Para cuantificar el flujo microvascular a partir de secuencias de imágenes de flujo capilar de alta velocidad, desarrollamos el software STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow). A lo largo del campo de imagen completo y a lo largo del tiempo, STAFF evalúa las velocidades de flujo y genera una secuencia de mapas espaciales codificados por colores para la visualización y la salida tabular para análisis cuantitativos.
Los cambios en la velocidad y distribución del flujo sanguíneo son vitales para mantener la perfusión de tejidos y órganos en respuesta a las diferentes necesidades celulares. Además, la aparición de defectos en la microcirculación puede ser un indicador principal en el desarrollo de múltiples patologías. Los avances en la imagen óptica han hecho de la microscopía intravital (IVM) un enfoque práctico, permitiendo la toma de imágenes a nivel celular y subcelular en animales vivos a alta velocidad en el tiempo. Sin embargo, a pesar de la importancia de mantener una perfusión de tejido adecuada, rara vez se documenta la variabilidad espacial y temporal en el flujo capilar. En el enfoque estándar, se elige un pequeño número de segmentos capilares para la toma de imágenes durante un tiempo limitado. Para cuantificar exhaustivamente el flujo capilar de una manera imparcial, desarrollamos el Análisis Temporal Espacial del Flujo Fieldwise (STAFF), una macro para el software de análisis de imágenes de código abierto fiji. Utilizando secuencias de imágenes de alta velocidad de campos completos de flujo sanguíneo dentro de los capilares, STAFF produce imágenes que representan movimiento a lo largo del tiempo llamados kymographs para cada intervalo de tiempo para cada segmento vascular. A partir de los kymographs, STAFF calcula las velocidades a partir de la distancia a la que se mueven los glóbulos rojos a lo largo del tiempo y genera los datos de velocidad como una secuencia de mapas espaciales codificados por colores para la visualización y la salida tabular para análisis cuantitativos. En los hígados de ratón normales, STAFF analiza las diferencias profundas cuantificadas en la velocidad de flujo entre las regiones pericentrales y periportal dentro de los lóbulos. Aún más inesperadas son las diferencias en la velocidad de flujo que se ven entre los sinusoides que están lado a lado y las fluctuaciones que se ven dentro de segmentos vasculares individuales durante segundos. STAFF es una nueva herramienta poderosa capaz de proporcionar nuevos conocimientos al permitir la medición de la compleja dinámica espaciotemporal del flujo capilar.
La microvasculatura desempeña un papel crítico en la fisiología, asegurando la perfusión efectiva de los tejidos en condiciones cambiantes. La disfunción microvascular se asocia con innumerables afecciones, incluyendo la morbilidad cardiovascular y mortalidad a largo plazo, el desarrollo de la demencia y la enfermedad tanto del hígado como del riñón y, por lo tanto, es un factor clave de interés en una amplia gama de investigaciones biomédicas1,2,3,4,5. Mientras que se han utilizado múltiples técnicas para evaluar la perfusión tisular, sólo la microscopía intravital permite la recopilación de datos a la resolución temporal y espacial necesaria para caracterizar el flujo sanguíneo a nivel de capilares individuales.
El flujo microvascular se puede visualizar en microscopía de fluorescencia ya sea por el movimiento de microesferas fluorescentes o por el movimiento de glóbulos rojos en el fondo de marcadores fluorescentes impermeant de membrana (por ejemplo, dextran o albúmina con etiqueta fluorescente)6,7. El flujo microvascular se puede fotografiar en capas celulares superficiales utilizando microscopía de campo ancho, o a profundidad mediante microscopía confocal o multifotona. Sin embargo, los caudales capilares son tales que el paso de glóbulos rojos generalmente no se puede capturar a velocidades inferiores a 60 fotogramas/s. Dado que la mayoría de los microscopios confocales y multifotónicos de escaneo láser requieren 1–5 s para escanear un campo de imagen completo, esta velocidad generalmente se puede lograr sólo limitando el campo de visión, a veces a una sola línea de escaneo8. El proceso de limitar las mediciones a segmentos capilares seleccionados (1) tiene el potencial de introducir sesgo de selección y (2) hace imposible capturar la heterogeneidad espacial y temporal en las tasas de flujo sanguíneo capilar. Por el contrario, las imágenes de redes capilares se pueden recoger a velocidades superiores a 100 fps utilizando microscopios digitales de campo ancho equipados con cámaras científicas complementarias complementarias de semiconductores de óxido metálico (sCMOS)9,10. Estos sistemas baratos, comunes en los laboratorios biomédicos típicos, permiten crear imágenes del flujo microvascular a través de redes bidimensionales enteras, esencialmente de forma continua. El problema se convierte entonces en encontrar un enfoque de análisis que sea capaz de extraer datos cuantitativos significativos de los conjuntos de datos de imágenes masivos y complejos generados por la microscopía de vídeo de alta velocidad.
Para permitir el análisis de los datos de flujo de campo completo hemos desarrollado STAFF, un novedoso software de análisis de imágenes que puede medir continuamente el flujo microvascular a través de campos de microscopio completos de series de imágenes recopiladas a alta velocidad11. El enfoque es compatible con una variedad de diferentes sistemas experimentales y modalidades de imagen y el software de análisis de imágenes STAFF se implementa como un conjunto de herramientas macro para la implementación FIJI de ImageJ12. El principio subyacente utilizado aquí para visualizar el flujo microvascular es que, en primer lugar, se debe proporcionar cierto contraste para poder tomar imágenes de los glóbulos rojos dentro de los capilares. En nuestros estudios, el contraste es proporcionado por una sonda fluorescente a granel que es excluida por los glóbulos rojos. La velocidad del flujo se puede cuantificar a partir del desplazamiento de los glóbulos rojos que aparecen como una mancha negativa dentro del plasma etiquetado fluorescentemente en imágenes recogidas a alta velocidad de un animal vivo8. A continuación, utilizamos STAFF para hacer parcelas de distancia a lo largo de cada segmento capilar en múltiples intervalos de tiempo llamados kymographs, luego detectamos las pendientes presentes en loskymographs 13,y a partir de esas pendientes calcular las tasas de flujo microvascular. El enfoque se puede aplicar a las imágenes recogidas desde cualquier lecho capilar al que se pueda acceder para obtener imágenes. Aquí describimos la aplicación de IVM y STAFF a los estudios de flujo sanguíneo en el hígado.
Hay varios pasos críticos en este protocolo. En primer lugar, la minimización del movimiento durante la toma de imágenes intravitales del hígado es esencial para generar películas que se pueden utilizar para el análisis de flujo capilar utilizando STAFF. Debido a la proximidad del diafragma, se producen períodos cortos de movimiento inducido por la respiración, con el hígado asegurado regresando a su posición inicial después de cada respiración. Asegurar el hígado expuesto quirúrgicamente contra el plato co…
The authors have nothing to disclose.
Los estudios presentados aquí fueron apoyados por fondos de los Institutos Nacionales de Salud (NIH U01 GM111243 y NIH NIDDK P30 DK079312). Se realizaron estudios de microscopía intravital en el Centro de Microscopía Biológica de Indiana. Agradecemos a la Dra. Malgorzata Kamocka por la asistencia técnica con microscopía.
#5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing .011x.024in |
CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2×2 inch Dukal sterile gauze sponges |
Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
Micro scissors | Castro Viejo | ||
Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
Needle | Fisher | 30 Ga.x1/2" | |
Needle holder | Olsen-Hegar | ||
Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |