Summary
Nous décrivons un protocole pour l'implantation guidée d'ultrason des lignes canalaires canalaires canalaires d'adénocarcinome murine-dérivées de l'adénocarcinome de voie inole directement dans le site indigène de tumeur. Cette approche a eu comme conséquence les tumeurs pancréatiques détectables par balayage d'ultrason dans un délai de 2-4 semaines de l'injection, et a réduit de manière significative l'ensemencement de cellules de tumeur proportion sur la paroi péritonéale par rapport à l'implantation orthotopic chirurgicale.
Abstract
Le succès récent du blocus de point de contrôle immunitaire dans le mélanome et l'adénocarcinome de poumon a galvanisé le domaine de l'immuno-oncologie aussi bien que a indiqué les limites des traitements courants, car la majorité des patients ne répondent pas à l'immunothérapie. L'élaboration de modèles précliniques précis pour identifier rapidement des combinaisons thérapeutiques nouvelles et efficaces est essentielle pour répondre à ce besoin clinique non satisfait. L'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDA) est un exemple canonique d'une tumeur résistante au blocus de point de contrôle immunitaire avec seulement 2% de patients répondant à l'immunothérapie. Le KrasG12DMD/-génétiquement modifié ; Trp53R172HMD/-; Pdx-1 Cre (KPC) modèle de souris de PDA récapitule la maladie humaine et est un outil précieux pour évaluer les thérapies pour l'immunothérapie résistante dans le cadre préclinique, mais le temps à l'début de tumeur est très variable. Les modèles orthotopiques chirurgicaux d'implantation de tumeur de PDA maintiennent les marques immunobiologiques du microenvironnement de tumeur tissu-spécifique de KPC (TME) mais exigent une procédure de temps-intensive et introduisent l'inflammation aberrante. Ici, nous utilisons un modèle orthotopic d'implantation orthotopic de tumeur ultrason-guidé (UG-OTIM) pour injecter non-invasivement kPC-dérivé des lignes de cellules de PDA directement dans le pancréas de souris. Les tumeurs d'UG-OTIM se développent dans le site endogène de tissu, récapitulent fidèlement des dispositifs histologiques du TME de PDA, et atteignent des tumeurs d'inscription-classées pour des études précliniques par quatre semaines après injection avec l'ensemencement minimal sur la paroi péritonéale. Le système UG-OTIM décrit ici est un modèle de tumeur rapide et reproductible qui peut permettre l'analyse à haut débit des combinaisons thérapeutiques nouvelles dans le TME murine de PDA.
Introduction
L'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDA) est une maladie notoirement agressive qui est réfractaire aux traitements actuels, avec un taux de survie lamentable de 5 ans de 9%1. PDA a récemment dépassé le cancer du sein pour devenir la troisième cause de mortalité liée au cancer aux États-Unis et devrait devenir la deuxième cause (derrière seulement le cancer du poumon) d'ici l'an 20302. Un certain nombre de caractéristiques caractéristiques de l'immunologiquement «froid» Microenvironnement tumoral PDA (TME) - y compris une forte infiltration des populations de cellules myéloïdes immunosuppressive3,4,5,6,7, dépôt stromal dense8,9,10,11, et une pénurie de lymphocytes T5,12,13-contribuer à l'échec des immunothérapies dans PDA14. À cette fin, l'utilisation d'un modèle animal cliniquement pertinent est un outil essentiel pour étudier l'efficacité de nouvelles combinaisons de médicaments pour les tumeurs immunologiquement froides in vivo.
Le KrasG12DMD/-génétiquement modifié ; Trp53R172HMD/-; Pdx-1 Cre (KPC) modèle de souris de PDA récapitule fidèlement les aspects cliniques saillants de la PDA humaine, y compris les moteurs moléculaires de la maladie et les caractéristiques histopathologiques15. Les tumeurs de KPC se développent spontanément dans les souris entièrement immunocompétentes, permettant l'interrogation des approches thérapeutiques comprenant la chimiothérapie16,17,immunothérapie18,19,20,21, et la thérapie de stroma-ciblage9,11,22invivo avant l'administration de ces drogues dans le cadre d'essai clinique. En dépit de ses nombreux points forts comme modèle préclinique de PDA, l'utilisation des souris de KPC est désavantagée par la progression fortement variable du développement spontané de tumeur pendant que le commencement de tumeur peut s'étendent de 4 à 40 semaines (exigeant ainsi l'entretien une grande colonie reproductrice)15. En outre, les souris KPC ont le potentiel pour les tumeurs primaires polyclonales23, et il ya un déclin rapide de la santé animale et l'augmentation des co-morbidités, y compris la cachexie et ascites que la maladie progresse15.
Une alternative au modèle spontané de souris KPC est d'utiliser un modèle d'implantation orthotopique de PDA24. L'implantation chirurgicale directe des lignées de cellules de tumeur dedans au site indigène de tissu est une méthode plus rentable et prévisible de récapituler le microenvironnement de tumeur de tissu-spécifique (TME) de PDA. L'implantation tumorale permet l'injection de lignées cellulaires tumorales clonales à des souris génétiquement rétrocroisées5, permettant aux souris hôtes avec des manipulations génétiques supplémentaires qui seraient longues à se reproduire dans le modèle de souris KPC. Cependant, l'implantation pancréatique de tumeur exige une procédure chirurgicale laborieuse-intensive qui introduit l'inflammation anormale au site de suture dans la paroi abdominale24,25,26, et inclut souvent une longue récupération postopératoire27,28,29.
Les progrès technologiques en imagerie par ultrasons à l'aide de transducteurs spécifiques aux rongeurs fournissent des images haute résolution en temps réel. Guidé par l'imagerie par ultrasons du mouvement de l'aiguille d'injection dans la cavité péritonéale, on peut spécifiquement implanter des cellules tumorales dans le pancréas, en tirant parti des avantages des injections de tumeur orthotopic en l'absence de l'implantation chirurgicale et de l'inflammation associée. Cette approche, appelée modèle orthotopic d'implantation orthotopic de tumeur ultra-guidée (UG-OTIM) a été précédemment établie dans un modèle xénogreffe du cancer pancréatique30 aussi bien que dans plusieurs autres modèles de cancer comprenant le sarcome d'Ewing, le neuroblastoma et le cancer de réservoirsouple 31,32.
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour effectuer des injections ultrason-guidées des lignes de cellules de tumeur dedans au pancréas murine. Nous montrons les tumeurs résultantes récapitulent les dispositifs histologiques et immunologiques du TME de KPC et peuvent donc être employées pour étudier de nouvelles combinaisons thérapeutiques, y compris des immunothérapies, pour indiquer rapidement les traitements les plus prometteurs pour se déplacer dans les essais cliniques.
Protocol
Les protocoles sur les animaux ont été examinés et approuvés par le Comité institutionnel des soins et de l'utilisation des animaux de l'Université de Pennsylvanie. Des souris C57Bl/6 femelles de 5 à 6 semaines ont été achetées (voir Tableau des matériaux) et utilisées après 1-3 semaines de repos. Le Laboratoire universitaire des ressources animales supervisait les soins aux animaux.
1. Préparation des lignées de cellules tumorales PDA pour l'injection
- Croissance KPC-dérivé de la lignée cellulaire PDA dans les cellules tumorales (TC) médias: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 2mM L-glutamine et 83 g/mL gentamicin.
- Permettre aux cellules de croître jusqu'à 80-85% de confluence dans les flacons maintenus à 37oC et 5% co2.
- Une fois que les cellules atteignent la confluence idéale, décanter le support des flacons et laver deux fois avec chaud (37 oC), saline stérile tamponnée par le phosphate (PBS), assez pour couvrir la monocouche des cellules adhérentes. Pipette de PBS restant après lavage final.
- Ajouter une solution chaude (37 oC) de 0,05 % trypsine-EDTA (0,5 % de stock trypsine-EDTA dilué1:10 dans le tampon de dissociation cellulaire sans enzymes à base d'enzymes de Hanks) pour couvrir la monocouche dans chaque flacon et incuber à 37 oC pendant 3 à 5 minutes ou jusqu'à ce que les cellules se détachent avec le tapage sur les côtés de la Fiole.
- Ajouter 10-25mL de froid (4 oC), un média TC stérile dans chaque flacon pour arrêter la réaction de trypsinisation. Verser la suspension cellulaire dans un conique de 50 ml, remplir à 50 ml avec des supports TC froids.
- Centrifugeuse à 300g pendant 5 minutes à 4oC. Jeter le supernatant et resuspendre les granulés dans le DMEM froid et stérile (sans sérum). Si plusieurs tubes coniques ont été utilisés pour recueillir des cellules, tous les granulés peuvent être combinés à un seul conique à cette étape.
- Centrifugeuse à 300g pendant 5 minutes à 4 degrés.
- Répétez les étapes 1.6-1.7 deux fois. En dernier lavage, prendre un aliquot de cellules pour le comptage. La viabilité cellulaire de 90 % est recommandée pour les injections in vivo.
- Préparer une suspension uniforme des cellules tumorales PDA à la concentration désirée des cellules tumorales. Nous avons utilisé 10-20 x 106 cellules/mL (250 000 à 500 000 cellules/25 l) dans la quantité appropriée de DMEM ou de PBS stériles et froids, mais chaque lignée cellulaire doit être titrée in vivo.
- Garder les cellules froides, sur la glace, jusqu'au moment de l'injection.
2. Préparation préchirurgicale des souris
REMARQUE : Cette étape est recommandée pour être effectuée 24 heures avant la procédure.
- Placez des cages contenant des souris expérimentales sur un ensemble plus chaud à 37 oC.
- Obtenir de nouvelles cages propres et les placer sur une deuxième plate-forme chauffante fixée à 37 oC.
- Nettoyez soigneusement l'armoire de sécurité biologique, la chambre d'induction et l'étape de l'échographie (US) avec un stérilisme (voir Tableau des matériaux).
- Transformez la fonction de réchauffement de la scène américaine à 37oC.
- Allumez la machine d'anesthésie : ajustez les cadrans sur le séparateur de tube de sorte que le flux d'air soit limité à la chambre d'induction seulement. Allumez le réservoir d'oxygène et fixez le débit à 1 L/min. Allumez le vaporisateur d'isoflurane à 2-3%.
- Placer une seule souris dans la chambre d'induction. Surveillez la souris jusqu'à ce qu'elle ne soit plus mobile et que la respiration ne ralentisse plus.
- Ajustez les cadrans sur le séparateur de sorte que le flux d'air soit autorisé à la fois à la chambre d'induction et au cône de nez. Déplacez rapidement la souris de la chambre d'induction et déposez-la en recumbency ventral sur la scène chaude des États-Unis avec son museau dans le cône de nez.
- Testez le niveau d'induction en observant toute réponse réflexive au pincement des orteils. S'il n'y en a pas, la souris est prête pour l'épilation.
- Placez une petite quantité de lubrifiant pour les yeux (voir Tableau des matériaux)sur les deux yeux pour prévenir la déshydratation des tissus. Tournez la souris de sorte qu'elle se trouve dans la tubency dorsal sur la scène. Adhérer doucement les extrémités supérieures et inférieures à la scène avec du ruban adhésif afin de maximiser l'exposition de l'abdomen et fixer la souris à l'étape.
- Utilisez un applicateur stérile à pointe de coton pour appliquer une généreuse couche de crème dépilatoire sur le quadrant supérieur gauche de l'abdomen. L'application de l'application de l'application de l'application de la rate et s'étendre vers la ligne médiane. Laisser reposer environ une minute.
- Testez le degré d'épilation en utilisant doucement l'extrémité opposée de l'applicateur de pointe de coton pour essuyer la crème dépilatoire, une fois qu'elle enlève facilement, essuyez l'abdomen propre avec un tampon de gaze sèche. Ensuite mouiller une couche propre de gaze avec une petite quantité de salin chaud et essuyer la zone une fois de plus pour enlever complètement l'agent dépilatoire. Ne dépassez pas 2 minutes complètes de contact direct sur la peau de la souris afin de réduire le risque de brûlures chimiques.
- Une fois que les cheveux ont été suffisamment enlevés de l'abdomen, retourner la souris à une nouvelle cage propre sur le chauffe-eau.
- Alors que le premier animal est en cours d'épilation sur la scène américaine, le prochain animal peut être ajouté à la chambre d'induction.
- Avant d'anesthésier la cage suivante de souris, éteignez l'isoflurane et rincer la chambre d'induction avec de l'oxygène. Nettoyer la chambre d'induction et le cône scène/nez des États-Unis avec du stérilisme. Répétez les étapes 2.5-2.14 jusqu'à ce que toutes les cages et les souris aient subi l'épilation.
REMARQUE : Le jeûne des animaux par retrait temporaire des aliments pendant une période précédant l'implantation peut être considéré comme minimisant l'obstruction visuelle des organes abdominaux due à des aliments non digérés dans l'estomac et les intestins (12-24 heures). La restriction d'eau n'est pas recommandée. Si les animaux sont jeûnés, il est recommandé qu'ils soient traités avec une injection de 1mL chaud (37oC), saline stérile après injection tumorale afin de prévenir la déshydratation.
3. Implantation ultrason-guidée des cellules PDA
REMARQUE : Toutes les procédures d'échographie sont effectuées à l'aide d'un appareil d'imagerie par ultrasons et d'un logiciel (voir tableau des matériaux). Le transducteur a une fréquence centrale de 40 MHz et une bande passante de 22-55 MHz.
- Ajustez la plate-forme à ultrasons de telle sorte que la surface de la plate-forme soit parallèle au sol et que l'enquêteur fasse face au côté gauche de l'animal, la tête de l'animal vers la droite. Ajuster la position du transducteur afin d'obtenir une image abdominale transversale (Figure 1A).
- Anesthésiez la souris à injecter comme décrit dans les étapes 2.1-2.8. Stabiliser la souris sur la plate-forme américaine comme décrit à l'étape 2.9.
- Appliquer une généreuse quantité de gel à ultrasons chaud (37 oC) sur la section glaçante de l'abdomen.
- Abaissez doucement le transducteur pour entrer en contact avec l'abdomen de la souris. Ajustez le transducteur au besoin jusqu'à ce que le pancréas soit clairement visible. Localiser le rein gauche et la rate afin de fournir une orientation précise de la cavité abdominale.
REMARQUE : Étant donné que la position du transducteur a été modifiée pour permettre l'accès au côté gauche de l'abdomen, l'axe X et Y sur les commandes de scène est maintenant inversé. - Chargez une seringue à insuline de 29 G x 1/2 po (voir Tableau des matériaux)avec une suspension de 25 oL de cellules tumorales. Essuyez la pointe de l'aiguille avec un tampon stérile de préparation à l'alcool avant l'injection afin de minimiser l'ensemencement des cellules tumorales dans la paroi abdominale.
- À l'aide de forceps émoussés, saisissez la peau et la paroi péritonéale pour augmenter la tension au site d'injection désiré. Tenir la seringue à un angle d'environ 25 à 45 degrés par rapport à la surface de la plate-forme à ultrasons, faire avancer lentement l'aiguille à travers la peau et la paroi péritonéale. Confirmer que l'aiguille a perforé à travers le mur péritonéal avant de passer à l'étape suivante. Une petite boisson gazeuse doit être ressentie lorsque l'aiguille perce le mur péritonéal.
- Lors de la visualisation par ultrasons, guidez l'aiguille directement dans le pancréas(figure 1B-C). Confirmer l'aiguille est dans le tissu du pancréas en déplaçant doucement le baril de seringue de haut en bas. Si le placement est correct, la pointe de l'aiguille restera dans le tissu du pancréas pendant que le baril de seringue se déplace.
- Injecter lentement les cellules tumorales et confirmer que les cellules sont implantées à l'endroit désiré par la formation d'un bolus liquide dans le pancréas (visible sur l'écran à ultrasons, Figure 1D).
REMARQUE: Une certaine résistance doit être ressentie tout en déprimant piston. Veillez à ne pas percer le pancréas plusieurs fois car cela augmente la probabilité de fuite dans la cavité abdominale. - Une fois que le volume complet de suspension a été injecté et un bolus liquide peut être vu dans le pancréas, garder l'aiguille très immobile pendant plusieurs secondes. Retirez lentement l'aiguille de l'abdomen de la souris, en prenant grand soin de ne pas déranger les cellules injectées.
- Placez la souris dans une cage propre et chaude et assurez-vous que la souris récupère complètement de l'anesthésie. Répétez ce processus pour tous les animaux.
- Avant d'anesthésier la souris suivante, nettoyez la chambre d'induction et le cône scène/nez des États-Unis avec du stérilisateur.
- Répétez les étapes 3.2-3.11 jusqu'à ce que toutes les souris aient été injectées.
Representative Results
L'objectif de ce rapport était de fournir un protocole détaillé pour effectuer l'implantation ultrason-guidée des lignées cellulaires KPC-dérivées de PDA. Dans les expériences représentatives montrées dans la figure 2-4,nous confirmons que les tumeurs UG-OTIM se développent à un taux cohérent et d'une manière dose-dépendante. En outre, nous montrons que les tumeurs d'UG-OTIM récapitulent les dispositifs immunologiques et histologiques saillants du TME de KPC. Ainsi, le système UG-OTIM est un modèle préclinique de souris PDA qui peut être utilisé d'une manière à haut débit pour filtrer rapidement de nouvelles combinaisons de traitement in vivo.
En utilisant le protocole UG-OTIM décrit ici, les souris ont été préparées pour l'implantation, fixées à la plate-forme d'ultrason chauffée et les positions de la plate-forme et du transducteur ont été ajustées pour cette procédure comme indiqué dans la figure 1A. L'imagerie par ultrasons à haute résolution a été utilisée pour identifier un site d'injection dans le pancréas de la souris qui pourrait être ciblé sans perforation du rein ou de la rate (figure 1B). Sous la visualisation ultrasonographique, l'aiguille a été soigneusement introduite à la cavité abdominale par la paroi péritonéale et guidée dans le pancréas de souris (figure 1C). Après le placement correct de l'aiguille a été établi, la suspension de cellules de tumeur a été injectée très lentement dans le pancréas. Une implantation réussie a été confirmée par la présence d'une bulle dans le pancréas (Figure 1D). Dans les premières expériences, la souris a été sacrifiée, et l'efficacité de la procédure a été vérifiée en visualisant directement un bolus liquide dans le tissu du pancréas brut (Figure 1E).
L'implantation et le taux de croissance de tumeur ont été surveillés par la formation image hebdomadaire d'ultrason. Les implantations réussies ont produit des tumeurs qui ont été contenues dans les frontières du pancréas tout au long du temps de l'expérience (Figure 2A). Le logiciel d'échographie (voir tableau des matériaux)utilisé a permis de déterminer la zone tumorale et le volume pour chaque point de temps ainsi que pour la cartographie 3D des tumeurs mesurées à générer (Figure 2B), et les images 3D ont été confirmées au moment de l'autopsie de la souris (Figure 2C). Une injection cellulaire inadéquate pendant la procédure UG-OTIM peut entraîner le développement d'une tumeur paroi péritonéale (dont une image représentative est montrée dans la figure 2D). Les souris qui se présentent avec des tumeurs péritonéales peuvent être exclues d'autres études.
Pour déterminer la concentration optimale des cellules pour une utilisation optimale dans les études précliniques, une lignée cellulaire De PDA dérivée du C57Bl/6 KPC (4662)9 a été injectée à des souris c57Bl/6 de type sauvage naïves dans le le cas de six expériences indépendantes. Cette ligne cellulaire (passée in vitro six fois) a été dérivée d'une souris entièrement rétrocroisée KPC tumeur-portante de souris (-gt;10 générations, confirmée par SNP-analyse19) pour empêcher l'histocompatibilité moléculaire complexe antigènes de rejet de tumeur. Les cellules tumorales ont été injectées à un faible titer (1,25 x 106 cellules/25 l) et à une dose de titer élevé (5 x 106 cellules/25 l). Les injections de tumeur de plus haut de titer ont eu comme conséquence une plus grande proportion d'animaux tumeur-portants trois semaines après des injections comparées à la cohorte basse de titer (figure 3A). Malgré le retard dans le début de tumeur, le taux global de croissance de tumeur n'était pas sensiblement différent entre les deux doses (figure 3B). De même, même si le taux de survie entre les deux cohortes n'était pas significativement différent, les données tendent vers une survie légèrement améliorée dans la cohorte de faible teneur en titer(figure 3C). La cohorte de haute teneur en titer a également produit une plus grande proportion de souris avec des tumeurs qui étaient inscrites dans des études précliniques (désignées à un volume de tumeur de 20 mm3) par quatre semaines après l'injection que la cohorte de faible teneur en titer (Figure 3D). La majorité des souris des cohortes de haute et de basse titer se sont présentées avec des tumeurs enchâssées par jour 25 et ont développé des symptômes de la maladie de phase finale comprenant des ascites (données non montrées). Les métastases, qui ne se produisent pas en utilisant 4662 aux doses cellulaires de ce protocole, peuvent être modélisées avec différentes lignées cellulaires ou doses33.
La méthode UG-OTIM nécessitait une maîtrise de la motricité fine pour localiser avec précision le site d'injection souhaité, ce qui était difficile dans nos premières expériences. Pour cette raison, nous avons inclus un tableau illustrant le nombre d'animaux qui ont développé des tumeurs dans le pancréas (implantations réussies) par rapport au nombre total d'animaux qui ont subi l'implantation de tumeur ultrason-guidée (tableau 1). Les animaux ont été éliminés des analyses futures si les tumeurs se sont développées dans un endroit indésirable (c.-à-d., rein) ou s'il n'y avait aucune évidence de tumeur par six semaines après injection, comme indiqué. La progression hebdomadaire de la proportion de souris portant des tumeurs pancréatiques inscrites (volume tumoral de 20 mm3) de chaque expérience est également montrée dans le tableau 1.
Pour déterminer s'il y avait un avantage à utiliser l'approche UG-OTIM plutôt que le modèle orthotopic chirurgical traditionnel (au-delà de l'investissement de temps après avoir gagné la compétence à la technique), nous avons comparé l'ensemencement des tumeurs de PDA dans la paroi péritonéale des souris après chaque procédure. Nous avons constaté que seulement 2/31 souris (6,5%) a développé des tumeurs involontaires de la paroi péritonéale après les injections UG-OTIM, par rapport à 7/15 souris qui ont développé des tumeurs péritonéales après injection chirurgicale (46,6%, p 'lt; 0.0029) (tableau 1). Ainsi, le taux d'ensemencement des tumeurs supplémentaires dans le péritoine est considérablement réduit dans la méthode UG-OTIM par rapport à l'implantation chirurgicale.
Sur le sacrifice des souris portant des tumeurs UG-OTIM, nous avons constaté que l'anatomie brute des tumeurs était semblable aux tumeurs spontanées de KPC (figure 4A). L'analyse histologique a démontré un modèle des structures canalaires anormales qui était semblable dans les deux modèles et qui a récapitulé la morphologie de la maladie humaine (figure 4B). Pour étudier l'infiltration immunitaire dans les tumeurs KPC et UG-OTIM, des échantillons histologiques représentatifs ont été tachés pour CD3 (exprimé par les cellules T) et F4/80 (exprimé par les macrophages). Dans les deux modèles, les modèles de coloration ont révélé des tumeurs qui ont été mal infiltrées par les lymphocytes T (Figure 4C), mais très infiltrées par les macrophages (Figure 4D). Cette conclusion est compatible avec le phénotype immunologiquement froid de la plupart des échantillons humains et KPC PDA5,7,12.
Figure 1 : Implantation ultrason-guidée des cellules de PDA dans le pancréas murine. (A) Orientation de la souris, stade d'ultrason, et sonde d'ultrason employée pour obtenir une image à haute résolution des organes abdominaux. Notez que la scène et la plate-forme ont été tournés à 90 degrés de l'orientation standard pour permettre un accès facile au quadrant supérieur gauche de l'abdomen de la souris. (B) Image ultrasonographique représentant l'identification des reins, de la rate et du pancréas. Ici, l'aiguille d'injection est positionnée contre l'abdomen de la souris. (C) Image ultrasonographique représentant l'aiguille dans le pancréas de souris. (D) Image ultrasonographique représentant la bulle au site d'injection (décrite en bleu) suivant l'injection contrôlée des cellules de tumeur dans le pancréas. (E) Laparotomie révélant le bolus liquide contenant des cellules PDA dans le pancréas après injection guidée par ultrasons. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Surveillance de la croissance tumorale après l'injection UG-OTIM. (A) Image ultrasonographique représentative de la tumeur UG-OTIM (décrite en bleu) à 2, 3 et 5 semaines après l'injection, comme indiqué. (B) Représentant a reconstruit l'image 3D de la tumeur d'UG-OTIM 5 semaines après l'injection utilisant le logiciel d'ultrason. (C) Anatomie brute représentative de la tumeur UG-OTIM 5 semaines après l'injection sur l'autopsie de souris. (D) Image ultrasonographic représentative d'une tumeur péritonéale de mur se développant dans la couche sous-cutanée après injection incorrecte de cellules à 7 semaines après injection. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Onset dose-dépendant des tumeurs enrollables suivant l'injection guidée d'ultrason des cellules de PDA. (A) Proportion de souris tumorales aux points indiqués après l'injection, telles que décrites dans la figure 1 avec un titre élevé (500 000 cellules/25 l) ou un taquet faible (125 000 cellules/25 l), comme indiqué. (B) Cinétique de croissance tumorale des souris de (A), chaque symbole représente un groupe de souris, les barres d'erreur indiquent SEM. (C) Proportion de souris de (A) vivant aux points de temps indiqués après injection. Les souris ont été euthanasiées ou censurées si les tumeurs étaient 'gt;1000mm3 ou l'état du corps était pauvre en raison des comorbidités tumorales. (D) Temps d'enrôlement de tumeur d'entonnement pour des souris de (A). Les tumeurs enroulables sont considérées comme étant de 20 mm3 en volume. Représentant de données de 4 expériences indépendantes avec des souris/expériences n-8-20. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Expérience | Pancreas-tumor portant/injections totales | Semaine 1 (Enrollable) | Semaine 2 (Enrollable) | Semaine 3 (Enrollable) | Semaine 4 (Enrollable) | Tumeurs péritonéales ensedues |
| Marée haute | 24/31 | Nd | 8/24 (3/24) | 15/24 (7/24) | 23/23 (20/23) | 2/20 |
| Faible titer | 11/17 | Nd | 3/11 (0/11) | 6/11 (3/11) | 9/11 (5/11) | 0/11 |
| Injection chirurgicale | 15/17 | Nd | Nd | 15/15 (9/15) | 15/15 (14/15) | 7/15 |
Tableau 1 : Nombre de tumeurs UG-OTIM réussies par rapport à l'implantation chirurgicale. Données combinées à partir de 2-4 expériences indépendantes par état de titer élevé ou faible avec des souris n-5-10 par expérience. « L'injection chirurgicale » indique des souris qui ont reçu l'injection chirurgicale laparoscopic abdominale de 125.000 cellules de tumeur. Le « porteur de tumeur » indique des souris avec une tumeur pancréatique. "Enrollable" indique la proportion de souris tumorales à chaque moment avec un volume de tumeur 'gt;20mm3. Les « tumeurs péritonéales ensemencées » indiquent la proportion totale de souris tumorales qui ont eu l'ensemencement concomitant des tumeurs sur la paroi péritonéale de l'injection de cellules tumorales. Les souris présentant des tumeurs présentant incorrectement dans les tissus autres que le pancréas (c.-à-d., rein) ont été exclues des populations « tumeur-portantes » (mais incluses dans les souris injectées totales). ND, pas déterminé. Fréquence de l'ensemencement péritonéal comparant les groupes de titer haut et bas combinés par rapport à l'implantation chirurgicale, p 'lt; 0.0029 par l'intermédiaire du test T à 2 queues avec Mann-Whitney post-test.
Figure 4 : Les tumeurs d'UG-OTIM récapitulent le microenvironnement de tumeur de KPC. Des images représentatives sont affichées. En première rangée, tumeurs KPC. Rangée inférieure, tumeurs ug-OTIM à 5 semaines après l'implantation. (A) Anatomie brute des tumeurs excisées sur l'autopsie. (B) H et E (10X, bar 100 m) (C) Immunohistochemistry coloration pour CD3 (brun) (10X, bar 100 m). (D) Coloration immunofluorescente de F4/80 (rouge) et DAPI (bleu) (4X, barre 500m). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
Nous montrons ici que l'utilisation de l'échographie à haute résolution pour diriger l'implantation des lignées cellulaires de PDA murine au site de tissu autochthonous est une alternative fiable aux systèmes de modèle orthotopic de KPC et chirurgicales. UG-OTIM produit des tumeurs biologiquement pertinentes qui conservent les dispositifs immunopathologiques de PDA avec un délai raccourci au diagnostic de tumeur et à la cinétique fiable de croissance de tumeur. L'injection guidée par ultrasons peut donc servir d'outil utile pour la production rapide de souris portant des tumeurs PDA orthotopiques implantées, permettant l'étude des combinaisons thérapeutiques dans un modèle cliniquement pertinent.
L'implantation guidée par ultrasons offre des améliorations importantes par rapport aux modèles standard d'investigation préclinique. Tout d'abord, cette procédure élimine la surveillance chrononutant des souris KPC pour le développement de tumeurs spontanées en implantant directement entièrement C57BL/6 cellules PDA rétrocroisées dans le pancréas murine. Deuxièmement, semblable aux injections orthotopiques chirurgicales traditionnelles, l'approche UG-OTIM permet le contrôle sur la ligne cellulaire injectée, y compris la sélection d'une ligne cellulaire monoclonale et/ou la manipulation ex vivo de la lignée cellulaire, ainsi que le contrôle sur l'hôte recevant l'implantation de cellules tumorales. Troisièmement, cette technique mini-invasive évite le travail ardu de la chirurgie de survie et contourne la période de récupération postopératoire compliquée pour les animaux ainsi que les signaux inflammatoires de la cicatrisation chirurgicale des plaies. Enfin, les tumeurs UG-OTIM - semblables à l'implantation chirurgicale - récapitulent le TME observé chez les souris de KPC, y compris l'infiltration basse de cellule T et l'infiltration élevée de macrophage. Ainsi, le modèle UG-OTIM conserve les dispositifs principaux des tumeurs de KPC sans les complications additionnelles qui retardent des investigations thérapeutiques dans le modèle spontané de KPC.
Un certain nombre d'étapes critiques dans le protocole sont la clé pour maîtriser le succès de la technique. L'expertise dans l'imagerie par ultrasons murine est essentielle pour cette procédure, mais la dextérité manuelle requise pour implanter avec succès les cellules dans le pancréas est un ensemble de compétences qui doivent être développés indépendamment. Pour les souris sur un cycle de lumière/obscurité de 12 heures, le jeûne des animaux pendant la nuit a assuré que l'estomac et les intestins étaient dégagés de n'importe quel aliment non digéré qui pourrait bloquer la vue du pancréas, du rein et de la rate par ultrasons. En outre, chaque lignée cellulaire utilisée pour l'injection orthotopique doit être titrée avant d'autres expériences pour comprendre la cinétique de croissance et de déterminer le potentiel métastatique33. Pendant l'injection, l'utilisation de forceps pour pincer la peau au site d'injection a créé la tension nécessaire pour perforer doucement par la peau et la paroi péritonéale. Une étape clé dans la procédure a été de guider soigneusement l'aiguille dans le pancréas sans perforer le tissu ou perforer un site hors cible comme la rate ou le rein. La confirmation d'un bolus liquide était le meilleur indicateur de l'injection réussie de cellules de tumeur dans le tissu approprié. Après l'injection, l'aiguille doit être retirée lentement afin de ne pas déranger le bolus liquide. Nous avons constaté qu'une série d'injections d'essai utilisant DMEM ou Trypan Blue a aidé à développer une maîtrise de la motricité fine nécessaire pour cette injection.
Au cours du dépannage de cette procédure, nous avons identifié un certain nombre de facteurs qui ont eu une incidence sur le succès du protocole. Dans les expériences d'essai, notre erreur la plus fréquente était perforation du rein pendant l'implantation, qui s'est produite plus fréquemment dans nos premières expériences suggérant que l'exercice régulier de cette compétence améliore la compétence. En outre, nous avons constaté que la confirmation de la présence d'un bolus liquide après injection de cellules tumorales par ultrasons et visualisation directe à l'autopsie pendant la phase de dépannage a amélioré la technique d'injection réussie. Si la formation d'une bulle n'est pas confirmée par échographie pendant l'injection, l'emplacement de l'aiguille peut être ajusté avant de déprimer complètement la seringue pour libérer le bolus restant des cellules tumorales. Nous avons également observé que les volumes de suspension injectés trop rapidement ont eu comme conséquence le déversement des cellules de tumeur dans la cavité péritonéale ou l'effondrement du bolus liquide dans le pancréas. Généralement, ces animaux ont continué à développer des tumeurs pancréatiques à l'exception des animaux n -7 qui n'ont montré aucune évidence de tumeur 4 semaines après injection. Ce résultat a été rapporté seulement dans nos premières tentatives (et 6/7 animaux ont été injectés avec un tigre bas des cellules de tumeur). Les souris qui ont des injections douteuses de cellules tumorales, ou nécessitant le repositionnement de l'aiguille, devraient être étroitement surveillées pour le développement des tumeurs en dehors du pancréas.
Les principales limites de la méthode guidée par ultrasons sont la disponibilité des instruments requis et la compétence technique associée à l'implantation tumorale. La procédure n'est pas complètement stérile, car la souris est injectée non stérilement sur la plate-forme d'ultrason, avec la seringue et la pointe d'aiguille passant par le gel d'ultrason. Bien que nous n'ayons vu aucune preuve d'infection chez les souris n'148 à travers un total de 8 expériences indépendantes depuis le lancement de ces études, il est possible qu'un agent infectieux pourrait entrer dans le pancréas par l'aiguille d'injection au cours de ce processus. Par conséquent, autant d'aspects du protocole que possible (y compris les gants, les surfaces d'ultrason, les boîtes à glace) devraient être pulvérisés avec du désinfectant ou de l'éthanol à 70 % afin de réduire l'exposition potentielle aux agents pathogènes. Une limitation supplémentaire du protocole actuel était l'absence de métastes utilisant la lignée cellulaire 4662 aux dilutions actuelles. Chaque lignée cellulaire utilisée dans le système UG-OTIM doit être titrée pour les taux de croissance souhaités ainsi que le potentiel métastatique33. Enfin, notre protocole actuel a établi des techniques pour injecter des cellules tumorales dans une suspension unicellulaire. Cependant, l'ajout d'un substrat de matrice extracellulaire pourrait être ajouté pour potentiellement améliorer l'établissement de tumeur et empêcher la fuite de cellules de tumeur (comme il est employé dans les modèles chirurgicaux d'implantation27,30,31,32). Ainsi, beaucoup des limitations de UG-OTIM peuvent être surmontées avec l'essai approprié des lignées cellulaires utilisées dans les injections orthotopic.
En résumé, le modèle UG-OTIM est une méthode précise d'injection dirigée par les tissus des cellules tumorales dans le pancréas murine. Cette technique d'implantation mini-invasive profite à la fois à l'investigateur et aux animaux en réduisant le temps de procédure, en minimisant les complications post-chirurgicales et en améliorant la précision de l'injection. Les tumeurs résultant des injections d'UG-OTIM conservent les dispositifs immunobiologiques caractéristiques des tumeurs spontanées de KPC, ont le temps fiable au démarrage de tumeur, et la cinétique reproductible de croissance de tumeur. Ainsi, le modèle UG-OTIM peut être utilisé d'une manière relativement à haut débit pour interroger les combinaisons thérapeutiques dans un cadre préclinique afin de révéler de nouveaux traitements pour les patients ayant les plus grands besoins cliniques non satisfaits.
Disclosures
Les auteurs n'ont pas de divulgations.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Robert Vonderheide et tous les membres du laboratoire Vonderheide, tous membres du Pancreatic Cancer Mouse Hospital, le Dr Ben Stanger, le Centre de recherche sur le cancer du pancréas de l'Université de Pennsylvanie et Devora Delman discussions utiles. Ce travail est soutenu par le financement du Parker Institute for Cancer Immunotherapy Fellow Award (KTB) et du Pancréatique Cancer Research Center de l'Université de Pennsylvanie (CC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Conicals | Thomas Scientific | 2602A26 | |
| Blunt edged forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Cell Dissociation Buffer | Thermo-Fisher | 13151014 | |
| Cotton Tipped swabs | Thermo-Fisher | 19062614 | |
| Covidien Monoject 3/10mL, 29G X 1/2" | Thermo-Fisher | 8881600145 | |
| Depilatory Agent | Amazon | Nair Body Lotion | |
| DMEM | Thermo-Fisher | 10-566-016 | |
| FBS | Gemini Bio-oroducts | 100-106 | |
| Flask | Sigma-Aldrich | CLS430825 | |
| Forceps (blunt edge) | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Gauze | Fisher | 13-761-52 | |
| Gentamicin | Thermo-Fisher | 15750060 | |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Isofluorane | Penn Vet Supply | VED1350 | |
| Isofluorane Vaporizer | VetEquip | 911103 | |
| L-glutamine | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Optixcare | MidWest Veterinary Supply | 052.50310.3 | |
| Paper Tape | Medline | MMM1530Z5 | |
| PBS | Thermo-Fisher | 14-190-250 | |
| Slide warmer | C&A Scientific | XH-2001 | |
| Sterilant (Clidox-S) | Fisher Scientific | NC0332382 (activator) NC9189926 (base) | Needs to be combined according to manufacturer's instructions |
| Sterile Alcohol prep pad | Covidien | 6818 | |
| Trypsin | Thermo-Fisher | 15090046 | |
| Ultrasound gel | Thermo-Fisher | 03-34-1LT | |
| Visualsonics Ultrasound Vevo 2100 | Visual Sonics | Vevo 2100 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Chao, T., Furth, E. E., Vonderheide, R. H. CXCR2-Dependent Accumulation of Tumor-Associated Neutrophils Regulates T-cell Immunity in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Immunology Research. 4 (11), 968-982 (2016).
- Steele, C. W., et al. CXCR2 Inhibition Profoundly Suppresses Metastases and Augments Immunotherapy in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. 29 (6), 832-845 (2016).
- Li, J., et al. Tumor Cell-Intrinsic Factors Underlie Heterogeneity of Immune Cell Infiltration and Response to Immunotherapy. Immunity. 49 (1), 178-193 (2018).
- Beatty, G. L., et al. Exclusion of T Cells From Pancreatic Carcinomas in Mice Is Regulated by Ly6C(low) F4/80(+) Extratumoral Macrophages. Gastroenterology. 149 (1), 201-210 (2015).
- Bayne, L. J., et al. Tumor-derived granulocyte-macrophage colony-stimulating factor regulates myeloid inflammation and T cell immunity in pancreatic cancer. Cancer Cell. 21 (6), 822-835 (2012).
- Beatty, G. L., et al. CD40 agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreatic carcinoma in mice and humans. Science. 331 (6024), 1612-1616 (2011).
- Lo, A., et al. Tumor-Promoting Desmoplasia Is Disrupted by Depleting FAP-Expressing Stromal Cells. Cancer Research. 75 (14), 2800-2810 (2015).
- Rhim, A. D., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 25 (6), 735-747 (2014).
- Ozdemir, B. C., et al. Depletion of Carcinoma-Associated Fibroblasts and Fibrosis Induces Immunosuppression and Accelerates Pancreas Cancer with Reduced Survival. Cancer Cell. 28 (6), 831-833 (2015).
- Clark, C. E., et al. Dynamics of the immune reaction to pancreatic cancer from inception to invasion. Cancer Research. 67 (19), 9518-9527 (2007).
- Stromnes, I. M., Hulbert, A., Pierce, R. H., Greenberg, P. D., Hingorani, S. R. T-cell Localization, Activation, and Clonal Expansion in Human Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Immunology Research. 5 (11), 978-991 (2017).
- Morrison, A. H., Byrne, K. T., Vonderheide, R. H. Immunotherapy and Prevention of Pancreatic Cancer. Trends in Cancer. 4 (6), 418-428 (2018).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
- Yip-Schneider, M. T., et al. Dimethylaminoparthenolide and gemcitabine: a survival study using a genetically engineered mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 13, 194 (2013).
- Frese, K. K., et al. Nab-Paclitaxel potentiates gemcitabine activity by reducing cytidine deaminase levels in a mouse model of pancreatic cancer. Cancer Discovery. 2 (3), 260-269 (2012).
- Stromnes, I. M., et al. T Cells Engineered against a Native Antigen Can Surmount Immunologic and Physical Barriers to Treat Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. 28 (5), 638-652 (2015).
- Byrne, K. T., Vonderheide, R. H. CD40 Stimulation Obviates Innate Sensors and Drives T Cell Immunity in Cancer. Cell Reports. 15 (12), 2719-2732 (2016).
- Winograd, R., et al. Induction of T-cell Immunity Overcomes Complete Resistance to PD-1 and CTLA-4 Blockade and Improves Survival in Pancreatic Carcinoma. Cancer Immunology Research. 3 (4), 399-411 (2015).
- Keenan, B. P., et al. A Listeria vaccine and depletion of T-regulatory cells activate immunity against early stage pancreatic intraepithelial neoplasms and prolong survival of mice. Gastroenterology. 146 (7), 1784-1794 (2014).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
- Maddipati, R., Stanger, B. Z. Pancreatic Cancer Metastases Harbor Evidence of Polyclonality. Cancer Discovery. 5 (10), 1086-1097 (2015).
- Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. The evolving relationship of wound healing and tumor stroma. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (18), (2018).
- Kasper, M., et al. Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (10), (2010).
- Stuelten, C. H., et al. Acute Wounds Accelerate Tumorigenesis by a T Cell-Dependent Mechanism. Cancer Research. 68 (18), (2008).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods of Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Moreno, J. A., Sanchez, A., Hoffman, R. M., Nur, S., Lambros, M. P. Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models and Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Huynh, A. S., et al. Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound-guided injection of cells. Public Library of Science One. 6 (5), e20330 (2011).
- Thomas, T. T., et al. Utilization of Ultrasound-guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Jager, W., et al. Minimally invasive establishment of murine orthotopic bladder xenografts. Journal of Visualized Experiments. (84), e51123 (2014).
- Aiello, N. M., Rhim, A. D., Stanger, B. Z. Orthotopic injection of pancreatic cancer cells. , Cold Spring Harbor Protocols. (2016).
