हम मूत्र-व्युत्पन्न अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा सेल लाइनों के अल्ट्रासाउंड निर्देशित प्रत्यारोपण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन सीधे देशी ट्यूमर साइट में करते हैं। इस दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप इंजेक्शन के 2-4 सप्ताह के भीतर अल्ट्रासाउंड स्कैनिंग द्वारा अग्नाशय ट्यूमर का पता लगाया जा सकता है, और सर्जिकल ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण की तुलना में पेरिटोनियल दीवार पर अनुपात ट्यूमर सेल सीडिंग को काफी कम कर दिया गया।
मेलानोमा और फेफड़ों के एडेनोकार्सिनोमा में प्रतिरक्षा चौकी नाकाबंदी की हालिया सफलता ने इम्यूनो-ऑन्कोलॉजी के क्षेत्र को प्रेरित किया है और साथ ही वर्तमान उपचार की सीमाओं का पता चला है, क्योंकि अधिकांश रोग इम्यूनोथेरेपी का जवाब नहीं देते हैं। उपन्यास और प्रभावी चिकित्सीय संयोजनों की पहचान करने के लिए सटीक प्रीक्लिनिकल मॉडल का विकास इस अपूरित नैदानिक आवश्यकता को संबोधित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीए) इम्यूनोथेरेपी का जवाब देने वाले रोगियों के केवल 2% के साथ प्रतिरक्षा चौकी नाकाबंदी प्रतिरोधी ट्यूमर का एक विहित उदाहरण है। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर KrasG12D +/- Trp53R172H+/- पीडीए का पीडीएक्स-1 क्रे (केपीसी) माउस मॉडल मानव रोग को फिर से तैयार करता है और प्रीक्लिनिकल सेटिंग में इम्यूनोथेरेपी प्रतिरोधी के लिए उपचारों का आकलन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है, लेकिन ट्यूमर की शुरुआत करने का समय अत्यधिक परिवर्तनीय है। पीडीए के सर्जिकल ऑर्थोटोपिक ट्यूमर प्रत्यारोपण मॉडल केपीसी ऊतक-विशिष्ट ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट (TME) की इम्यूनोबायोलॉजिकल पहचान बनाए रखते हैं लेकिन एक समय-गहन प्रक्रिया की आवश्यकता होती है और अदुमराह सूजन का परिचय देता है। यहां, हम एक अल्ट्रासाउंड निर्देशित ऑर्थोटोपिक ट्यूमर प्रत्यारोपण मॉडल (यूजी-ओटीआईएम) का उपयोग करने के लिए गैर-आक्रामक रूप से माउस अग्न्याशय में सीधे केपीसी-व्युत्पन्न पीडीए सेल लाइनों को इंजेक्ट करते हैं। यूजी-ओटिम ट्यूमर एंडोजेनस ऊतक साइट में बढ़ते हैं, पीडीए TME की हिस्टोलॉजिकल विशेषताओं को ईमानदारी से संक्षिप्त करते हैं, और पेरिटोनियल दीवार पर न्यूनतम सीडिंग के साथ इंजेक्शन के बाद चार सप्ताह तक प्रीक्लिनिकल अध्ययन के लिए नामांकन के आकार के ट्यूमर तक पहुंचते हैं। यहां वर्णित यूजी-ओटिम सिस्टम एक तेजी से और प्रजनन योग्य ट्यूमर मॉडल है जो मूत्र पीडीए TME में उपन्यास चिकित्सीय संयोजनों के उच्च थ्रूपुट विश्लेषण के लिए अनुमति दे सकता है।
अग्नाशय के डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीए) एक बेहद आक्रामक बीमारी है जो वर्तमान उपचारों के लिए अपवर्तक है, 9%1की निराशाजनक 5 साल की जीवित रहने की दर के साथ। पीडीए ने हाल ही में स्तन कैंसर को पार कर अमेरिका में कैंसर से संबंधित मृत्यु दर का तीसरा प्रमुख कारण बन गया है और वर्ष २०३०२तक दूसरा प्रमुख कारण (केवल फेफड़ों के कैंसर के पीछे) बनने का अनुमान है । इम्यूनोप्रेसिव मायलॉयड सेल आबादी3,4,5,6,7,घने स्ट्रोमल जमाव8,9,10,11और टी कोशिकाओं की कमी5,12,13-योगदानकी एक संख्या शामिल है । पीडीए14में इम्यूनोथेरपीज की विफलता . इस उद्देश्य के लिए, चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक पशु मॉडल का उपयोग वीवो मेंइम्यूनोलॉजिकल रूप से ठंडे ट्यूमर के लिए उपन्यास दवा संयोजनों की प्रभावकारिता की जांच करने के लिए एक आवश्यक उपकरण है।
आनुवंशिक रूप से इंजीनियर KrasG12D +/- Trp53R172H+/- पीडीए के पीडीएक्स-1 क्रे (केपीसी) माउस मॉडल ईमानदारी से मानव पीडीए के प्रमुख नैदानिक पहलुओं को फिर से तैयार करता है, जिसमें रोग के आणविक ड्राइवर और हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषताएं शामिल हैं15। केपीसी ट्यूमर पूरी तरह से इम्यूनोसक्षम चूहों में अनायास विकसित होते हैं, जिससे नैदानिक परीक्षण सेटिंग में इन दवाओं के प्रशासन से पहले कीमोथेरेपी16,17,इम्यूनोथेरेपी18,19,20,21और स्ट्रोमा-टार्गेटिंग थेरेपी9,11,22वीवो में चिकित्सकीय दृष्टिकोणों से पूछताछ की अनुमति होती है। पीडीए के एक पूर्व नैदानिक मॉडल के रूप में अपनी कई ताकत ों के बावजूद, केपीसी चूहों का उपयोग सहज ट्यूमर विकास की अत्यधिक परिवर्तनीय प्रगति से वंचित है क्योंकि ट्यूमर की शुरुआत 4 से 40 सप्ताह तक हो सकती है (इस प्रकार रखरखाव को एक बड़ी प्रजनन कॉलोनी की आवश्यकता होती है)15। इसके अतिरिक्त, केपीसी चूहों में पॉलीक्लोनल प्राइमरी ट्यूमर23की क्षमता है, और पशु स्वास्थ्य में तेजी से गिरावट आई है और कैक्सिया और एसाइट्स सहित सह-रुग्णताओं में वृद्धि हुई है क्योंकि रोग15की प्रगति करता है।
सहज केपीसी माउस मॉडल का एक विकल्प पीडीए24के ऑर्थोटोपिक इम्प्लांटेशन मॉडल का उपयोग करना है। देशी ऊतक साइट में ट्यूमर सेल लाइनों का प्रत्यक्ष शल्य प्रत्यारोपण पीडीए के ऊतक-विशिष्ट ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट (TME) को फिर से तैयार करने का एक अधिक लागत प्रभावी और उम्मीद के मुताबिक तरीका है। ट्यूमर प्रत्यारोपण आनुवंशिक रूप से बैकक्रॉस चूहों5के लिए क्लोनल ट्यूमर सेल लाइनों के इंजेक्शन के लिए अनुमति देता है, अतिरिक्त आनुवंशिक जोड़तोड़ के साथ मेजबान चूहों के लिए अनुमति देता है जो केपीसी माउस मॉडल में नस्ल के लिए समय लेने वाला होगा। हालांकि, अग्नाशय ट्यूमर प्रत्यारोपण के लिएएक श्रम-गहन शल्य चिकित्सा प्रक्रिया की आवश्यकता होती है जो पेट की दीवार24,25,26में सीवन साइट पर अद्यतित सूजन का परिचय देती है, और अक्सर एक लंबी पोस्ट-ऑपरेटिव वसूली27,28,29शामिल होती है।
कृंतक-विशिष्ट ट्रांसड्यूसर का उपयोग करके अल्ट्रासाउंड इमेजिंग में तकनीकी प्रगति वास्तविक समय में उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियां प्रदान करती है। पेरिटोनियल गुहा में इंजेक्शन सुई आंदोलन के अल्ट्रासाउंड इमेजिंग द्वारा निर्देशित, कोई विशेष रूप से ट्यूमर कोशिकाओं को अग्न्याशय में प्रत्यारोपित कर सकता है, सर्जिकल प्रत्यारोपण और संबद्ध सूजन के अभाव में ऑर्थोटोपिक ट्यूमर इंजेक्शन के लाभों का लाभ उठा सकता है। अल्ट्रासाउंड निर्देशित ऑर्थोटोपिक ट्यूमर प्रत्यारोपण मॉडल (यूजी-ओटीआईएम) को पहले अग्नाशय के कैंसर30 के साथ-साथ ईविंग के सारकोमा, न्यूरोब्लास्टोमा और मूत्राशय कैंसर31, ३२सहित कई अन्य कैंसर मॉडलों में स्थापित किया गया है ।
यहां, हम मूत्र अग्न्याशय में ट्यूमर सेल लाइनों के अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन प्रदर्शन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । हम परिणामी ट्यूमर KPC TME के हिस्टोलॉजिकल और इम्यूनोलॉजिकल सुविधाओं को संक्षिप्त दिखाते हैं और इसलिए इम्यूनोथेरपी सहित उपन्यास चिकित्सीय संयोजनों की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, तेजी से स्थानांतरित करने के लिए सबसे आशाजनक उपचार प्रकट करने के लिए नैदानिक परीक्षणों के लिए आगे।
हम यहां दिखाते हैं कि ऑटोकॉन्सस ऊतक साइट पर मूत्र पीडीए सेल लाइनों के प्रत्यक्ष प्रत्यारोपण के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन अल्ट्रासोनोग्राफी का उपयोग केपीसी और सर्जिकल ऑर्थोटोपिक मॉडल सिस्टम दोनों के लिए एक विश्वसनीय विकल्प है। यूजी-ओटीआईएम जैविक रूप से प्रासंगिक ट्यूमर पैदा करता है जो ट्यूमर-निदान और विश्वसनीय ट्यूमर विकास गतिज के लिए एक छोटा समय-सीमा के साथ पीडीए की इम्यूनोपैथोलॉजिकल विशेषताओं को बनाए रखता है। अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन इसलिए ऑर्थोटोटोपरिक रूप से प्रत्यारोपित पीडीए ट्यूमर वाले चूहों के तेजी से उत्पादन के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में काम कर सकता है, जो चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक मॉडल में चिकित्सीय संयोजनों की जांच की अनुमति देता है।
अल्ट्रासाउंड निर्देशित प्रत्यारोपण पूर्व नैदानिक जांच के मानक मॉडल पर महत्वपूर्ण सुधार प्रदान करता है। सबसे पहले, इस प्रक्रिया को सीधे पूरी तरह से C57BL/6 backcrossed पीडीए कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करके सहज ट्यूमर के विकास के लिए केपीसी चूहों की समय गहन निगरानी समाप्त करने में murine अग्न्याशय में । दूसरे, पारंपरिक सर्जिकल ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन के समान, यूजी-ओटीआईएम दृष्टिकोण इंजेक्शन कोशिका रेखा पर नियंत्रण के लिए अनुमति देता है, जिसमें मोनोक्लोनल ट्यूमर सेल लाइन का चयन और/या सेल लाइन के पूर्व वीवो हेरफेर, साथ ही ट्यूमर सेल प्रत्यारोपण प्राप्त करने वाले मेजबान पर नियंत्रण शामिल है । तीसरे, यह न्यूनतम आक्रामक तकनीक जीवित रहने की सर्जरी के दुरूह परिश्रम से बचती है और जानवरों के लिए जटिल पोस्ट-ऑपरेटिव वसूली अवधि के साथ-साथ शल्य चिकित्सा घाव उपचार से भड़काऊ संकेतों को बाईपास करती है। अंत में, यूजी-ओटिम ट्यूमर – सर्जिकल प्रत्यारोपण के समान – कम टी सेल घुसपैठ और उच्च मैक्रोफेज घुसपैठ सहित केपीसी चूहों में मनाए गए टीएमई को फिर से तैयार करें। इस प्रकार, यूजी-ओटीआईएम मॉडल सहज केपीसी मॉडल में चिकित्सीय जांच को मंद करने वाली अतिरिक्त जटिलताओं के बिना केपीसी ट्यूमर की प्रमुख विशेषताओं को बरकरार रखता है।
प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम तकनीक की सफलता के लिए मास्टर करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रक्रिया के लिए मूत्र अल्ट्रासाउंड इमेजिंग में विशेषज्ञता आवश्यक है, लेकिन अग्न्याशय में कोशिकाओं को सफलतापूर्वक प्रत्यारोपित करने के लिए आवश्यक मैनुअल निपुणता एक कौशल सेट है जिसे स्वतंत्र रूप से विकसित किया जाना चाहिए। एक 12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र पर चूहों के लिए, रात भर जानवरों उपवास सुनिश्चित पेट और आंतों किसी भी अपाच्य भोजन है कि अल्ट्रासाउंड द्वारा अग्न्याशय, गुर्दे और तिल्ली के दृश्य ब्लॉक सकता है की मंजूरी दे दी थी । इसके अतिरिक्त, ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन के लिए उपयोग की जाने वाली प्रत्येक सेल लाइन को विकास गतिज को समझने और मेटास्टैटिक क्षमता33निर्धारित करने के लिए आगे के प्रयोगों से पहले टिटकिया जाना चाहिए। इंजेक्शन के दौरान, इंजेक्शन साइट पर त्वचा को चुटकी देने के लिए संदंश के उपयोग ने त्वचा और पेरिटोनियल दीवार दोनों के माध्यम से धीरे से पंचर करने के लिए आवश्यक तनाव पैदा कर दिया। प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम ध्यान से ऊतक छिद्रित या तिल्ली या गुर्दे के रूप में एक बंद लक्ष्य साइट पंचर बिना अग्न्याशय में सुई गाइड था । एक तरल पदार्थ बोलस की पुष्टि उचित ऊतक में सफल ट्यूमर सेल इंजेक्शन का सबसे अच्छा संकेतक था। इंजेक्शन के बाद सुई को धीरे-धीरे वापस लेना चाहिए ताकि तरल बोलस को परेशान न किया जा सके। हमने पाया कि या तो DMEM या Trypan ब्लू का उपयोग कर परीक्षण इंजेक्शन की एक श्रृंखला के लिए ठीक मोटर इस इंजेक्शन के लिए आवश्यक कौशल की महारत विकसित करने में मदद की ।
इस प्रक्रिया की समस्या निवारण के दौरान, हमने कई कारकों की पहचान की जो प्रोटोकॉल की सफलता को प्रभावित करते हैं। परीक्षण प्रयोगों में, हमारी सबसे लगातार त्रुटि प्रत्यारोपण के दौरान गुर्दे को छिद्रित कर रही थी, जो हमारे शुरुआती प्रयोगों में अधिक बार हुई, जिससे यह सुझाव मिलता है कि इस कौशल के नियमित व्यायाम से प्रवीणता में सुधार होता है। इसके अतिरिक्त, हमने पाया कि समस्या निवारण चरण के दौरान अल्ट्रासाउंड और सीधे दृश्य दोनों के माध्यम से ट्यूमर सेल इंजेक्शन के बाद तरल पदार्थ बोलस की उपस्थिति की पुष्टि सफल इंजेक्शन तकनीक में सुधार हुआ। यदि इंजेक्शन के दौरान अल्ट्रासाउंड द्वारा बुलबुले के गठन की पुष्टि नहीं की जाती है, तो ट्यूमर कोशिकाओं के शेष बोलस को जारी करने के लिए सिरिंज को पूरी तरह से निराशाजनक करने से पहले सुई के स्थान को समायोजित किया जा सकता है। हमने यह भी देखा कि निलंबन की मात्रा बहुत जल्दी इंजेक्शन परिधीय गुहा या अग्न्याशय में तरल पदार्थ बोलस के पतन में ट्यूमर कोशिकाओं के बिखराव के परिणामस्वरूप । आम तौर पर, इन जानवरों को n = 7 जानवरों के अपवाद के साथ अग्नाशय ट्यूमर विकसित करने पर चला गया है कि ट्यूमर का कोई सबूत नहीं दिखाया 4 सप्ताह के बाद इंजेक्शन । यह परिणाम केवल हमारे पहले प्रयास में सूचित किया गया था (और 6/7 जानवरों ट्यूमर कोशिकाओं के एक कम titer के साथ इंजेक्शन थे) । चूहों कि संदिग्ध ट्यूमर सेल इंजेक्शन है, या सुई के repositioning की आवश्यकता है, बारीकी से अग्न्याशय के बाहर ट्यूमर के विकास के लिए नजर रखी जानी चाहिए ।
अल्ट्रासाउंड निर्देशित विधि की सबसे महत्वपूर्ण सीमाएं आवश्यक उपकरणों की उपलब्धता और ट्यूमर प्रत्यारोपण से जुड़े तकनीकी कौशल हैं। प्रक्रिया पूरी तरह से बाँझ नहीं है, क्योंकि माउस को अल्ट्रासाउंड प्लेटफॉर्म पर गैर-बाँझ इंजेक्शन दिया जाता है, जिसमें सिरिंज और सुई टिप अल्ट्रासाउंड जेल से गुजरती है। यद्यपि हमने इन अध्ययनों को शुरू करने के बाद से कुल 8 स्वतंत्र प्रयोगों में एन = 148 चूहों में संक्रमण का कोई सबूत नहीं देखा है, यह संभव है कि एक संक्रामक एजेंट इस प्रक्रिया के दौरान इंजेक्शन सुई के माध्यम से अग्न्याशय में प्रवेश कर सकता है। जैसे, संभव के रूप में प्रोटोकॉल के कई पहलुओं के रूप में (दस्ताने, अल्ट्रासाउंड सतहों, बर्फ बक्से सहित) कीटाणुनाशक या 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव किया जाना चाहिए रोगजनकों के लिए संभावित जोखिम को कम करने के लिए। वर्तमान प्रोटोकॉल की एक अतिरिक्त सीमा वर्तमान कमजोर पड़ने पर 4662 सेल लाइन का उपयोग कर मेटाटैसिस की कमी थी। यूजी-ओटिम सिस्टम में उपयोग की जाने वाली प्रत्येक सेल लाइन को वांछित विकास दर के साथ-साथ मेटास्टैटिक क्षमता33के लिए टिट किया जाना चाहिए। अंत में, हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल एक एकल सेल निलंबन में ट्यूमर कोशिकाओं इंजेक्शन के लिए तकनीकों की स्थापना की । हालांकि, एक बाह्युलर मैट्रिक्स सब्सट्रेट के अलावा संभावित ट्यूमर स्थापना को बढ़ाने और ट्यूमर सेल रिसाव को रोकने के लिए जोड़ा जा सकता है (के रूप में यह शल्य प्रत्यारोपण मॉडल27,30,31,32में प्रयोग किया जाता है) । इस प्रकार, यूयूजी-ओटीआईएम की कई सीमाओं को ऑर्थोटोटोपिक इंजेक्शन में उपयोग की जा रही सेल लाइनों के उचित परीक्षण के साथ दूर किया जा सकता है।
संक्षेप में, यूजी-ओटीआईएम मॉडल मूत्र अग्न्याशय में ट्यूमर कोशिकाओं के ऊतक-निर्देशित इंजेक्शन का एक सटीक तरीका है। यह न्यूनतम आक्रामक प्रत्यारोपण तकनीक प्रक्रिया के समय को कम करके, शल्य चिकित्सा के बाद की जटिलताओं को कम करने और इंजेक्शन की सटीकता में सुधार करके अन्वेषक और जानवरों दोनों को लाभ पहुंचाती है। यूजी-ओटिम इंजेक्शन से उत्पन्न होने वाले ट्यूमर सहज केपीसी ट्यूमर की विशेषता इम्यूनोबायोलॉजिकल विशेषताओं को बनाए रखते हैं, ट्यूमर की शुरुआत के लिए विश्वसनीय समय है, और प्रजनन योग्य ट्यूमर विकास गतिज। इस प्रकार यूजी-ओटीआईएम मॉडल का उपयोग अपेक्षाकृत उच्च-थ्रूपुट तरीके से किया जा सकता है ताकि सबसे बड़ी अपूरित नैदानिक आवश्यकता वाले रोगियों के लिए उपन्यास उपचार प्रकट करने के लिए प्रीक्लिनिकल सेटिंग में चिकित्सीय संयोजनों से पूछताछ की जा सके।
The authors have nothing to disclose.
लेखक डॉ रॉबर्ट Vonderheide और Vonderheide प्रयोगशाला के सभी सदस्यों, अग्नाशय के कैंसर माउस अस्पताल के सभी सदस्यों, डॉ बेन Stanger, पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय में अग्नाशय के कैंसर अनुसंधान केंद्र, और Devora Delman के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते है उपयोगी चर्चाएं। यह काम पार्कर इंस्टीट्यूट फॉर कैंसर इम्यूनोथेरेपी फेलो अवार्ड (केटीबी) और पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय (सीसी) में अग्नाशय के कैंसर अनुसंधान केंद्र से वित्तपोषण द्वारा समर्थित है ।
50 mL Conicals | Thomas Scientific | 2602A26 | |
Blunt edged forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Cell Dissociation Buffer | Thermo-Fisher | 13151014 | |
Cotton Tipped swabs | Thermo-Fisher | 19062614 | |
Covidien Monoject 3/10mL, 29G X 1/2" | Thermo-Fisher | 8881600145 | |
Depilatory Agent | Amazon | Nair Body Lotion | |
DMEM | Thermo-Fisher | 10-566-016 | |
FBS | Gemini Bio-oroducts | 100-106 | |
Flask | Sigma-Aldrich | CLS430825 | |
Forceps (blunt edge) | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Gauze | Fisher | 13-761-52 | |
Gentamicin | Thermo-Fisher | 15750060 | |
Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
Isofluorane | Penn Vet Supply | VED1350 | |
Isofluorane Vaporizer | VetEquip | 911103 | |
L-glutamine | Thermo-Fisher | 25030081 | |
Optixcare | MidWest Veterinary Supply | 052.50310.3 | |
Paper Tape | Medline | MMM1530Z5 | |
PBS | Thermo-Fisher | 14-190-250 | |
Slide warmer | C&A Scientific | XH-2001 | |
Sterilant (Clidox-S) | Fisher Scientific | NC0332382 (activator) NC9189926 (base) | Needs to be combined according to manufacturer's instructions |
Sterile Alcohol prep pad | Covidien | 6818 | |
Trypsin | Thermo-Fisher | 15090046 | |
Ultrasound gel | Thermo-Fisher | 03-34-1LT | |
Visualsonics Ultrasound Vevo 2100 | Visual Sonics | Vevo 2100 |