Summary
אנו מתארים פרוטוקול עבור אולטרסאונד השרשה המודרכת של הלבלב הנגזר מוראן של דוטל לבלב שורות תאים ישירות לתוך אתר הגידול הטבעי. גישה זו הביא לגידולים בלבלב לגילוי על ידי סריקת אולטרסאונד בתוך 2-4 שבועות של הזרקה, והקטינה באופן משמעותי את הגידול בפרופורציה של תאים בקיר הצפק לעומת השרשה כירורגית אורתודפית.
Abstract
ההצלחה האחרונה של המצור החיסון נגד מלנומה וריאות אדנוקרצינומה יש מגולוון את השדה של אימונואונקולוגיה, כמו גם חשף את המגבלות של הטיפולים הנוכחיים, כמו רוב המטופלים אינם מגיבים לטיפול חיסוני. פיתוח של מודלים פרה-קליניים מדויקים כדי לזהות במהירות שילובים טיפוליים חדשניים ויעילים הם קריטיים לענות על הצורך הקליני הזה שאינו מתקיים. מחשב כף יד הלבלב אדנוקרצינומה (PDA) היא דוגמה קאנונית של המצור החיסונית הסגר עמידים בפני גידול עם רק 2% מהחולים מגיבים לטיפול חיסוני. הנדסה גנטית קראסG12D +/-; Trp53R172H +/-; Pdx-1 היצורים (KPC) מודל העכבר של מחשב כף יד משנה את המחלה האנושית והוא כלי רב ערך להערכת טיפולים חיסוני חיסונית בהגדרה טרום קלינית, אבל הזמן התפרצות הגידול הוא משתנה מאוד. כירורגית אורתוטופית מודלים של השתלת הגידול של PDA לשמור על הסימנים הביולוגיים של הרקמה הביולוגית של KPC רקמות מיקרו מיקרוסביבה (TME) אבל דורשים הליך אינטנסיבי זמן ולהציג דלקת חריגה. כאן, אנו משתמשים אולטרה סאונד מונחה הנושא השתלת הגידול מודל (כגון-OTIM) להחדיר באופן לא פולשני הזרקת KPC-נגזר מחשב כף יד קווי ישירות לתוך הלבלב העכבר. הגידולים לגדול-OTIM לצמוח באתר רקמת אנדוגניים, בנאמנות לכידה של תכונות היסטולוגית של מחשב כף יד TME, ולהגיע לגידולים בגודל ההרשמה למחקרים פרה-קליניים על ידי ארבעה שבועות לאחר הזרקה עם זריעה מינימלית על הקיר הצפק. מערכת ה-OTIM מתוארים כאן הוא מודל גידול מהיר ומהפך שעשוי לאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של שילובים טיפוליים הרומן במחשב כף יד של murine.
Introduction
דוטל הלבלב אדנוקרצינומה (PDA) היא מחלה אגרסיבית לשמצה כי הוא עקשן לטיפולים הנוכחיים, עם שיעור עגום של 5 שנים הישרדות של 9%1. PDA לאחרונה עבר סרטן השד כדי להפוך את הגורם השלישי המוביל של תמותת הקשורות לסרטן בארה ב. והוא מוקרן להיות הגורם השני המוביל (מאחורי סרטן ריאות בלבד) עד השנה 20302. מספר תכונות מאפיין של החיסוני "קר" הגידול PDA מיקרו-סביבה (tme)-כולל חדירה גבוהה של אוכלוסיות מדכאים של מיאלואידית החיסונית3,4,5,6,7, התצהיר מסטרומה צפופה8,9,10,11, ו מחסור של תאים T5,12,13-לתרום כישלון של טיפולים חיסוני ב-PDA14. לשם כך, השימוש במודל בעלי החיים הרלוונטי קלינית הוא כלי חיוני לחקירת היעילות של שילובי תרופות הרומן לגידולים אימונווגית קרה בvivo.
הנדסה גנטית קראסG12D +/-; Trp53R172H +/-; Pdx-1 היצור (KPC) מודל העכבר של PDA בנאמנות לכידה היבטים קליניים בולטות של מחשב כף יד אנושי, כולל נהגים מולקולריים של מחלות ותכונות histopathological15. הגידולים kpc לפתח באופן ספונטני עכברים המוסמכת חיסוני מלאה, המאפשר חקירה של גישות טיפוליות כולל כימותרפיה16,17, חיסוני18,19,20,21, ו מסטרומה טיפול היעד9,11,22ב vivo לפני המינהל של תרופות אלה בהגדרת ניסוי קליני. למרות העוצמות הרבות שלה כמודל טרום קליני של PDA, השימוש עכברים KPC הוא מוחלע על ידי התקדמות משתנה מאוד של פיתוח הגידול הספונטני כמו התפרצות הגידול יכול לנוע בין 4 עד 40 שבועות (ובכך דורשים תחזוקה מושבת רבייה גדולה)15. בנוסף, עכברים KPC יש פוטנציאל עבור גידולים עיקריים של פוליבטיים23, ויש ירידה מהירה בריאות בעלי חיים ולהגדיל ב-co-morbidities כולל cachexia ו מיימת כמו המחלה מתקדמת15.
חלופה אחת מודל העכבר הספונטנית של KPC היא להשתמש במודל השרפת אורתוקפית של PDA24. ההשתלה כירורגית ישירה של שורות תא הגידול לאתר רקמות יליד הוא שיטה חסכונית יותר וצפויה של לכידה מיקרוסביבה הרקמה ספציפית הגידול (TME) של PDA. השתלת הגידול מאפשר הזרקה של שבטים תא הגידול הקווים לעכברים מוצלב גנטית5, המאפשר עכברים מארחים עם מניפולציות גנטיות נוספות שיהיה לגזול זמן רב כדי להתרבות למודל העכבר kpc. עם זאת, השתלת גידול הלבלב דורש הליך כירורגי אינטנסיבי עבודה המציג דלקת חריגה באתר תפר בקיר הבטן24,25,26, ולעתים קרובות כולל שחזור ממושך אחרי הניתוח27,28,29.
פיתוחים טכנולוגיים בדימות אולטרסאונד באמצעות מכרסמים ספציפיים מכרסם מספק תמונות ברזולוציה גבוהה בזמן אמת. מונחה על ידי הדמיה אולטרסאונד של תנועת מחט הזריקה בחלל הצפק, אחד יכול במיוחד השתל תאים סרטניים לתוך הלבלב, מינוף את היתרונות של זריקות הגידול אורתוטופית בהעדר השרשה כירורגית ודלקת הקשורים. גישה זו, כינה אולטרסאונד-מונחה אורתובנושא השתלת הגידול מודל (כולל-otim) כבר הוקמה בעבר מודלים מבע של סרטן הלבלב30 , כמו גם בכמה מודלים סרטניים אחרים כולל סרקומה של יואינג, נוירובלסטומה וסרטן שלפוחית השתן31,32.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע הזרקת אולטרסאונד מונחה של שורות תאים סרטניים ללבלב murine. אנו מראים את הגידולים העשויים להיות מחדש את התכונות היסטולוגית ואימונולוגיים של KPC TME ולכן ניתן להשתמש בהם כדי לחקור שילובים טיפוליים הרומן, כולל חיסוני, במהירות לחשוף את הטיפולים המבטיחים ביותר להעביר קדימה לניסויים קליניים.
Protocol
פרוטוקולי בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי המועצה המוסדית של טיפול בבעלי חיים והשתמש בוועדה באוניברסיטת פנסילבניה. נשים 5 עד 6-שבוע בן C57Bl/6 עכברים נרכשו (ראה טבלת חומרים) והשתמשו לאחר 1-3 שבועות מנוחה. המעבדה האוניברסיטה משאבי בעלי חיים פיקח על טיפול בעלי חיים.
1. הכנת קווי הגידול של מחשבי כף יד להזרקה
- לגדל KPC-נגזר קו מחשב כף יד בתא הגידול (TC) מדיה: מדיום הנשר של Dulbecco (DMEM) שיושלם עם 10% סרום שור עוברי (FBS), 2mM L-גלוטמין ו 83 μg/mL gentamicin.
- אפשר לתאים לצמוח כדי 80-85% שליטה במבחנות המתוחזקות ב-37 ° c ו-5% CO2.
- לאחר התאים להגיע לשטף אידיאלי, decant את המדיה מצלוחיות פעמיים עם חם (37 ° c), מלוחים סטרילית מאגור פוספט (PBS), מספיק כדי לכסות את המונאולייר של תאים חסיד. הפיפטה של הערוץ האחרון שנשאר. אחרי השטיפה האחרונה
- להוסיף חם (37 ° c) 0.05% טריפסין-edta פתרון (0.5% מניות טריפסין-edta מדולל 1:10 ב-hanks' מבוססי מאגר הדיסוציאציה של התא נטול אנזימים) כדי לכסות את דופלקס בכל בקבוקון ו דגירה ב 37 ° c עבור 3-5 דקות או עד תאים לנתק עם הקשה על הצדדים של בקבוק.
- הוסף 10-25mL של קר (4 ° c), מדיית TC סטרילית בכל בקבוקון כדי לעצור את תגובת טריסיזציה. שופכים השעיית תא ל-50mL (s), מילוי ל-50mL עם מדיית TC קרה.
- צנטריפוגה ב 300 גרם למשך 5 דקות ב -4 ° c. התעלם מהסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה בתוך מזכור קר וסטרילי (סרום נטול). אם מספר מנורות חרוט שימשו כדי לאסוף תאים, כל כדורי ניתן לשלב חרוט אחד בשלב זה.
- צנטריפוגה ב 300 גרם למשך 5 דקות ב -4 °.
- חזור על שלבים 1.6-1.7 פעמיים. בשטיפה הסופית, קח מסמך של תאים לספירה. הכדאיות התאית של ≥ 90% מומלצת בזריקות vivo .
- הכן השעיה אחידה של תאים סרטניים מחשב כף יד על הריכוז הרצוי של תאים סרטניים. השתמשנו 10-20 x 106 תאים/mL (250,000 כדי 500,000 תאים/25μl) בכמות המתאימה של מכשיר החיטוי, הקרה או PBS, אבל כל קו תא צריך להיות טיטרציה ב vivo.
- לשמור על תאים קרים, על קרח, עד מוכן להזריק.
2. הכנה טרום כירורגי של עכברים
הערה: מומלץ לבצע שלב זה 24 שעות לפני הפרוצדורה.
- מניחים כלובים המכילים עכברים ניסיוניים על חם שנקבע ל-37 ° c.
- השיגו כלובים חדשים ונקיים ומניחים על פלטפורמת התחממות שנייה שנקבעה ל-37 ° c.
- ניקוי יסודי של ארון הבטיחות הביולוגי, חדר האינדוקציה והאולטרה-סאונד (ארה ב) עם סטראילנט (ראו לוח חומרים).
- הפוך את פונקציית ההתחממות של השלב האמריקאי ל-37 ° c.
- הפעל את מכונת ההרדמה: להתאים את החוגות על מפצל צינור כך זרימת אוויר מוגבלת לחדר אינדוקציה בלבד. הפעל את מיכל החמצן והגדר את קצב הזרימה ל-1 L/min. הפעל את מכשיר האידוי. ל2-3%
- מניחים עכבר בודד לתוך חדר אינדוקציה. פקח על העכבר עד שאין עוד ניידות ונשימה הואטה.
- כוונן את החוגות במפצל כך שזרימת האוויר מותרת הן לחדר האינדוקציה והן לחרוט האף. במהירות להזיז את העכבר מן התא אינדוקציה ולהניח אותו בתוך שכיבה הגהירה על הבמה החמה של ארה ב עם הזמם שלו בקונוס האף.
- בדוק את רמת האינדוקציה על ידי התבוננות כל תגובה רפלקסיבי הבוהן צובט. אם אין כלום, העכבר מוכן להסרת שיער.
- מניחים כמות קטנה של חומר סיכה לעיניים (ראו טבלת חומרים) על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות רקמות. הפוך את העכבר כך שהוא מניח בתוך שכיבה על הבמה. לדבוק בעדינות את הגפיים העליונים והתחתונים לבמה עם נייר דבק כדי למקסם את החשיפה של הבטן ולאבטח את העכבר על הבמה.
- השתמש המוליך הכותנה סטרילי להחיל קרם להסרת שכבה נדיבה לרביע השמאלי העליון של הבטן. יש ליישם את המישפט באזור הטחול הכללי ולהאריך את קו האמצע. . הרשי לי לשבת במשך דקה
- בדוק את מידת הסרת השיער על ידי בעדינות באמצעות הקצה הנגדי של המוליך עצה כותנה כדי לנגב את הקרם דפילציה ברגע שהוא מסיר בקלות, לנגב את הבטן נקי עם פד גזה יבש. ואז להרטיב שכבה נקייה של גזה עם כמות קטנה של מלוחים חמים לנגב את האזור פעם נוספת כדי להסיר לחלוטין את הסוכן דפילציה. אין לחרוג 2 דקות מלאות של מגע ישיר על עור העכבר כדי להפחית את הסיכוי של כוויות כימיות.
- לאחר שהשיער הוסר מספיק מן הבטן, להחזיר את העכבר לכלוב חדש ונקי על חם.
- בעוד החיה הראשונה עוברת הסרת שיער על הבמה האמריקאי, החיה הבאה ניתן להוסיף לחדר אינדוקציה.
- לפני שהוא מורדם בכלוב הבא של עכברים, לכבות את isof, ולשטוף את התא אינדוקציה עם חמצן. נקו את חדר האינדוקציה והבמה האמריקאי/קונוס עם sterilant. חזור על שלבים 2.5-2.14 עד שכל הכלובים והעכברים עברו הסרת שיער.
הערה: בעלי חיים צום על ידי נסיגה זמנית של מזון לתקופה לפני השרשה יכול להיחשב למזער חסימה חזותית של איברי הבטן בשל מזון לא מתעכל בבטן ובמעיים (12-24 שעות). לא מומלץ להגבלת המים. אם בעלי חיים הם מטופלים, מומלץ לטפל בזריקה של 1 מ ל חם (37 ° c), תמיסת מלח סטרילית לאחר הזרקת הגידול על מנת למנוע התייבשות.
3. אולטראסאונד-השרשה של תאי PDA
הערה: כל הליכי האולטרסאונד מתבצעים באמצעות מחשב ותוכנה לדימות אולטרסאונד (ראה טבלת חומרים). מתמר יש תדר מרכז של 40 MHz ורוחב פס של 22-55 MHz.
- כוונן את פלטפורמת האולטרסאונד כך שמשטח הפלטפורמה יהיה מקביל לרצפה והחוקר פונה לצדו השמאלי של בעל החיים, כאשר ראשו של בעל החיים מימין. להתאים את מיקום מתמר כך תמונה בבטן הרוחבי יתקבל (איור 1א).
- מורדם העכבר כדי להיות מוזרק כמתואר בשלבים 2.1-2.8. ייצוב העכבר על פלטפורמת ארה ב כמתואר בשלב 2.9.
- החלת כמות נדיבה של ג'ל אולטרסאונד חם (37 ° c) לחלק שיער הבטן.
- הנמך בעדינות את התמר כדי ליצור קשר עם הבטן של העכבר. להתאים את מתמר לפי הצורך עד הלבלב הוא נראה בבירור. אתר את הכליה השמאלית ואת הטחול כדי לספק אוריינטציה מדויקת של חלל הבטן.
הערה: מכיוון שהמיקום של התמר שונה כדי לאפשר גישה לצד שמאל של הבטן, הציר X ו-Y בפקדי השלב הפוכים כעת. - לטעון 29G x 1/2 "מזרק אינסולין (ראה טבלת חומרים) עם 25μL של השעיית תאים סרטניים. ניגוב טיפ מחט עם משטח הכנה אלכוהול סטרילי לפני הזרקה על מנת למזער את הגידול בתאים זריעה בקיר הבטן.
- באמצעות מלקחיים קהה-קצה, אחוז בעור ובקיר הצפק כדי להגדיל את המתח באתר ההזרקה הרצוי. החזקת המזרק בקירוב של 25 °-45 מעלות למשטח האולטרה-סאונד, מקדמת באיטיות את המחט דרך העור והקיר הצפק. אשר את המחט ניקב דרך הקיר הצפק לפני שתמשיך לשלב הבא. יש לחוש מוקפץ קטן כשהמחט. מעלה את קיר הצפק
- תחת הדמיית אולטרסאונד, להנחות את המחט ישירות לתוך הלבלב (איור 1B-C). לאשר את המחט היא בתוך רקמת הלבלב על ידי הזזת בעדינות את קנה המזרק למעלה ולמטה. אם המיקום נכון, קצה המחט יישאר בתוך רקמת הלבלב בעוד חבית המזרק נע.
- לאט להזריק את התאים הסרטניים ולאשר את התאים מושתלים במיקום הרצוי על ידי היווצרות של בולוס נוזל בתוך הלבלב (גלוי על מסך אולטרסאונד, איור 1ד).
הערה: יש לחוש התנגדות כלשהי בזמן הבוכנה המדכאת. להיזהר לא לחדור לבלב מספר פעמים כמו זה מגביר את הסבירות של דליפה לתוך חלל הבטן. - לאחר כמות מלאה של ההשעיה הוזרק וללא נוזלים ניתן לראות בלבלב, לשמור על המחט עדיין מספר שניות. לאט לבטל את המחט מהבטן של העכבר, הטיפול הגדול לא להפריע את התאים המוזרקים.
- למקם את העכבר בכלוב נקי, חם ולהבטיח כי העכבר מתאושש באופן מלא מן ההרדמה. חזור על תהליך זה עבור כל החיות.
- לפני להרדמה העכבר הבא, לנקות את החדר אינדוקציה בשלב אמריקאי הבמה/קונוס עם sterilant.
- חזור על שלבים 3.2-3.11 עד שכל העכברים הזריקו.
Representative Results
המטרה של דו ח זה הייתה לספק פרוטוקול מפורט לביצוע השרשה-אולטרסאונד של קווי מחשב כף יד של KPC נגזרים. בניסויים מייצגים המוצג באיור 2-4, אנו מאשרים כי הגידולים האלה-otim לגדול בקצב עקבי ובאופן תלוי במינון. יתר על כן, אנו מראים כי הגידולים הללו-OTIM ללכוד את התכונות האימונולוגיים והיסטולוגית בולטות של KPC TME. לפיכך, מערכת ה-מחשב-משתמש-OTIM הוא מודל מחשבי כף יד קליני שניתן להשתמש בו באופן תפוקה גבוהה כדי למסך במהירותשילובי טיפול חדש ב-vivo.
באמצעות פרוטוקול בסיס-OTIM המתואר כאן, העכברים היו מוכנים השרשה, מאובטח לפלטפורמת אולטרסאונד מחומם ואת המיקומים של הפלטפורמה הן מתמר הותאמו להליך זה כפי שמוצג באיור 1. ברזולוציה גבוהה אולטרסאונד הדמיה שימש כדי לזהות אתר הזרקה בתוך הלבלב העכבר, כי ניתן לפלח ללא חירור של הכליה או הטחול (איור 1B). תחת הדמיה באולטרסאונד, המחט הוצג בקפידה על חלל הבטן דרך הקיר הצפק והונחה לתוך הלבלב העכבר (איור 1ג). לאחר המיקום הנכון של המחט הוקמה, השעיית תא הגידול הוזרק לאט מאוד לתוך הלבלב. השרשה מוצלחת אושרה על ידי נוכחות של בועה בתוך הלבלב (איור 1ד). בניסויים מוקדמים, העכבר הוקרב, והיעילות של ההליך אומתה על ידי המחשה ישירה של בולוס נוזלי ברקמת הלבלב הגולמי (איור 1E).
השתלת הגידול שיעור הצמיחה היה מפוקח על ידי דימות אולטרסאונד שבועי. מטעי מוצלחת המיוצרים גידולים שהיו כלולים בגבולות הלבלב לאורך זמן הניסוי (איור 2א). התוכנה אולטרסאונד ( לראות את הטבלה של חומרים) המשמש לאזור הגידול ונפח להיקבע עבור כל נקודת זמן, כמו גם עבור מיפוי 3d של גידולים נמדד להיווצר (איור 2B), ותמונות 3d אושרו בזמן של נקרופסי העכבר (איור 2ג). הזרקת תא בלתי הולמת במהלך הליך ה-it-OTIM יכול לגרום להתפתחות של גידול בקיר הצפק (דמות ייצוגית של אשר מוצג באיור 2ד). עכברים שנוכחים עם גידולים הצפק ניתן לכלול מחקרים נוספים.
כדי לקבוע את הריכוז של תאים אופטימליים לשימוש במחקרים קדם קליניים, C57Bl/6 KPC-נגזר קו מחשב כף יד (4662)9 הוזרק ל נאיבי, פראי סוג C57Bl/6 עכברים על פני שישה ניסויים עצמאיים. זה קו הטלפון ( בגיל מתורבת שש פעמים) נגזר העכבר הנושאת במלואו לטיפול בגידול kpc (> 10 דורות, אישר על ידי snp-ניתוח19) כדי למנוע מולקולרי מולקולרית תאימות היסטריות הגידול אנטיגנים מורכבים. תאים סרטניים הוזרקו ב סיכוייו נמוך (1.25 x 106 תאים/25μl) ו-סיכוייו גבוה (5 x 106 תאים/25μl) מינון. זריקות הגידול הגבוה סיכוייו הביא לחלק גדול יותר של חיות הנושאת הגידול שלושה שבועות לאחר זריקות בהשוואה סיכוייו נמוך (איור 3א). למרות העיכוב בתחילת הגידול, שיעור גידול הגידול הכולל לא היה שונה באופן משמעותי בין שתי מנות (איור 3ב). באופן דומה, בעוד שיעור ההישרדות בין שני הגדודים לא היה שונה באופן משמעותי, מגמת הנתונים כלפי הישרדות משופרת מעט בתוך המחזור סיכוייו נמוך (איור 3ג). הקבוצה הגבוהה סיכוייו גם הפיק שיעור גדול יותר של עכברים עם גידולים שהיו enrollable במחקרים פרה-קליניים (המיועדים ב ≥ 20mm3 הגידול נפח) על ידי ארבעה שבועות לאחר ההזרקה מאשר הקבוצה הנמוכה סיכוייו (איור 3D). רוב העכברים משני כנופיית סיכוייו גבוה ונמוך שהוצגו עם גידולים enrollable על ידי יום 25 ופיתח מחלה בשלב הסיום סימפטומים כולל מיימת (נתונים לא מוצגים). גרורות, אשר לא מתרחשות באמצעות 4662 במינון התא מפרוטוקול זה, עשוי להיות מעוצב עם קווי תאים שונים או מינונים33.
השיטה-OTIM מחייב שליטה של מיומנויות מוטוריות קנס כדי להתאים במדויק את אתר ההזרקה הרצוי, אשר היה מאתגר בניסויים המוקדמים ביותר שלנו. מסיבה זו, אנו כללנו שולחן המתאר את מספר בעלי החיים שפיתחו גידולים בתוך הלבלב (מטעי מוצלחת) לעומת המספר הכולל של בעלי חיים שעברו אולטרסאונד השתלת גידול מונחה (שולחן 1). בעלי חיים חוסלו מניתוחים עתידיים אם גידולים שפותחו במיקום בלתי רצוי (כלומר, כליה) או אם לא היתה הוכחה לגידול על ידי שישה שבועות לאחר ההזרקה, כפי שמצוין. ההתקדמות השבועית של הפרופורציה של עכברים הנושאת enrollable גידולים בלבלב (≥ 20mm3 הגידול נפח) מכל ניסוי מוצג גם בטבלה 1.
כדי לקבוע אם היה יתרון להשתמש בגישה באמצעות ה-, ובמקום מודל הטיפול המסורתי כירורגי (מעבר להשקעה בזמן לאחר קבלת מיומנות בטכניקה), השוונו את הזריעה של גידולים PDA בקיר הצפק של עכברים לאחר כל הליך. מצאנו כי רק 2/31 עכברים (6.5%) פיתח גידולים בקיר הצפק בלתי מכוונות לאחר מערכת הזריקות-OTIM, כמו בהשוואה 7/15 עכברים שפיתחו גידולים בקיר הצפק לאחר הזרקה כירורגית (46.6%, p < 0.0029) (טבלה 1). לפיכך, שיעור הזריעה של גידולים נוספים בצפק מצטמצם מאוד בשיטת ה-ווטים לעומת השרשה כירורגית.
לאחר ההקרבה של עכברים הנושאים גידולים מבוססי-OTIM, מצאנו כי האנטומיה הגולמית של הגידולים היה דומה לגידולים KPC ספונטנית (איור 4א). ניתוח היסטולוגית הפגין תבנית של מבני דוטל חריגים שהיו דומים בשני הדגמים, והוא הציג את המבנה של המחלה האנושית (איור 4ב). כדי לחקור את לחדור את החיסון בתוך שני KPC ו-הגידולים הללו-OTIM, המייצג דגימות היסטולוגית היו מוכתם עבור CD3 (מבוטא על ידי תאי T) ו-F4/80 (מבוטא על ידי מקרופאגים). בשני הדגמים, הצביעת דפוסי חשף גידולים שחדרו בצורה גרועה על ידי תאי T (איור 4ג), אבל מאוד חדרו מקרופאגים (איור 4ד). ממצא זה מתאים באופן מבחינה חיסונית הצטננות הקרה של רוב האנשים וכלי מחשב כף יד בדיקות5,7,12.
איור 1: השרשה אולטרסאונד-מונחה של תאי PDA לתוך הלבלב murine. (A) התמצאות של העכבר, השלב אולטרסאונד, ובדיקת אולטרסאונד להשתמש כדי להשיג תמונה ברזולוציה גבוהה של איברי הבטן. הערה השלב והפלטפורמה הפכו 90 ° מכיוון רגיל כדי לאפשר גישה קלה לרביע השמאלי העליון של הבטן העכבר. (ב) תמונת אולטרה-סאונד המתארת את הזיהוי של הכליות, הטחול והלבלב. כאן המחט הזריקה ממוקם נגד הבטן העכבר. (ג) דמות אולטרה-סאונד המתארת את המחט בתוך הלבלב של העכבר. (ד) באולטרסאונד תמונה המתארת את הבועה באתר ההזרקה (המתואר בכחול) בעקבות הזרקה מבוקרת של תאים סרטניים אל הלבלב. (ה) לפרוטומיה חושף את ההזנה הנוזלית המכילה תאי PDA בלבלב לאחר הזרקה מונחית אולטרסאונד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניטור צמיחת הגידול לאחר בהזרקה-OTIM הזרקת. (א) הנציג של הדמות האולטרה-סאונד של הגידול (A) המייצג (המתוארבכחול) ב 2, 3, ו 5 שבועות לאחר ההזרקה, כפי שצוין. (ב) נציג שוחזר תמונה תלת-ממדית של הגידול של ה-otim, 5 שבועות לאחר הזרקה באמצעות תוכנת אולטרסאונד. (C) נציג האנטומיה הגולמית של מערכת הגידול של otim 5 שבועות לאחר הזרקה על נמק בעכבר. (ד) מייצגת דמות באולטרהגרפית של גידול בקיר הצפק הצומח בשכבה התת עורית לאחר הזרקת תא בלתי הולמת ב -7 שבועות לאחר ההזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: התפרצות תלויי מינון של גידולים enrollable לאחר הזרקת אולטרה סאונד מונחה של תאים PDA. (A) חלק של עכברים נושאת הגידול בנקודות זמן שצוין לאחר ההזרקה כפי שמתואר באיור 1 עם סיכוייו גבוה (500,000 תאים/25μl) או סיכוייו נמוך (125,000 תאים/25μl) תאים סרטניים, כפי שמצוין. (ב) הגידול קינטיקה של עכברים מ (א), כל סמל מייצג קבוצה של עכברים, קווי שגיאה מציינים SEM. (ג) פרופורציה של עכברים מ (א) בחיים בנקודות הזמן המצוין לאחר ההזרקה. עכברים היו מורדמים או מצונזרים אם גידולים היו > 1000mm3 או מצב הגוף היה עני בשל התחלואה הגידול. (ד) זמן enrollable התפרצות הגידול של עכברים מ (א). גידולים Enrollable נחשבים ≥ 20mm3 בנפח. נציג נתונים של 4 ניסויים עצמאיים עם n = 8-20 עכברים/ניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| ניסוי | לבלב-גידול הנושאת/הזרקת סה כ | שבוע 1 (Enrollable) | שבוע 2 (Enrollable) | שבוע 3 (Enrollable) | שבוע 4 (Enrollable) | גידולי הצפק הפריפריאל |
| מוניטור גבוה | 24/31 | ND | 8/24 (3/24) | 15/24 (7/24) | 23/23 (20/23) | 2/20 |
| שטיטר נמוך | 11/17 | ND | 3/11 (0/11) | 6/11 (3/11) | 9/11 (5/11) | 0/11 |
| הזרקה כירורגית | 15/17 | ND | ND | 15/15 (9/15) | 15/15 (14/15) | 7/15 |
טבלה 1: מספר גידולים בהצלחה של הרשת-OTIM לעומת השרשה כירורגית. נתונים בשילוב מ 2-4 ניסויים עצמאיים לכל מצב סיכוייו גבוה או נמוך עם n = 5-10 עכברים לכל ניסוי. "הזרקה כירורגית" מציין עכברים שקיבלו הזרקה בבטן לפרוסקופי כירורגית של 125,000 תאים סרטניים. "הנושא גידול" מציין עכברים עם גידול בלבלב. "Enrollable" מציין חלק של עכברים נושאת הגידול בכל נקודה עם נפח הגידול > 20mm3. "גידולים הצפק מקורה" מציין את החלק הכולל של עכברים הנושאת הגידול כי היה במקביל זריעה של גידולים בקיר הצפק מתוך הזרקת תא הגידול. עכברים עם גידולים המציגים באופן שגוי ברקמות שאינן הלבלב (כלומר, כליה) לא נכללו באוכלוסיות "הנושאת גידול" (אך כלולים בעכברים המוזרקים סה כ). ND, לא נקבע. תדירות של זריעת הקיר הצפק השוואת קבוצות סיכוייו גבוהה ונמוך בשילוב לעומת השרשה כירורגית, p < 0.0029 באמצעות 2-זנבית T בדיקה עם מאן-ויטני פוסט-מבחן.
איור 4: הגידולים של האוטים-OTIM לכידה מיקרואת הסביבה של הגידול KPC. תמונות מייצגות מוצגות. בשורה העליונה, גידולים KPC. בשורה התחתונה, הגידול בגידולים. בשבוע 5 שלאחר ההשתלה (א) האנטומיה הגולמית של גידולים שעברו על נקרופסי. (ב) H & E (10x, bar = 100μm) (C) אימונוהיסטוכימיה מכתים עבור CD3 (חום) (10x, bar = 100μm). (ד) אימונולואוורכתמים של F4/80 (אדום) ו dapi (כחול) (4x, בר = 500μm). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
אנו מראים כאן כי השימוש באולטרסאונד ברזולוציה גבוהה כדי ליישר השרשה של קווי מחשב כף יד מורין לאתר רקמת autochthonous היא חלופה אמינה הן מערכות מודל KPC ו כירורגית אורתוסייט. מייצר-OTIM מייצרת גידולים ביולוגית רלוונטיים לשמור את התכונות immunopathological של מחשב כף יד עם מסגרת זמן מקוצר כדי לאבחן את הגידול והקינטיקה אמין הגידול הראשוני. אולטראסאונד הזרקת מונחה ולכן לשמש כלי שימושי עבור ייצור מהיר של עכברים הנושאת אורתולמריחה על מחשב כף יד גידולים, המאפשר חקירה של שילובים טיפוליים במודל רלוונטי קלינית.
השרשה אולטרסאונד מציעה שיפורים חשובים בדגמים סטנדרטיים של חקירה פרה-קלינית. ראשית, הליך זה מבטלת את הניטור הזמן האינטנסיבי של עכברים KPC להתפתחות של גידולים ספונטניים על ידי השתלת ישירות C57BL/6 מחשבי כף יד מצטלבים ברקע ללבלב murine. שנית, בדומה זריקות מסורתיות אורתודופית, הגישה מאפשר לשלוט על קו התא מוזרק, כולל מבחר של קו הגידול המונשבטיים ו/או לשעבר מניפולציה vivo של קו התא, כמו גם שליטה על המארח קבלת השתלת התא הגידול. שלישית, זו טכניקה מינימלית פולשנית מונעת את העבודה המפרך של ניתוח הישרדות עוקף את תקופת ההחלמה לאחר הניתוח מסובך עבור בעלי חיים, כמו גם אותות דלקתיים מריפוי פצע כירורגי. בסופו של דבר, הגידולים מבוססי-OTIM-דומה השרשה כירורגית-לכידה של TME שנצפו בעכברים KPC, כולל הסתננות תא T נמוך הסתננות מקרופאג גבוהה. לפיכך, מודל ולאחר מכן-OTIM שומרת תכונות מפתח של גידולים KPC ללא סיבוכים נוספים כי מפגר חקירות טיפוליות במודל KPC ספונטנית.
מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול הם מפתח למאסטר להצלחת הטכניקה. התמחות בדימות אולטרסאונד murine חיוני עבור הליך זה, אבל המיומנות הידנית הנדרשת תאים השתל בהצלחה בלבלב היא להגדיר מיומנות כי יש לפתח באופן עצמאי. עבור עכברים על מחזור 12 שעות אור/כהה, צום בעלי החיים לילה הבטיחו את הבטן ואת המעיים נוקו של כל מזון לא מתעכל שיכול לחסום את המבט של הלבלב, הכליה והטחול על ידי אולטרסאונד. בנוסף, כל קו תא המשמש הזרקה אורתוטופית צריך להיות טיטרציה לפני ניסויים נוספים כדי להבין את הקינטיקה הצמיחה ולקבוע את הפוטנציאל הגרורתי33. במהלך ההזרקה, השימוש מלקחיים לצבוט העור באתר ההזרקה יצרה את המתח הדרוש לנקב בעדינות דרך העור והצפק בקיר. צעד מפתח בהליך היה להנחות בזהירות את המחט לתוך הלבלב מבלי לנקב את הרקמה או לפרוץ לאתר מחוץ למטרה כגון הטחול או הכליה. אישור של בולוס נוזל היה האינדיקטור הטוב ביותר של הזרקת תא הגידול מוצלחת ברקמה הנכונה. לאחר ההזרקה, המחט צריך להיות מסוגר לאט כדי לא להפריע את העירוי נוזל. מצאנו כי סדרה של זריקות ניסיון באמצעות Dמאמ או טרילאן כחול עזר לפתח שליטה של מיומנויות מוטוריות קנס הדרוש לזריקה זו.
במהלך פתרון בעיות של הליך זה, זיהינו מספר גורמים שפגעו בהצלחת הפרוטוקול. בניסויים בניסוי, הטעות הנפוצה ביותר שלנו היתה ניקוב הכליה במהלך השרשה, אשר התרחשה לעתים קרובות יותר בניסויים המוקדמים שלנו רומז כי תרגיל רגיל של מיומנות זו משפרת את המיומנות. בנוסף, מצאנו כי המאשר את הנוכחות של בולוס נוזל לאחר הזרקת תא הגידול דרך הן אולטרסאונד והדמיה ישירה ב נקרופסי במהלך פתרון בעיות משופר הזרקה טכניקה מוצלחת. אם היווצרות של בועה אינו מאושר על ידי אולטרסאונד במהלך ההזרקה, את המיקום של המחט ניתן לכוונן לפני מדכא לחלוטין את המזרק כדי לשחרר את העירוי הנותר של תאים סרטניים. ראינו גם כי כרכים ההשעיה מוזרק מהר מדי הביאו את התעלה של תאים סרטניים לתוך חלל הצפק או התמוטטות של הנוזלים בלבלב. באופן כללי, בעלי חיים אלה המשיך לפתח גידולים בלבלב למעט n = 7 בעלי חיים שלא הראו ראיות של גידול 4 שבועות לאחר ההזרקה. תוצאה זו דווחה רק בניסיונות הראשונים שלנו (ו 6/7 בעלי חיים הוזרק עם סיכוייו נמוך של תאים סרטניים). עכברים כי יש בספק זריקות תאים הגידול, או דרישה למיקום מחדש של המחט, צריך להיות מפוקח הדוק להתפתחות של גידולים מחוץ ללבלב.
המגבלות הבראש של אולטרסאונד שיטה מונחה הם הזמינות של המכשירים הדרושים ואת המיומנות הטכנית הקשורים השתלת הגידול. ההליך הוא לא סטרילי לחלוטין, כמו העכבר מוזרק non-sterilely על פלטפורמת אולטרסאונד, עם המזרק ואת טיפ מחט עובר דרך ג'ל אולטרסאונד. למרות שראינו לא ראיות של זיהום n = 148 עכברים על סך של 8 ניסויים עצמאיים מאז ייזום מחקרים אלה, ייתכן כי סוכן זיהומיות יכול להיכנס ללבלב דרך המחט הזריקה במהלך תהליך זה. ככזה, כמו היבטים רבים של הפרוטוקול ככל האפשר (כולל כפפות, משטחי אולטרסאונד, קופסאות קרח) יש לרסס עם חיטוי או 70% אתנול כדי להפחית את החשיפה הפוטנציאלית פתוגנים. מגבלה נוספת של הפרוטוקול הנוכחי היה חוסר גרורות באמצעות קו 4662 התאים בדילול הנוכחי. כל קו תא המשמש במערכת מערכת-otim צריך להיות טיטרציה עבור שיעורי הצמיחה הרצויה, כמו גם גרורות פוטנציאלי33. לבסוף, הפרוטוקול הנוכחי שלנו הקים טכניקות להזרקת תאים סרטניים בהשעיה של תא אחד. עם זאת, התוספת של מצע מטריצה מתוך החילוץ ניתן להוסיף כדי לשפר את הקמת הגידול ולמנוע דליפה תא הגידול (כפי שהוא משמש מודלים השרשה כירורגי27,30,31,32). כך, רבים של מגבלות של לסרוג-OTIM ניתן להתגבר עם בדיקות מתאימות של קווי התא בשימוש בזריקות אורתוטופית.
לסיכום, המודל מסוג-מודל-OTIM הוא שיטה מדויקת של הזרקה רקמה בבימויו של תאים סרטניים ללבלב murine. זו טכניקה מינימלית פולשנית השרשה היתרונות הן החוקר ובעלי החיים על ידי הפחתת זמן ההליך, מזעור סיבוכים שלאחר ניתוח ושיפור דיוק של הזרקה. גידולים הנובעים מ-והזרקת-OTIM הזריקות לשמור על תכונות החיסוני האופייני של גידולים KPC ספונטנית, יש זמן אמין התפרצות הגידול, והצמיחה קינטיקה הגידול מנוכל. כך מודל-OTIM של המודל יכול לשמש באופן יחסי תפוקה גבוהה לחקור שילובים טיפוליים בהגדרה טרום קלינית כדי לחשוף את הטיפולים החדשניים עבור חולים עם הצורך הגדול ביותר הקליני.
Disclosures
למחברים אין כל גילוי.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לד ר רוברט וונדרהייב וכל חברי המעבדה Vonderheide, כל חברי בית החולים לסרטן הלבלב, ד ר. בן שטנגר, מרכז המחקר לסרטן הלבלב באוניברסיטת פנסילבניה, ודבורה מדלמן עבור דיונים מועילים. עבודה זו נתמכת על ידי מימון מן המכון פארקר לטיפול בעמית חיסוני סרטן (KTB) ואת סרטן הלבלב מרכז המחקר באוניברסיטת פנסילבניה (CC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Conicals | Thomas Scientific | 2602A26 | |
| Blunt edged forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Cell Dissociation Buffer | Thermo-Fisher | 13151014 | |
| Cotton Tipped swabs | Thermo-Fisher | 19062614 | |
| Covidien Monoject 3/10mL, 29G X 1/2" | Thermo-Fisher | 8881600145 | |
| Depilatory Agent | Amazon | Nair Body Lotion | |
| DMEM | Thermo-Fisher | 10-566-016 | |
| FBS | Gemini Bio-oroducts | 100-106 | |
| Flask | Sigma-Aldrich | CLS430825 | |
| Forceps (blunt edge) | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Gauze | Fisher | 13-761-52 | |
| Gentamicin | Thermo-Fisher | 15750060 | |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Isofluorane | Penn Vet Supply | VED1350 | |
| Isofluorane Vaporizer | VetEquip | 911103 | |
| L-glutamine | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Optixcare | MidWest Veterinary Supply | 052.50310.3 | |
| Paper Tape | Medline | MMM1530Z5 | |
| PBS | Thermo-Fisher | 14-190-250 | |
| Slide warmer | C&A Scientific | XH-2001 | |
| Sterilant (Clidox-S) | Fisher Scientific | NC0332382 (activator) NC9189926 (base) | Needs to be combined according to manufacturer's instructions |
| Sterile Alcohol prep pad | Covidien | 6818 | |
| Trypsin | Thermo-Fisher | 15090046 | |
| Ultrasound gel | Thermo-Fisher | 03-34-1LT | |
| Visualsonics Ultrasound Vevo 2100 | Visual Sonics | Vevo 2100 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Chao, T., Furth, E. E., Vonderheide, R. H. CXCR2-Dependent Accumulation of Tumor-Associated Neutrophils Regulates T-cell Immunity in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Immunology Research. 4 (11), 968-982 (2016).
- Steele, C. W., et al. CXCR2 Inhibition Profoundly Suppresses Metastases and Augments Immunotherapy in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. 29 (6), 832-845 (2016).
- Li, J., et al. Tumor Cell-Intrinsic Factors Underlie Heterogeneity of Immune Cell Infiltration and Response to Immunotherapy. Immunity. 49 (1), 178-193 (2018).
- Beatty, G. L., et al. Exclusion of T Cells From Pancreatic Carcinomas in Mice Is Regulated by Ly6C(low) F4/80(+) Extratumoral Macrophages. Gastroenterology. 149 (1), 201-210 (2015).
- Bayne, L. J., et al. Tumor-derived granulocyte-macrophage colony-stimulating factor regulates myeloid inflammation and T cell immunity in pancreatic cancer. Cancer Cell. 21 (6), 822-835 (2012).
- Beatty, G. L., et al. CD40 agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreatic carcinoma in mice and humans. Science. 331 (6024), 1612-1616 (2011).
- Lo, A., et al. Tumor-Promoting Desmoplasia Is Disrupted by Depleting FAP-Expressing Stromal Cells. Cancer Research. 75 (14), 2800-2810 (2015).
- Rhim, A. D., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 25 (6), 735-747 (2014).
- Ozdemir, B. C., et al. Depletion of Carcinoma-Associated Fibroblasts and Fibrosis Induces Immunosuppression and Accelerates Pancreas Cancer with Reduced Survival. Cancer Cell. 28 (6), 831-833 (2015).
- Clark, C. E., et al. Dynamics of the immune reaction to pancreatic cancer from inception to invasion. Cancer Research. 67 (19), 9518-9527 (2007).
- Stromnes, I. M., Hulbert, A., Pierce, R. H., Greenberg, P. D., Hingorani, S. R. T-cell Localization, Activation, and Clonal Expansion in Human Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Immunology Research. 5 (11), 978-991 (2017).
- Morrison, A. H., Byrne, K. T., Vonderheide, R. H. Immunotherapy and Prevention of Pancreatic Cancer. Trends in Cancer. 4 (6), 418-428 (2018).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
- Yip-Schneider, M. T., et al. Dimethylaminoparthenolide and gemcitabine: a survival study using a genetically engineered mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 13, 194 (2013).
- Frese, K. K., et al. Nab-Paclitaxel potentiates gemcitabine activity by reducing cytidine deaminase levels in a mouse model of pancreatic cancer. Cancer Discovery. 2 (3), 260-269 (2012).
- Stromnes, I. M., et al. T Cells Engineered against a Native Antigen Can Surmount Immunologic and Physical Barriers to Treat Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. 28 (5), 638-652 (2015).
- Byrne, K. T., Vonderheide, R. H. CD40 Stimulation Obviates Innate Sensors and Drives T Cell Immunity in Cancer. Cell Reports. 15 (12), 2719-2732 (2016).
- Winograd, R., et al. Induction of T-cell Immunity Overcomes Complete Resistance to PD-1 and CTLA-4 Blockade and Improves Survival in Pancreatic Carcinoma. Cancer Immunology Research. 3 (4), 399-411 (2015).
- Keenan, B. P., et al. A Listeria vaccine and depletion of T-regulatory cells activate immunity against early stage pancreatic intraepithelial neoplasms and prolong survival of mice. Gastroenterology. 146 (7), 1784-1794 (2014).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
- Maddipati, R., Stanger, B. Z. Pancreatic Cancer Metastases Harbor Evidence of Polyclonality. Cancer Discovery. 5 (10), 1086-1097 (2015).
- Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. The evolving relationship of wound healing and tumor stroma. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (18), (2018).
- Kasper, M., et al. Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (10), (2010).
- Stuelten, C. H., et al. Acute Wounds Accelerate Tumorigenesis by a T Cell-Dependent Mechanism. Cancer Research. 68 (18), (2008).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods of Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Moreno, J. A., Sanchez, A., Hoffman, R. M., Nur, S., Lambros, M. P. Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models and Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Huynh, A. S., et al. Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound-guided injection of cells. Public Library of Science One. 6 (5), e20330 (2011).
- Thomas, T. T., et al. Utilization of Ultrasound-guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Jager, W., et al. Minimally invasive establishment of murine orthotopic bladder xenografts. Journal of Visualized Experiments. (84), e51123 (2014).
- Aiello, N. M., Rhim, A. D., Stanger, B. Z. Orthotopic injection of pancreatic cancer cells. , Cold Spring Harbor Protocols. (2016).
