Summary
우리는 모린 유래 췌장 선암 세포주를 직접 네이티브 종양 부위로 유도하는 초음파 유도 이식프로토콜을 설명합니다. 이 접근법은 주사 후 2-4주 이내에 초음파 스캐닝에 의해 검출가능한 췌장 종양을 초래하고, 외과 정형외과 이식에 비해 각막벽에 종양 세포 파종을 현저히 감소시켰다.
Abstract
흑색종과 폐 선암에 있는 면역 체크포인트 봉쇄의 최근 성공은 면역 종양학의 필드를 아연 도금하고 환자의 대다수가 면역 요법에 반응하지 않기 때문에 현재 처리의 한계를 밝혔습니다. 신규하고 효과적인 치료 조합을 신속하게 식별하기 위한 정확한 전임상 모델의 개발은 이러한 충족되지 않은 임상 적 필요를 해결하는 데 매우 중요합니다. 췌장 덕트 선암 (PDA)은 면역 요법에 반응하는 환자의 단지 2%를 가진 면역 체크포인트 봉쇄 저항하는 종양의 정식 보기입니다. 유전자 조작 크라스G12D +/-; TRP53R172H +/-; PDA의 Pdx-1 Cre (KPC) 마우스 모델은 인간 질병을 재량화하고 전임상 환경에서 내성 면역 요법에 대한 치료를 평가하기위한 귀중한 도구이지만 종양 발병 시간은 매우 가변적입니다. PDA의 외과 정형외과 종양 이식 모델은 KPC 조직 특이적 종양 미세환경(TME)의 면역생물학적 특징을 유지하지만 시간 집약적인 시술이 필요하고 비정상적인 염증을 도입한다. 여기에서, 우리는 마우스 췌장에 직접 KPC 유래 PDA 세포주를 주입하기 위하여 초음파 유도한 정형외 종양 이식 모형 (UG-OTIM)를 이용합니다. UG-OTIM 종양은 내인성 조직 부위에서 성장하고, PDA TME의 조직학적 특징을 충실하게 재인증하고, 복막 벽에 최소한의 파종으로 주사 후 4주까지 전임상 연구를 위한 등록 크기의 종양에 도달한다. 여기서 설명된 UG-OTIM 시스템은 뮤린 PDA TME에서 신규한 치료 조합의 높은 처리량 분석을 허용할 수 있는 신속하고 재현 가능한 종양 모델이다.
Introduction
췌장 덕트 선암 (PDA)은 현재 치료에 내화되는 악명 높은 공격적인 질병으로, 5 년 생존율이 9 %1입니다. PDA는 최근 유방암을 능가하여 미국에서 암 관련 사망률의 세 번째 주요 원인이 되었으며 2030 년20 2 년까지 두 번째 주요 원인 (폐암 뒤에)이 될 것으로 예상됩니다. 면역학적으로 '감기' PDA 종양 미세환경(TME)의 특징은 면역억제골수성 세포 집단의 높은 침윤을 포함하여3,4,5,6,7,조밀한 기질 증착8,9,10,11,및 T 세포의흙을 포함5,12,13-에기여한다. PDA14에서면역 요법의 실패 . 이를 위해, 임상적으로 관련된 동물 모델의 사용은 생체 내에서면역학적으로 차가운 종양에 대한 새로운 약물 조합의 효능을 조사하기 위한 필수적인 도구이다.
유전자 조작 크라스G12D +/-; TRP53R172H +/-; PDA의 Pdx-1 Cre(KPC) 마우스 모델은 질병의 분자 드라이버 및 조직병리학적특징을포함하는 인간 PDA의 현저한 임상적 측면을 충실하게 재현한다. KPC 종양은 완전히 면역적격 마우스에서 자발적으로 개발되며, 임상 시험 환경에서 이들 약물을투여하기 전에 화학요법16,17,면역요법18,19,20,21및 기질 표적치료9,11,22를포함하는 치료 접근법의 심문을 허용한다. PDA의 전임상 모델로서의 많은 강점에도 불구하고, KPC 마우스의 사용은 종양 발병이 4~40주(따라서 큰 번식 콜로니유지를 필요로 하는) 범위까지 다양할 수 있기 때문에 자발적종양 발달의 매우 가변적인 진행에 의해불리하다.15. 부가적으로, KPC 마우스는 다형성 원발성종양(23)에대한 잠재력을 가지고 있으며, 동물 건강에 급격한 감소가 있고 질병이 진행됨에 따라 악액질 및 복수를 포함하는 병용이 증가한다15.
자발적KPC 마우스 모델에 대한 한 가지 대안은 PDA24의정형삽입 모델을 사용하는 것이다. 네이티브 조직 부위에 종양 세포주의 직접적인 외과 적 이식은 PDA의 조직 특이적 종양 미세 환경 (TME)을 회귀하는 보다 비용 효율적이고 예측 가능한 방법입니다. 종양 이식은 KPC 마우스 모형에 사육하는 데 시간이 많이 소요될 추가 적인 유전 조작을 가진 호스트 마우스를 허용하는 유전적으로 뒤로 교차한마우스에클로날 종양 세포주 주현의 주입을 허용합니다. 그러나, 췌장종양 이식은복벽(24,25,26)의봉합사 부위에 비정상적인 염증을 도입하는 노동집약적 외과적 수술을 필요로 하며, 종종 수술 후 회복시간(27,28,29)을포함한다.
설치류 전용 트랜스듀서를 사용한 초음파 이미징의 기술적 발전은 실시간으로 고해상도 이미지를 제공합니다. 복강 내 주사 바늘 운동의 초음파 이미징에 의해 유도되는 것은 수술 이식 및 관련 염증이없는 경우 직교 종양 주사의 이점을 활용하여 종양 세포를 췌장에 구체적으로 이식 할 수 있습니다. 이 접근법은, 초음파 유도 정형외과 종양 이식 모델(UG-OTIM)은 이전에 췌장암(30)의 이종이식 모델뿐만 아니라 유잉육종, 신경아세포종 및 방광암을 포함한여러 다른 암 모델에서 확립되었다.
여기에서, 우리는 뮤린 췌장에 종양 세포주 의 초음파 유도 주사를 수행하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 결과 종양이 KPC TME의 조직학 및 면역학 특징을 재량화하고 그러므로 면역 요법을 포함하여 새로운 치료 조합을 조사하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보여주고, 급속하게 이동하는 가장 유망한 처리를 제시하기 위하여 임상 시험에 진출하십시오.
Protocol
동물 프로토콜은 펜실베니아 대학의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다. 암컷 5-6주령 C57Bl/6 마우스를 구입하였다(재료 표참조) 1-3주 휴식 후 사용하였다. 대학 실험실 동물 자원은 동물 관리를 감독했다.
1. 주입을 위한 PDA 종양 세포주의 준비
- 종양 세포 (TC) 매체에서 KPC 유래 PDA 세포주를 성장: 덜베코의 변형 독수리 배지 (DMEM) 보충 10% 태아 소 혈 청 (FBS), 2mM L-글루타민 과 83 μg/mL gentamicin.
- 세포가 37 °C 및 5 % CO2에서유지 플라스크에서 80-85 % 동률로 성장할 수 있도록하십시오.
- 세포가 이상적인 합침에 도달하면 플라스크에서 미디어를 데내고 따뜻한 (37 ° C), 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 두 번 씻어 부착 세포의 단층을 덮을 만큼 충분합니다. 최종 세척 후 남은 PBS의 피펫.
- 따뜻한 추가 (37°C) 0.05% 트립신-EDTA 용액 (0.5% 주식 트립신-EDTA 희석 1:10 Hanks의 기반 효소 무료 세포 해리 버퍼) 각 플라스크에서 단층을 커버하고 3-5 분 동안 37 °C에서 배양 또는 세포가 측면에 도청으로 분리 될 때까지 플라스 크.
- 10-25mL의 차가운 (4 °C), 멸균 TC 매체를 각 플라스크에 추가하여 트립시네화 반응을 중지합니다. 셀 서스펜션을 50mL 원추형으로 붓고 차가운 TC 용지로 50mL로 채웁니다.
- 300g에서 4°C에서 5분간 원심분리기를. 차갑고 멸균된 DMEM(혈청 프리)에 상류층과 펠릿을 다시 버리십시오. 여러 원엽 튜브가 세포를 수집하는 데 사용된 경우, 모든 펠릿은 이 단계에서 단일 원엽으로 결합될 수 있다.
- 300g에서 4°에서 5분간 원심분리기를.
- 1.6-1.7단계를 두 번 반복합니다. 마지막 세척에서, 계산을위한 세포의 aliquot을. ≥90%의 세포 생존은 생체 내 주사에 권장됩니다.
- 원하는 종양 세포 농도에서 PDA 종양 세포의 균일 한 현탁액을 준비합니다. 우리는 멸균, 감기 DMEM 또는 PBS의 적당한 양에 10-20 x 106 세포/mL (250,000 에서 500,000 세포/25μL)를 사용했습니다, 그러나 각 세포주는 생체 내에서적정되어야 합니다.
- 세포를 차갑게 얼음 위에, 주입할 준비가 될 때까지 유지하십시오.
2. 마우스의 사전 수술 준비
참고: 이 단계는 절차 24시간 전에 수행하는 것이 좋습니다.
- 실험생이 들어 있는 케이지를 37°C로 따뜻한 곳에 놓습니다.
- 새롭고 깨끗한 케이지를 확보하고 37°C로 설정된 두 번째 온난화 플랫폼에 놓습니다.
- 생물학적 안전 캐비닛, 유도 챔버 및 초음파 (미국) 단계를 멸균제로 철저히 청소하십시오 (재료 표참조).
- 미국 무대의 온난화 기능을 37°C로 돌립니다.
- 마취 기계 켜기: 튜브 스플리터의 다이얼을 조정하여 공기 흐름이 유도 챔버로만 제한되도록 합니다. 산소 탱크를 켜고 유속을 1 L / min로 설정합니다.
- 유도 챔버에 하나의 마우스를 놓습니다. 더 이상 이동 및 호흡 속도가 느려질 때까지 마우스를 모니터링합니다.
- 스플리터의 다이얼을 조정하여 공기 흐름이 유도 챔버와 노즈 콘 모두에 허용되도록 합니다. 신속하게 유도 챔버에서 마우스를 이동하고 코 콘에 총구와 따뜻한 미국 무대에 복부 recumbency에 누워.
- 발가락 꼬집기에 대한 반사 반응을 관찰하여 유도 수준을 테스트합니다. 아무 것도 없는 경우 마우스를 제모할 준비가 된 것입니다.
- 조직 탈수를 방지하기 위해 소량의 눈 윤활유(재료 표참조)를 두 눈에 놓습니다. 무대에서 등지 에 누워 있도록 마우스를 켭니다. 복부의 노출을 최대화하고 무대에 마우스를 고정하기 위해 종이 테이프로 무대에 상지와 하반신을 부드럽게 부착하십시오.
- 멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 복부의 왼쪽 위 사분면에 넉넉한 층 제모 크림을 바하십시오. 제모는 비장의 일반 영역에 적용하고 중간선으로 확장해야합니다. 약 1분 동안 앉아 있게 합니다.
- 면 팁 어플리케이터의 반대쪽 끝을 부드럽게 사용하여 제모 크림을 닦아내고 쉽게 제거하면 마른 거즈 패드로 복부를 깨끗하게 닦아 내십시오. 그런 다음 소량의 따뜻한 식염수로 거즈를 깨끗하게 적시고 다시 한 번 제거제를 완전히 제거하십시오. 화학 적 화상의 가능성을 줄이기 위해 마우스 피부에 직접 접촉 2 분을 초과하지 마십시오.
- 모발이 복부에서 충분히 제거되면, 따뜻한 새에 새, 깨끗한 케이지에 마우스를 반환합니다.
- 첫 번째 동물은 미국 무대에서 제모를 거치는 동안 다음 동물을 유도 챔버에 첨가 할 수 있습니다.
- 마우스의 다음 케이지를 마취하기 전에 이소플루란을 끄고 유도 챔버를 산소로 씻어 냅니다. 유도 챔버와 미국 단계/코 콘을 멸균제로 청소합니다. 모든 케이지와 마우스가 제모를 거친 때까지 2.5-2.14단계를 반복합니다.
참고: 이식 전 기간 동안 일시적으로 식품을 금식함으로써 동물을 단식하는 것은 위장과 장의 소화되지 않은 음식으로 인한 복부 장기의 시각적 방해를 최소화하는 것으로 간주 될 수 있습니다 (12-24 시간). 물 제한은 권장되지 않습니다. 동물이 금식하는 경우, 탈수를 방지하기 위해 1mL 따뜻한 (37 ° C), 종양 주사 후 멸균 식염수의 주사로 치료하는 것이 좋습니다.
3. PDA 세포의 초음파 유도 이식
참고 : 모든 초음파 절차는 초음파 이미징 기계 및 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다 (재료 표참조). 트랜스듀서는 40MHz의 중심 주파수와 22-55MHz의 대역폭을 가합니다.
- 플랫폼 표면이 바닥과 평행하고 조사관이 동물의 머리를 오른쪽으로 향하도록 초음파 플랫폼을 조정합니다. 트랜스듀서 위치를 조정하여 횡복부 이미지를 얻을 수 있도록합니다(그림 1A).
- 단계 2.1-2.8에 기재된 바와 같이 주입되는 마우스를 마취한다. 단계 2.9에 설명된 대로 미국 플랫폼에서 마우스를 안정화한다.
- 복부의 털이없는 부분에 따뜻한 (37 ° C) 초음파 젤을 넉넉하게 바하십시오.
- 트랜스듀서를 부드럽게 내리면 마우스 복부에 닿습니다. 췌장이 명확하게 표시 될 때까지 필요에 따라 트랜스듀서를 조정합니다. 복강의 정확한 방향을 제공하기 위해 왼쪽 신장과 비장을 찾습니다.
참고: 트랜스듀서 위치가 복부의 왼쪽에 접근할 수 있도록 변경되었으므로 스테이지 컨트롤의 X축과 Y축이 반전됩니다. - 29G x 1/2" 인슐린 주사기(재료 표참조)를 종양 세포 현탁액 25μL로 적재합니다. 복벽에 종양 세포 파종을 최소화하기 위해 주입 전에 멸균 알코올 준비 패드로 바늘 팁을 닦으하십시오.
- 무딘 가장자리 집게를 사용하여, 원하는 주입 부위에 긴장을 높이기 위해 피부와 맥막 벽을 파악. 주사기를 초음파 플랫폼 표면에 약 25 ° - 45 ° 각도로 잡고 피부와 양막 벽을 통해 바늘을 천천히 진행합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 바늘이 복막벽을 뚫은 것을 확인합니다. 바늘이 막막 벽을 관통할 때 작은 팝을 느껴야합니다.
- 초음파 시각화에서 바늘을 췌장으로 직접 안내하십시오(그림 1B-C). 주사기 배럴을 위아래로 부드럽게 움직여 바늘이 췌장 조직 내에 있는지 확인합니다. 배치가 정확하다면, 주사기 배럴이 움직이는 동안 바늘 끝이 췌장 조직 내에 남아 있을 것입니다.
- 천천히 종양 세포를 주입하고 세포가 췌장 내의 유체 볼루스의 형성에 의해 원하는 위치에 이식되고 있는지 확인합니다 (초음파 스크린에 볼 수 있음, 도 1D).
참고: 플런저를 누르는 동안 약간의 저항을 느껴야 합니다. 이것은 복강으로 누설의 가능성을 증가시키기 때문에 췌장을 여러 번 관통하지 않도록주의하십시오. - 현탁액의 전체 볼륨이 주입되고 유체 볼루스가 췌장에서 볼 수 있게 되면 바늘을 몇 초 동안 매우 가만히 유지하십시오. 천천히 마우스 복부에서 바늘을 철회, 주입 된 세포를 방해하지 않도록 주의.
- 깨끗하고 따뜻한 케이지에 마우스를 놓고 마우스가 마취에서 완전히 회복되도록하십시오. 모든 동물에 대해 이 과정을 반복합니다.
- 다음 마우스를 마취하기 전에 유도 챔버와 미국 단계 /코 콘을 멸균제로 청소하십시오.
- 모든 마우스가 주입될 때까지 3.2-3.11단계를 반복합니다.
Representative Results
이 보고서의 목적은 KPC 유래 PDA 세포주들의 초음파 유도 이식을 수행하기 위한 상세한 프로토콜을 제공하는 것이었습니다. 도 2-4에도시된 대표적인 실험에서, 우리는 UG-OTIM 종양이 일관된 속도로 그리고 용량 의존적 방식으로 성장하는 것을 확인한다. 더욱이, 우리는 UG-OTIM 종양이 KPC TME의 현저한 면역학적 및 조직학적 특징을 되풀이한다는 것을 보여준다. 따라서, UG-OTIM 시스템은 생체내에서 새로운 치료 조합을 빠르게 스크리밍하기 위해 고처리량 방식으로 사용될 수 있는 전임상 PDA 마우스 모델이다.
여기에 설명된 UG-OTIM 프로토콜을 사용하여, 마우스는 이식용으로 제조되었고, 가열된 초음파 플랫폼에 고정되었고, 플랫폼 및 트랜스듀서 둘 다의 위치는 도 1A에도시된 바와 같이 이 절차에 대해 조정되었다. 고해상도 초음파 화상 진찰은 신장 또는 비장의 천공 없이 표적으로 할 수 있던 마우스 췌장 내의 주사 사이트를 확인하기 위하여 이용되었습니다(그림 1B). 초음파 시각화 하에서, 바늘은 복벽을 통해 복강에 신중하게 도입되고 마우스 췌장으로 유도되었다(도 1C). 바늘의 정확한 배치가 확립된 후, 종양 세포 현탁액을 췌장에 매우 천천히 주입했다. 성공적인 이식은 췌장 내의 기포의 존재에 의해 확인되었다(도 1D). 초기 실험에서, 마우스를 희생시키고, 총 췌장 조직에서 유체 볼루스를 직접 시각화함으로써 절차의 효능을 검증하였다(도1E).
종양 이식 및 성장 속도는 주간 초음파 이미징에 의해 모니터링되었다. 성공적인 이식은 실험 의 시간 내내 췌장의 경계 내에 포함 된 종양을 생산(그림 2A). 초음파 소프트웨어(자료표참조)는 생성된 측정된 종양의 3D 매핑뿐만 아니라 각 시점마다 종양 면적 및 부피를 결정할 수 있도록 허용하고(도2B)마우스 부검 시에 3D 영상을 확인하였다(도2C). UG-OTIM 시술 동안 부적절한 세포 주사는 후막 벽 종양의 발달을 초래할 수 있다(대표적인 이미지는 도 2D에도시되어 있다). 후막 종양으로 존재하는 마우스는 추가 연구에서 제외될 수 있다.
전임상 연구에서 사용하기에 최적 세포의 농도를 결정하기 위해, C57Bl/6 KPC 유래 PDA 세포주(4662)9를 6개의 독립적인 실험에서 순진한 야생형 C57Bl/6 마우스에 주입하였다. 이러한 세포주(시험관내 6회 통과)는 완전히 후진된 KPC 종양 베어링 마우스(>10 세대, SNP-분석19에의해 확인됨)로부터 유래되어 분자 조직적합성 복합체 미스매치 종양 거부 항원을 방지하였다. 종양 세포를 낮은 적시자(1.25 x 106 세포/25μL)와 높은 적시(5 x 106 세포/25μL) 투여량으로 주입하였다. 높은 적시성기 종양 주사는 낮은 적시 코호트에 비해 주사 후 3 주 종양 베어링 동물의 더 큰 비율을 초래했다(그림 3A). 종양 발병지연에도 불구하고, 전체 종양 성장 속도는 두 투여량 간에 유의히 다르지않았다(도 3B). 유사하게, 두 코호트 사이의 생존율은 유의하게 다르지 않았지만, 낮은 적시코호트에서 약간 개선된 생존을 향한 데이터추세(도 3C). 높은 역가 코호트는 또한 낮은 역가 코호트보다 4 주 후 주입에 의해 전임상 연구 (≥20mm3 종양 부피에서 지정)에 등록 된 종양을 가진 마우스의 더 큰 비율을 생산했다(그림 3D). 25일까지 등록 가능한 종양으로 제시된 높고 낮은 역가 코호트 둘 다에서 마우스의 대다수는 ascites를 포함하여 말기 질병 현상을 개발했습니다 (데이터는 도시되지 않음). 전이, 이 프로토콜에서 세포 투여량에서 4662를 사용하여 발생하지 않는, 다른 세포주 또는 투여량33으로모델링될 수 있다.
UG-OTIM 방법은 초기 실험에서 어려웠던 원하는 사출 부위를 정확하게 현지화하기 위해 미세 운동 기술을 숙달해야 했습니다. 이러한 이유로, 우리는 초음파 유도 종양 이식을 받은 동물의 총 수에 비해 췌장 내 종양을 개발 한 동물의 수를 묘사하는 표를 포함(표 1). 동물은 종양이 원치 않는 위치 (즉, 신장)에서 개발된 경우 또는 6 주 주입 후 종양의 증거가 없는 경우 향후 분석에서 제거되었습니다. 각 실험에서 등록 가능한 췌장 종양(≥20mm3 종양 부피)을 낳은 마우스의 주간 진행도 표 1에나타내고 있다.
전통적인 외과 정형 외과 모형 보다는 오히려 UG-OTIM 접근을 사용하는 이득이 있었다는 것을 결정하기 위하여 (기술에 능숙을 얻은 후에 시간 투자를 넘어), 우리는 각 절차 후에 마우스의 복막 벽에 있는 PDA 종양의 파종을 비교했습니다. 우리는 단지 2/31 마우스 (6.5%)를 발견했다 UG-OTIM 주사 후 의도하지 않은 상막벽 종양을 개발하였으며, 외과적 주사 후 후 막벽 종양을 개발한 7/15 마우스(46.6%, p< 0.0029)(표1). 따라서, 외과적 이식에 비해 UG-OTIM 방법에서 후부 종양을 파종하는 속도가 크게 감소된다.
UG-OTIM 종양을 베어링 하는 마우스의 희생에 따라, 우리는 종양의 총 해부학 자발적인 KPC 종양과 유사 했다 발견(그림 4A). 조직학적 분석은 두 모델 모두에서 유사하고 인간 질병의 형태를 재입증하는 비정상적인 덕트 구조의 패턴을 입증하였다(그림4B). KPC 및 UG-OTIM 종양 둘 다 내의 면역 침투를 조사하기 위해, 대표적인 조직학적 샘플은 CD3(T 세포에 의해 발현) 및 F4/80(대식세포에 의해 발현)에 대해 염색되었다. 두 모델 에서 염색 패턴은 T 세포에 의해 제대로 침투되지 않은 종양을 밝혀냈다(그림 4C),그러나 대식세포에 의해 높게 침투(그림 4D). 이러한 발견은 대부분의 인간 및 KPC PDA샘플5,7,12의면역학적으로 차가운 표현형과 일치한다.
그림 1: PDA 세포를 뮤린 췌장으로 초음파 유도 이식. (A)마우스의 방향, 초음파 단계 및 초음파 프로브를 사용하여 복부 장기의 고해상도 이미지를 얻는 데 사용됩니다. 스테이지와 플랫폼이 표준 방향에서 90°로 설정되어 마우스 복부의 왼쪽 위 사분면에 쉽게 접근할 수 있습니다. (B)신장, 비장 및 췌장의 식별을 묘사하는 초음파 이미지. 여기에서 주사 바늘은 마우스 복부에 대하여 위치됩니다. (C)마우스 췌장 내의 바늘을 묘사하는 초음파 이미지. (D)췌장에 종양 세포를 주입한 후 주사 부위에서 기포를 묘사하는 초음파 영상(파란색으로 윤곽). (E)초음파 유도 주입 후 췌장에서 PDA 세포를 함유하는 유체 볼루스를 밝히는 개복술. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: UG-OTIM 주사 후 종양 성장을 모니터링. (A)UG-OTIM 종양의 대표적인 초음파 영상(파란색으로 윤곽)에서 2, 3, 및 5주 주사 후, 지시된 바와 같이. (B)대표적인 UG-OTIM 종양의 3D 영상을 초음파 소프트웨어를 사용하여 주사 후 5주 후 재구성하였다. (C)UG-OTIM 종양의 대표적인 총 해부학 5주 후 마우스 부검 시 주사 후. (D)부적당한 세포 주입 후 피하층에서 성장하는 복막벽 종양의 대표적인 초음파 영상을 7주 후 주사 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: PDA 세포의 초음파 유도 주입 다음 등록 가능한 종양의 복용량 의존개시. (A)고역자(500,000 세포/25μL) 또는 낮은 역가(125,000 세포/25μL) 종양 세포를 가진 도 1에 기재된 바와 같이 주사 후 표시된 시점에서 의 종양 베어링 마우스의 비율. (B)마우스의 종양 성장 역학(A)은 각 심볼은 마우스의 군을 나타내고, 오차 막대는주사 후 지시된 시점에서 생쥐의 SEM.(C)비율을 나타낸다. 마우스는 종양이 >1000mm3이거나 종양 동반질환으로 인해 신체 상태가 좋지 않았다면 안락사 또는 검열되었다. (D)(A)로부터마우스에 대한 등록 가능한 종양 발병 시간. 등록 가능한 종양은 부피에서 ≥20mm3로 간주됩니다. n=8-20 마우스/실험을 통해 4개의 독립적인 실험을 대표하는 데이터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 실험 | 췌장 종양 베어링 /총 주사 | 첫째 주(등록 가능) | 2주차(등록 가능) | 3주차(등록 가능) | 4주차(등록 가능) | 씨드 후막 종양 |
| 높은 티터 | 24/31 | Nd | 8/24 (3/24) | 15/24 (7/24) | 23/23 (20/23) | 2/20 |
| 낮은 티터 | 11/17 | Nd | 3/11 (0/11) | 6/11 (3/11) | 9/11 (5/11) | 0/11 |
| 외과 주사 | 15/17 | Nd | Nd | 15/15 (9/15) | 15/15 (14/15) | 7/15 |
표 1: 외과 적 이식에 비해 성공적인 UG-OTIM 종양의 수. 실험당 n=5-10 마우스를 사용하여 높거나 낮은 역가 조건당 2-4개의 독립적인 실험을 결합한 데이터. "외과 적 주사"는 125,000 개의 종양 세포의 복부 복강경 수술 주사를 받은 마우스를 나타냅니다. "종양 베어링"은 췌장 종양이 있는 마우스를 나타낸다. "등록 가능"은 종양 부피 >20mm3을가진 각 시점에서 종양 베어링 마우스의 비율을 나타낸다. "씨드 후막 종양"은 종양 세포 주사로부터 의 후막 벽에 종양의 수반되는 파종을 가졌던 종양 베어링 마우스의 총 비율을 나타낸다. 췌장 이외의 조직에서 잘못 제시 종양을 가진 마우스 (즉, 신장) "종양 베어링"인구에서 제외되었다 (하지만 총 주입 마우스에 포함). ND, 결정되지 않음. 외과 이식 대 결합된 높고 낮은 적당기 군을 비교하는 맥막 벽 파종의 빈도, p < 0.0029 를 통해 2-꼬리 T 시험을 통해 Mann-Whitney 사후 시험.
도 4: UG-OTIM 종양은 KPC 종양 미세환경을 재량화한다. 대표 이미지가 표시됩니다. 맨 위 행, KPC 종양. 최하부, UG-OTIM 종양5주 이식 후. (A)부검 시 절제된 종양의 총 해부학. (B)H&E (10X, bar=100μm)(C)CD3(갈색)에 대한 면역화학 염색(10X, bar=100μm). (D)F4/80 (빨간색) 및 DAPI (파란색)의 면역 형광 염색 (4X, bar = 500μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
우리는 여기에서 고해상도 초음파검사를 사용하여 무린 PDA 세포주를 자가 조직 부위에 직접 이식하는 것이 KPC 및 외과 정형 외과 모델 시스템 모두에 대한 신뢰할 수있는 대안임을 보여줍니다. UG-OTIM은 종양 진단 및 신뢰할 수 있는 종양 성장 역학에 단축된 시간 프레임으로 PDA의 면역 병리학적 특징을 유지하는 생물학적으로 관련된 종양을 생성합니다. 따라서 초음파 유도 주입은 정형 접이식 PDA 종양을 낳는 마우스의 신속한 생산을위한 유용한 도구로 작용할 수 있으므로 임상적으로 관련된 모델에서 치료 조합을 조사 할 수 있습니다.
초음파 유도 이식은 전임상 조사의 표준 모형에 대한 중요한 개선을 제안합니다. 첫째, 이 절차는 뮤린 췌장에 완전히 C57BL/6 역교차 PDA 세포를 직접 이식하여 자발적종양의 발달을 위한 KPC 마우스의 시간 집약적인 모니터링을 제거합니다. 둘째, 전통적인 외과 정형외과 주사와 유사하게, UG-OTIM 접근법은 주사된 세포주를 제어할 수 있게 해주며, 이는 종양 세포주 및/또는 세포주의 생체내 조작의 선택을 포함하며, 종양 세포 이식을 받는 숙주를 제어할 뿐만 아니라. 셋째, 이 최소 침습 기술은 생존 수술의 힘든 노동을 피하고 수술 상처 치유에서 염증 신호뿐만 아니라 동물의 복잡한 수술 후 회복 기간을 우회합니다. 마지막으로, UG-OTIM 종양-외과 적 이식과 유사-낮은 T 세포 침투 및 높은 대식세포 침투를 포함하는 KPC 마우스에서 관찰된 TME를 재첩한다. 따라서, UG-OTIM 모델은 자발적인 KPC 모델에서 치료 학적 조사를 지연시키는 추가적인 합병증없이 KPC 종양의 주요 특징을 유지한다.
프로토콜의 여러 중요한 단계는 기술의 성공을 위해 마스터하는 열쇠입니다. 뮤린 초음파 화상 진찰에 있는 전문지식은 이 절차에 필수적입니다, 그러나 췌장에 있는 세포를 성공적으로 이식하기 위하여 요구되는 수동 손재주는 독립적으로 개발되어야 하는 기술 세트입니다. 12 시간 빛/어두운 주기에 마우스를 위해, 밤새 동물을 단식하는 것은 초음파에 의하여 췌장, 신장 및 비장의 보기를 막을 수 있던 어떤 소화되지 않은 음식의 삭제된 위장및 내장을 확인했습니다. 부가적으로, 직교성 주사에 사용되는 각 세포주들은 성장 역학을 이해하고 전이성전위33을결정하기 위해 추가 실험 전에 적정되어야 한다. 주입 하는 동안, 사출 사이트에서 피부를 꼬집기 위해 집게의 사용 으로 피부와 안벽을 통해 부드럽게 구멍을 뚫는 데 필요한 긴장을 만들었습니다. 절차의 중요한 단계는 조직을 천공하거나 비장 또는 신장과 같은 오프 표적 사이트를 뚫지 않고 췌장으로 바늘을 주의 깊게 안내하는 것이었습니다. 유체 볼루스의 확인은 적절한 조직에서 성공적인 종양 세포 주사의 가장 좋은 지표였다. 주입 후, 바늘은 유체 볼루스를 방해하지 않도록 천천히 철회해야합니다. 우리는 DMEM 또는 Trypan Blue를 사용하여 일련의 시험 주사가이 주입에 필요한 미세 운동 기술의 숙달을 개발하는 데 도움이되었다는 것을 발견했습니다.
이 절차의 문제 해결 중에 프로토콜의 성공에 영향을 미치는 여러 가지 요인을 확인했습니다. 시행착오 실험에서 가장 빈번한 오류는 이식 중에 신장을 천공하는 것이었으며, 이는 초기 실험에서 이 기술의 규칙적인 운동이 숙련도를 향상시킨다는 것을 시사하는 초기 실험에서 더 자주 발생했습니다. 추가적으로, 우리는 문제 해결 단계 도중 necropsy에 초음파 와 직접 시각화를 통해 종양 세포 주입 후에 액체 bolus의 존재를 확인하는 것이 성공적인 주입 기술을 향상했다는 것을 것을을 발견했습니다. 주입 중에 초음파로 거품의 형성이 확인되지 않으면 주사기를 완전히 누르기 전에 바늘의 위치를 조정하여 종양 세포의 나머지 볼러스를 방출 할 수 있습니다. 우리는 또한 너무 빨리 주입된 현탁액 양이 췌장에 있는 액체 bolus의 복강으로 종양 세포의 유출 귀착되거나 붕괴한다는 것을 관찰했습니다. 일반적으로, 이들 동물은 n=7 동물을 제외한 췌장 종양을 개발하기 위해 계속되었으며, 이는 주사 후 4주 동안 종양의 증거를 나타내지 않았다. 이 결과는 우리의 첫 번째 시도에서만 보고되었습니다 (그리고 6/7 동물은 종양 세포의 낮은 기염으로 주입되었습니다). 의심스러운 종양 세포 주사가 있거나 바늘의 재배치가 필요한 마우스는 췌장 외부의 종양 발달을 면밀히 모니터링해야합니다.
초음파 유도 방법의 가장 중요한 한계는 필요한 계측기의 가용성과 종양 이식과 관련된 기술적 인 기술입니다. 마우스가 초음파 젤을 통과하는 주사기와 바늘 끝으로, 초음파 플랫폼에 비 살균 주입하기 때문에 절차는 완전히 멸균되지 않습니다. 우리는 이 연구 결과를 시작한 이래로 총 8개의 독립적인 실험에 걸쳐 n=148 마우스에 있는 감염의 아무 기록도 본 적이 없지만, 이 프로세스 도중 주입 바늘을 통해서 전염하는 에이전트가 췌장을 입력할 수 있었다. 따라서 가능한 한 프로토콜의 많은 측면 (장갑, 초음파 표면, 얼음 상자 포함)은 병원균에 대한 잠재적 인 노출을 줄이기 위해 소독제 또는 70 % 에탄올로 분무해야합니다. 현재 프로토콜의 추가 제한은 현재 희석에서 4662 세포주를 사용하는 전이의 부족이었다. UG-OTIM 시스템에서 사용되는 각 세포주들은 전이성전위33뿐만아니라 원하는 성장속도에 대해 적정되어야 한다. 마지막으로, 우리의 현재 프로토콜은 단세포 현탁액에 종양 세포를 주입하기 위한 기술을 확립하였다. 그러나, 세포외 기질기의 첨가는 잠재적으로 종양 확립을 강화하고 종양 세포 누설을 방지하기 위해 첨가될 수 있다(외과적 이식 모델27,30,31,32). 따라서, UG-OTIM의 많은 한계는 정형외 주사에 사용되는 세포주의 적절한 테스트로 극복될 수 있다.
요약하면, UG-OTIM 모델은 뮤린 췌장에 종양 세포를 조직 지시주입하는 정확한 방법이다. 이 최소 침습 이식 기술은 시술 시간을 줄이고 수술 후 합병증을 최소화하고 주사의 정확성을 향상시킴으로써 조사자와 동물 모두에게 유익합니다. UG-OTIM 주사에서 발생하는 종양은 자발적인 KPC 종양의 특징적인 면역 생물학적 특징을 유지하고, 종양 발병에 대한 신뢰할 수 있는 시간을 가지며, 재현 가능한 종양 성장 역학을 갖는다. 따라서 UG-OTIM 모델은 가장 큰 충족되지 않은 임상 적 필요를 가진 환자에 대한 새로운 치료법을 밝히기 위해 전임상 환경에서 치료 조합을 심문하기 위해 상대적으로 높은 처리량 방식으로 사용될 수 있다.
Disclosures
저자는 아무런 공개가 없습니다.
Acknowledgments
저자는 로버트 폰더하이드 박사와 본더하이드 실험실의 모든 구성원, 췌장암 마우스 병원의 모든 구성원, 벤 스탠거 박사, 펜실베니아 대학의 췌장암 연구 센터, 데보라 델만에게 감사를 표하고자 합니다. 도움이 되는 토론을 할 수 있습니다. 이 작품은 파커 암 면역 요법 펠로우 상 (KTB)과 펜실베니아 대학 (CC)의 췌장암 연구 센터의 자금 지원으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Conicals | Thomas Scientific | 2602A26 | |
| Blunt edged forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Cell Dissociation Buffer | Thermo-Fisher | 13151014 | |
| Cotton Tipped swabs | Thermo-Fisher | 19062614 | |
| Covidien Monoject 3/10mL, 29G X 1/2" | Thermo-Fisher | 8881600145 | |
| Depilatory Agent | Amazon | Nair Body Lotion | |
| DMEM | Thermo-Fisher | 10-566-016 | |
| FBS | Gemini Bio-oroducts | 100-106 | |
| Flask | Sigma-Aldrich | CLS430825 | |
| Forceps (blunt edge) | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Gauze | Fisher | 13-761-52 | |
| Gentamicin | Thermo-Fisher | 15750060 | |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Isofluorane | Penn Vet Supply | VED1350 | |
| Isofluorane Vaporizer | VetEquip | 911103 | |
| L-glutamine | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Optixcare | MidWest Veterinary Supply | 052.50310.3 | |
| Paper Tape | Medline | MMM1530Z5 | |
| PBS | Thermo-Fisher | 14-190-250 | |
| Slide warmer | C&A Scientific | XH-2001 | |
| Sterilant (Clidox-S) | Fisher Scientific | NC0332382 (activator) NC9189926 (base) | Needs to be combined according to manufacturer's instructions |
| Sterile Alcohol prep pad | Covidien | 6818 | |
| Trypsin | Thermo-Fisher | 15090046 | |
| Ultrasound gel | Thermo-Fisher | 03-34-1LT | |
| Visualsonics Ultrasound Vevo 2100 | Visual Sonics | Vevo 2100 |
References
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