prozess der Begrenzung von Messungen auf ausgewählte Kapillarsegmente (1) hat das Potenzial, Selektionsverzerrungen einzuführen und (2) macht es unmöglich, räumliche und zeitliche Heterogenität in den Raten des kapillaren Blutflusses zu erfassen. Im Gegensatz dazu können Bilder von Kapillarnetzwerken mit Geschwindigkeiten von mehr als 100 fps mit Widefield-Digitalmikroskopen gesammelt werden, die mit wissenschaftlichen Komplementär-Metalloxid-Halbleiterkameras (sCMOS)9,10ausgestattet sind. Diese kostengünstigen Systeme, die in typischen biomedizinischen Laboratorien üblich sind, ermöglichen es, den mikrovaskulären Fluss über ganze zweidimensionale Netzwerke im Wesentlichen kontinuierlich abzubilden. Das Problem wird dann zu einem Analyseansatz, der in der Lage ist, aussagekräftige quantitative Daten aus den massiven und komplexen Bild-Datasets zu extrahieren, die durch die Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie generiert werden.
Um die Analyse von Vollfeld-Flow-Daten zu ermöglichen, haben wir STAFF entwickelt, eine neuartige Bildanalysesoftware, die kontinuierlich den mikrovaskulären Fluss in ganzen Mikroskopfeldern von Bildreihen messen kann, die mit hoher Geschwindigkeit11gesammelt wurden. Der Ansatz ist mit einer Vielzahl unterschiedlicher experimenteller Systeme und Bildgebungsmodalitäten kompatibel und die STAFF Bildanalyse-Software wird als Makro-Toolset für die FIJI-Implementierung von ImageJ12implementiert. Das zugrunde liegende Prinzip, das hier verwendet wird, um den mikrovaskulären Fluss zu visualisieren, ist, dass zuerst ein gewisser Kontrast vorgesehen werden muss, um die roten Blutkörperchen innerhalb von Kapillaren abbilden zu können. In unseren Studien wird der Kontrast durch eine massenhaft fluoreszierende Sonde bereitgestellt, die von den roten Blutkörperchen ausgeschlossen wird. Die Strömungsgeschwindigkeit kann dann aus der Verschiebung der roten Blutkörperchen quantifiziert werden, die als negativer Fleck innerhalb des fluoreszierend markierten Plasmas in Bildern erscheinen, die mit hoher Geschwindigkeit von einem lebenden Tier gesammelt wurden8. Wir verwenden dann STAFF, um Entfernungsdiagramme entlang jedes Kapillarsegments über mehrere Zeitintervalle zu erstellen, die als Kymographen bezeichnet werden, und dann die in den Kymographen13vorhandenen Steigungen zu erkennen, und von diesen Hängen aus berechnen wir die Raten des mikrovaskulären Flusses. Der Ansatz kann auf Bilder angewendet werden, die von jedem Kapillarbett gesammelt wurden, auf das für die Bildgebung zugegriffen werden kann. Hier beschreiben wir die Anwendung von IVM und STAFF auf Studien des Blutflusses in der Leber.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll enthält mehrere wichtige Schritte. Erstens ist die Minimierung der Bewegung während der intravitalen Bildgebung der Leber wichtig für die Erzeugung von Filmen, die für die Kapillarflussanalyse mit STAFF verwendet werden können. Aufgrund der Nähe des Zwerchfells treten kurze Phasen der Atmungs-induzierten Bewegung auf, wobei die gesicherte Leber nach jedem Atemzug in ihre Ausgangsposition zurückkehrt. Die Sicherung der chirurgisch exponierten Leber gegen die Abdeckungsplatte mit Gaze, dann die Bild…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die hier vorgestellten Studien wurden durch Fördermittel der National Institutes of Health (NIH U01 GM111243 und NIH NIDDK P30 DK079312) unterstützt. Intravitale Mikroskopie-Studien wurden am Indiana Center for Biological Microscopy durchgeführt. Wir danken Dr. Malgorzata Kamocka für die technische Unterstützung bei der Mikroskopie.
Materials
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
| Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing .011x.024in |
| CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
| Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
| Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
| Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
| Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2×2 inch Dukal sterile gauze sponges |
| Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
| Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
| Micro scissors | Castro Viejo | ||
| Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
| Needle | Fisher | 30 Ga.x1/2" | |
| Needle holder | Olsen-Hegar | ||
| Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
| Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
| STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
| Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |
References
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