Summary
نحن نقوم بوصف بروتوكول لغرس الموجات فوق الصوتية موجه زرع خطوط الخلايا السرطانية الأورام اللحمية المشتقة من murine مباشره في موقع الورم الأصلي. ادي هذا النهج إلى أورام البنكرياس التي يمكن اكتشافها عن طريق التصوير بالموجات فوق الصوتية في غضون 2-4 أسابيع من الحقن ، وخفضت بشكل كبير من نسبه بذر الخلايا السرطانية علي الجدار الصفاقي بالمقارنة مع غرس العظام الجراحية.
Abstract
وقد حفزت النجاح الأخير للحصار حاجز المناعة في سرطان الجلد والأورام السرطانية الرئة مجال التلقيح المناعي ، وكذلك كشفت عن القيود المفروضة علي العلاجات الحالية ، حيث ان غالبيه المرضي لا تستجيب للعلاج المناعي. تطوير نماذج مسبقه السريرية دقيقه لتحديد بسرعة تركيبات العلاجية الجديدة والفعالة هي حاسمه لمعالجه هذه الحاجة السريرية غير الملبية. سرطان الغدد السرطانية في البنكرياس (PDA) هو مثال متعارف عليه لورم الحاجز المناعي المقاوم للحصار مع 2% فقط من المرضي الذين يستجيبون للعلاج المناعي. المهندسة وراثيا KrasG12D +/-; Trp53R172H +/-; نموذج الماوس pdx-1 Cre (الفيلق) من المساعد الشخصي الرقمي بتلخيص الامراض البشرية وأداه قيمه لتقييم العلاجات لمقاومه المناعة في الاعداد قبل السريرية ، ولكن الوقت لظهور الورم هو متغير للغاية. وتحافظ نماذج غرس الورم الجراحي للورم المجهري لل PDA علي السمات البيولوجية المناعية لبيئة الورم الصغرى الخاصة بالانسجه التابعة لفيلق حماية كوسوفو (TME) ولكنها تتطلب اجراء مكثفا للوقت وإدخال التهاب شاذ. هنا ، نستخدم نموذج غرس الورم الموجه للموجات فوق الصوتية (UG-OTIM) لاينفاسيفيلي بحقن خطوط الخلايا PDA المشتقة من الفيلق مباشره في بنكرياس الفئران. تنمو أورام UG-OTIM في موقع الانسجه الذاتية ، وتلخص بإخلاص الخصائص النسيجية لل PDA TME ، وتصل إلى الأورام المسجلة بحجم التسجيل للدراسات السريرية قبل أربعه أسابيع بعد الحقن مع الحد الأدنى من البذر علي الجدار الصفاقي. نظام UG-OTIM الموصوف هنا هو نموذج الورم السريع واستنساخه التي قد تسمح لتحليل الانتاجيه العالية من التركيبات العلاجية الجديدة في murine المساعد الشخصي الرقمي TME.
Introduction
سرطان الغدة السرطانية في البنكرياس (PDA) هو مرض العدوانية المعروفة التي يتم صهرها للعلاجات الحالية ، مع معدل البقاء علي قيد الحياة 5 سنوات كئيبه من 9 ٪1. تجاوز المساعد الشخصي الرقمي مؤخرا سرطان الثدي ليصبح السبب الرئيسي الثالث للوفيات المرتبطة بالسرطان في الولايات الامريكيه ، ومن المتوقع ان يصبح السبب الثاني الرائد (وراء سرطان الرئة فقط) بحلول عام 20302. وهناك عدد من الميزات المميزة المناعية "الباردة" الورم المساعد الشخصي الرقمي (tme)-بما في ذلك تسلل عاليه من السكان الخلايا النخاعية المثبطة للمناعة3,4,5,6,7,ترسب السميكةالكثيفة8,9,10,11, وندره الخلايا T5,12 فشل العلاج المناعي في المساعد الشخصي الرقمي14. وتحقيقا لهذه الغاية ، فان استخدام نموذج الحيوانية ذات الصلة سريريا هو أداه أساسيه للتحقيق في فعاليه تركيبات المخدرات الجديدة للأورام الباردة المناعية في الجسمالحيوي.
المهندسة وراثيا KrasG12D +/-; Trp53R172H +/-; Pdx-1 Cre (الفيلق) نموذج الماوس من المساعد الشخصي الرقمي بإخلاص يلخص الجوانب السريرية البارزة من الإنسان المساعد الشخصي الرقمي ، بما في ذلك السائقين الجزيئية للمرض والميزات المرضية الخلوية15. أورام الفيلق تتطور تلقائيا في الفئران المناعية بالبالكامل ، مما يسمح للاستجواب من النهج العلاجية بما في ذلك العلاج الكيميائي16،17، العلاج المناعي18،19،20،21، و سدي-استهداف المعالجة9،11،22في فيفو قبل أداره هذه الادويه في اعداد التجربة السريرية. علي الرغم من العديد من نقاط القوه كنموذج قبل السريرية من المساعد الشخصي الرقمي ، واستخدام الفئران الفيلق غير المواتية من قبل تطور متغير للغاية من تطور الورم العفوي كما يمكن ان تتراوح بداية الورم من 4 إلى 40 أسابيع (التالي تتطلب صيانة مستعمره تربيه كبيره)15. بالاضافه إلى ذلك ، فان فئران الفيلق لديها القدرة علي الاصابه بالأورام الاوليه المتعددة الأضلاع23، وهناك انخفاض سريع في صحة الماشية وزيادة في الاعتلالات المشتركة بما في ذلك الامراض العصبية والاستسقاء مع تقدم المرض15.
أحد البدائل لنموذج الماوس التلقائي لفيلق حماية كوسوفو هو استخدام نموذج غرسه العظام من المساعد الشخصي الرقمي24. الزرع الجراحي المباشر لخطوط الخلايا السرطانية في موقع الانسجه الاصليه هو طريقه أكثر فعاليه من حيث التكلفة ويمكن التنبؤ بها من تلخيص البيئة المجهرية الورم الخاصة بالانسجه (TME) من المساعد الشخصي الرقمي. يسمح غرس الأورام بحقن خطوط خلايا الورم السرطانية للفئران الخلفية العكسية الوراثية5، مما يسمح للفئران المضيفة بالتلاعبات الجينية الاضافيه التي ستستغرق وقتا طويلا لتتكاثر في نموذج فاره الفيلق. ومع ذلك ، زرع أورام البنكرياس يتطلب عمليه جراحيه كثيفه العمالة التي يدخل التهاب منحرف في موقع خياطه في جدار البطن24،25،26، وغالبا ما يتضمن الانتعاش بعد الجراحة طويلة27،28،29.
التقدم التكنولوجي في التصوير بالموجات فوق الصوتية باستخدام محولات القوارض الخاصة يوفر صور عاليه الدقة في الوقت الحقيقي. بالاسترشاد بالتصوير بالموجات فوق الصوتية لحركه ابره الحقن في التجويف الصفاقي ، يمكن للمرء زرع خلايا الورم علي وجه التحديد في البنكرياس ، والاستفادة من فوائد حقن الورم التقويمي في غياب الزرع الجراحي والتهابات المصاحبة. هذا النهج ، ووصفت الموجات فوق الصوتية ، وقد أنشئت سابقا نموذج زرع الورم المجسم (UG-otim) في نماذج الكسب غير المزروع من سرطان البنكرياس30 وكذلك في العديد من نماذج السرطان الأخرى بما في ذلك ساركوما يوينغ ، الورم الارومي العصبي وسرطانالمثانة 31 ،32.
هنا ، ونحن نقدم بروتوكولا مفصلا لأداء حقن الموجات فوق الصوتية من خطوط الخلايا السرطانية في البنكرياس murine. نعرض الأورام الناتجة تلخص الخصائص النسيجية والمناعية لفيلق حماية كوسوفو TME ، التالي يمكن استخدامها للتحقيق في التركيبات العلاجية الجديدة ، بما في ذلك العلاجات المناعية ، للكشف بسرعة عن أكثر المعالجات الواعدة للتحرك إلى الامام في التجارب السريرية.
Protocol
واستعرضت البروتوكولات الحيوانية ووافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانية واستخدامها في جامعه بنسلفانيا. الإناث من 5 إلى 6 أسابيع من العمر C57Bl/6 تم شراؤها الفئران (انظر جدول المواد) وتستخدم بعد 1-3 أسابيع الراحة. أشرفت الجامعة الموارد الحيوانية مختبر الرعاية الحيوانية.
1. اعداد خطوط خلايا الورم PDA للحقن
- ينمو خط الخلية PDA المستمدة من الفيلق في وسائل الاعلام الخلية السرطانية (TC): المتوسطة النسر دولبيكو المعدلة (DMEM) تكمله مع 10 ٪ الجنين البقري المصل (سيتم) ، 2mM L-الجلوتامين و 83 ميكروغرام/مل جنتاميسين.
- السماح للخلايا بالنمو إلى 80-85% كونفلوينسي في القوارير المحتفظ بها عند 37 درجه مئوية و 5% CO2.
- وبمجرد ان تصل الخلايا إلى الكونفلوينسي المثالية ، فانها تدمر الوسائط من القوارير وتغسل مرتين بالدفء (37 درجه مئوية) ، والمحلول الملحي المعقم المخزن بالفوسفات ، والذي يكفي لتغطيه الطبقة الاحاديه من الخلايا الملتصقة. ماصه من المتبقية تلفزيوني بعد غسل النهائي.
- أضافه الحارة (37 °C) 0.05 ٪ التريبسين-أدتا الحل (0.5 ٪ الأسهم التريبسين-أدتا المخفف 1:10 في Hanks'-القائم علي انزيم خاليه من التفكك الخلية العازلة) لتغطيه أحاديه الطبقة في كل قارورة واحتضان في 37 درجه مئوية لمده 3-5 دقيقه أو حتى فصل الخلايا مع التنصت علي جانبي قاروره.
- أضافه 10-25mL من الباردة (4 درجه مئوية) ، ووسائل الاعلام TC معقمه في لكل قارورة لوقف رد فعل التريسينايشن. صب تعليق الخلية في المخروطية 50mL (ق) ، وملء 50mL مع وسائل الاعلام TC الباردة.
- الطرد المركزي في 300g لمده 5 دقائق في 4 ° c. تجاهل ماده طافي وأعاده التعليق بيليه في dmem الباردة والمعقمة (خاليه من المصل). إذا تم استخدام أنابيب مخروطيه متعددة لجمع الخلايا ، يمكن الجمع بين جميع الكريات إلى مخروطي واحد في هذه الخطوة.
- الطرد المركزي في 300g لمده 5 دقائق في 4 °.
- كرر الخطوات 1.6-1.7 مرتين. في الغسيل النهائي ، واتخاذ الخلايا الهضمية للعد. ومن المستحسن بقاء الخلية من ≥ 90 ٪ لحقن الجسم الحيوي.
- اعداد تعليق موحد للخلايا الورم PDA في التركيز المطلوب من الخلايا السرطانية. استخدمنا 10-20 x 106 خلايا/مل (250,000 إلى 500,000 الخلايا/25μl) في كميه مناسبه من العقيمة ، dmem الباردة أو تلفزيوني ، ولكن يجب ان يكون كل خط الخلية معاير في الجسم الفيفو.
- إبقاء الخلايا الباردة ، علي الجليد ، حتى تكون جاهزه للحقن.
2. اعداد الفئران قبل الجراحة
ملاحظه: ينصح بتنفيذ هذه الخطوة قبل 24 ساعة من الاجراء.
- وضع أقفاص تحتوي علي الفئران التجريبية علي مجموعه أكثر دفئا إلى 37 درجه مئوية.
- الحصول علي أقفاص جديده ونظيفه ووضع علي منصة الاحترار الثاني تعيين إلى 37 درجه مئوية.
- تنظيف بدقه مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ، وغرفه التعريفي والموجات فوق الصوتية (الولايات الامريكيه) مرحله مع معقمه (انظر جدول المواد).
- تحويل وظيفة الاحترار من المرحلة الولايات الامريكيه إلى 37 درجه مئوية.
- قم بتشغيل جهاز التخدير: اضبط الاقراص علي المقسم الأنبوبي بحيث يقتصر تدفق الهواء علي الغرفة التعريفية فقط. قم بتشغيل خزان الأكسجين وتعيين إلى معدل التدفق إلى 1 لتر/دقيقه. بدوره علي المبخر ايزوفلواني إلى 2-3 ٪.
- ضع فاره واحده في غرفه الاستقراء. مراقبه الماوس حتى لم يعد المحمول والتنفس تباطا.
- اضبط الاقراص علي المقسم بحيث يسمح بتدفق الهواء إلى كل من الغرفة التعريفية ومخروط الأنف. بسرعة تحريك الماوس من غرفه الاستقراء ووضعه في الركود البطني علي المرحلة الامريكيه الدافئة مع كمامه في مخروط الأنف.
- اختبار مستوي الاستقراء من خلال مراقبه اي استجابه انعكاسيه لمعسر اصبع القدم. إذا لم يكن هناك شيء ، فان الماوس جاهز لأزاله الشعر.
- ضع كميه صغيره من شحم العين (انظر جدول المواد) علي كلتا العينين لمنع جفاف الانسجه. تحويل الماوس بحيث يضع في الركود الظهرية علي خشبه المسرح. التمسك بلطف الأطراف العلوية والسفلية إلى المرحلة مع الشريط الورقي من أجل تعظيم التعرض للبطن وتامين الماوس إلى المرحلة.
- استخدمي أداه معقمه من القطن السائل لتطبيق كريم مزيل اللون السخي علي الربع الأيسر العلوي من البطن. وينبغي تطبيق مزيل الماكياج في المنطقة العامة من الطحال وتمتد نحو الخط الأوسط. السماح للجلوس لمده دقيقه واحده.
- اختبر درجه أزاله الشعر باستخدام الطرف المعاكس لقضيب القطن برفق لمسح الكريم المزيل للشعر ، بمجرد ان يزيل بسهوله ، امسح البطن نظيفا بوسادة شاش جافه. ثم الرطب طبقه نظيفه من الشاش مع كميه صغيره من المالحة الدافئة ومسح المنطقة مره أخرى لأزاله تماما وكيل مزيل الرطوبة. لا تتجاوز 2 دقيقه كامله من الاتصال المباشر علي الجلد الماوس من أجل الحد من فرصه الحروق الكيميائية.
- مره واحده وقد تم أزاله الشعر بما فيه الكفاية من البطن ، والعودة الماوس إلى قفص جديد ، نظيفه علي أكثر دفئا.
- في حين ان أول الحيوانية يخضع لأزاله الشعر علي المسرح الأمريكي ، يمكن أضافه الحيوانية القادمة إلى غرفه الاستقراء.
- قبل تخدير القفص المقبل من الفئران ، وإيقاف ايزوفلوراني ودافق غرفه التعريفي مع الأكسجين. تنظيف الغرفة التعريفي والولايات الامريكيه المرحلة/مخروط الأنف مع معقمه. كرر الخطوات من 2.5 إلى 2.14 حتى تكون جميع الأقفاص والفئران قد خضعت لأزاله الشعر.
ملاحظه: يمكن اعتبار الماشية الصائمة عن طريق السحب المؤقت للطعام لفتره قبل الغرس لتقليل الانسداد البصري لأعضاء البطن بسبب الطعام غير المهضوم في المعدة والأمعاء (12-24 ساعة). لا ينصح بتقييد المياه. إذا تم الصيام الحيوانية ، فمن المستحسن ان يتم التعامل مع حقن 1mL الدافئة (37 درجه مئوية) ، والمالحة المعقمة بعد حقن الورم من أجل منع الجفاف.
3. غرس الموجات فوق الصوتية الموجهة من الخلايا PDA
ملاحظه: يتم تنفيذ جميع إجراءات الموجات فوق الصوتية باستخدام جهاز التصوير بالموجات فوق الصوتية والبرمجيات (انظر جدول المواد). محول لديه تردد مركز 40 ميغاهيرتز وعرض النطاق الترددي من 22-55 MHz.
- ضبط منصة الموجات فوق الصوتية بحيث سطح منصة موازيه للارضيه والمحقق يواجه الجانب الأيسر من الحيوانية ، مع راس الحيوانية إلى اليمين. ضبط موقف محول بحيث يتم الحصول علي صوره عرضيه البطن (الشكل 1ا).
- تخدير الفاره ليتم حقنها كما هو موضح في الخطوات 2.1-2.8. تثبيت الماوس علي منصة الولايات الامريكيه كما هو موضح في الخطوة 2.9.
- تطبيق كميه سخية من هلام الموجات فوق الصوتية الدافئة (37 درجه مئوية) إلى القسم أصلع من البطن.
- خفض بلطف محول للاتصال البطن الماوس. اضبط المحول حسب الحاجة حتى يظهر البنكرياس بوضوح. حدد موقع الكلية اليسرى والطحال من أجل توفير اتجاه دقيق لتجويف البطن.
ملاحظه: لأنه تم تغيير موضع محول للسماح بالوصول إلى الجانب الأيسر من البطن ، محور س وص علي عناصر تحكم المرحلة مقلوبه الآن. - تحميل 29G س 1/2 "حقنه الانسولين (انظر جدول المواد) مع 25μL من تعليق الخلايا السرطانية. مسح طرف ابره مع المعقمة الكحول وساده الاعداديه قبل الحقن من أجل الحد من زرع الخلايا السرطانية في جدار البطن.
- باستخدام ملقط حاد الحواف ، وفهم الجلد والجدار البريتوني لزيادة التوتر في موقع الحقن المطلوب. عقد حقنه في حوالي 25 °-45 ° زاوية إلى سطح منصة الموجات فوق الصوتية, تقدم ببطء الابره من خلال الجلد والجدار البريتوني. تاكد من ثقب الابره من خلال الجدار الصفاقي قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. وينبغي ان يشعر البوب الصغيرة كما الابره يخترق الجدار البريتوني.
- تحت التصوير بالموجات فوق الصوتية ، توجيه الابره مباشره إلى البنكرياس (الشكل 1ب-ج). تاكد من الابره داخل نسيج البنكرياس عن طريق تحريك برميل الحقنه برفق صعودا وهبوطا. إذا كان الوضع صحيحا ، فان طرف الابره سيبقي داخل نسيج البنكرياس بينما يتحرك برميل الحقنه.
- ببطء حقن الخلايا السرطانية وتاكيد يتم زرع الخلايا في الموقع المطلوب عن طريق تشكيل البلعه السائل داخل البنكرياس (مرئية علي شاشه الموجات فوق الصوتية, الشكل 1د).
ملاحظه: يجب ان يشعر بعض المقاومة في حين الغطاس الاكتئاب. يجب الحرص علي عدم اختراق البنكرياس عده مرات لان هذا يزيد من احتمال التسرب في تجويف البطن. - بمجرد ان يتم حقن الحجم الكامل للتعليق ويمكن رؤية البلعه السائل في البنكرياس ، والحفاظ علي ابره لا يزال لعده ثوان. سحب ببطء ابره من البطن الماوس ، مع الحرص الشديد علي عدم إزعاج الخلايا المحقونة.
- وضع الماوس في قفص نظيفه ودافئه والتاكد من ان الماوس يتعافى تماما من التخدير. كرر هذه العملية لجميع الكائنات.
- قبل تخدير الماوس التالي ، وتنظيف الغرفة التعريفي والولايات الامريكيه المرحلة/مخروط الأنف مع معقمه.
- كرر الخطوات 3.2-3.11 حتى يتم حقن كافة الفئران.
Representative Results
وكان الهدف من هذا التقرير هو توفير بروتوكول مفصل لتنفيذ غرس الموجات فوق الصوتية لخطوط الخلايا التي تستمد من الفيلق. في التجارب التمثيلية المبينة في الشكل 2-4، نؤكد ان الأورام UG-otim تنمو بمعدل ثابت وبطريقه تعتمد علي الجرعة. وعلاوة علي ذلك ، فاننا نظهر ان أورام UG-OTIM تلخص السمات المناعية والنسيجية البارزة لفيلق حماية كوسوفو TME. التالي ، فان النظام UG-OTIM هو نموذج الماوس المساعد الشخصي الرقمي الذي يمكن استخدامه بطريقه عاليه الانتاجيه للشاشة بسرعة تركيبات العلاج الجديدة في الجسم المجري.
باستخدام بروتوكول UG-OTIM المبينة هنا ، تم اعداد الفئران للزرع ، والمضمون لمنصة الموجات فوق الصوتية ساخنه وتم تعديل مواقف كل من المنصة ومحول لهذا الاجراء كما هو مبين في الشكل 1ا. وقد استخدمت التصوير بالموجات فوق الصوتية عاليه الدقة للتعرف علي موقع حقن داخل البنكرياس الماوس التي يمكن استهدافها دون انثقاب اما الكلي أو الطحال (الشكل 1ب). تحت التصور أشعه فوق ، تم إدخال الابره بعناية إلى تجويف البطن من خلال الجدار البريتوني وتسترشد في البنكرياس الفار (الشكل 1ج). بعد وضع الصحيح لابره تم تاسيسها ، تم حقن تعليق الخلية الورم ببطء شديد في البنكرياس. وقد تاكد الغرس الناجح بوجود فقاعه داخل البنكرياس (الشكل 1د). في التجارب المبكرة ، تم التضحية بالماوس ، وتم التحقق من فعاليه الاجراء من خلال تصور مباشره البولي السائل في انسجه البنكرياس الاجماليه (الشكل 1ه).
تم رصد غرس الأورام ومعدل النمو عن طريق التصوير بالموجات فوق الصوتية أسبوعيا. أنتجت عمليات الزرع الناجحة الأورام التي كانت موجودة داخل حدود البنكرياس طوال وقت التجربة (الشكل 2ا). برنامج الموجات فوق الصوتية (انظر جدول المواد) المستخدمة المسموح بها لمنطقه الورم وحجم ليتم تحديدها لكل نقطه زمنيه ، فضلا عن تعيين 3d من الأورام المقاسه ليتم إنشاؤها (الشكل 2ب) ، وتم تاكيد الصور 3d في وقت الماوس العنكبوت (الشكل 2ج). يمكن ان يؤدي الحقن غير السليم للخلايا اثناء اجراء UG-OTIM إلى تطوير ورم الجدار الصفاقي (الصورة التمثيلية التي تظهر في الشكل 2د). يمكن استبعاد الفئران الموجودة مع الأورام الصفاقي من المزيد من الدراسات.
لتحديد تركيز الخلايا الأمثل للاستخدام في الدراسات قبل السريرية ، تم حقن C57Bl/6 التي تستمد من الفيلق المساعد الشخصي الكويتي خط الخلية (4662)9 إلى الساذج ، البرية من نوع C57Bl/6 الفئران عبر ست تجارب مستقله. وقد استمد هذا الخط الخلوي ( الذي كان في المختبر ست مرات) من الفاره الحاملة للورم التي تحمل الورم بشكل كامل (> 10 أجيال ، والذي أكدهالتحليلالذي قام به الجانب الاسكتلندي للوقاية من الأورام الجزيئية غير المتطابقة المعقدة لرفض الورم. تم حقن الخلايا السرطانية في درجه منخفضه (1.25 × 106 خلايا/25μl) وبجرعة عاليه (5 × 106 خلايا/25 μl). وأسفرت الحقن السرطانية العالية الارتفاع عن نسبه أكبر من الأورام الحاملة للورم بعد ثلاثه أسابيع من الحقن مقارنه بالفوج المنخفض (الشكل 3ا). علي الرغم من التاخير في ظهور الورم ، لم يكن معدل نمو الورم الكلي مختلفا بشكل كبير بين الجرعتين (الشكل 3ب). المثل ، ففي حين ان معدل البقاء بين المجموعتين لم يكن مختلفا اختلافا كبيرا ، فان اتجاه البيانات نحو تحسين البقاء قليلا في الفئة المنخفضة المستوي (الشكل 3ج). كما أنتجت الفوج عاليه المستوي نسبه أكبر من الفئران مع الأورام التي كانت انرولابل في الدراسات قبل السريرية (المعينة في ≥ 20mm3 حجم الورم) من قبل أربعه أسابيع بعد الحقن من الفوج المنخفضة عيار (الشكل 3د). غالبيه الفئران من الأفواج العالية والمنخفضة علي حد سواء قدمت مع الأورام الانرولابله في اليوم 25 ووضعت اعراض المرض في نهاية المرحلة بما في ذلك استسقاء (البيانات لا تظهر). الانبثاث ، التي لا تحدث باستخدام 4662 في جرعات الخلية من هذا البروتوكول ، قد تكون علي غرار مع خطوط الخلايا المختلفة أو جرعات33.
تتطلب طريقه UG-OTIM إتقان المهارات الحركية الدقيقة لتعريب موقع الحقن المطلوب بدقه ، والذي كان صعبا في تجاربنا الاولي. ولهذا السبب ، أدرجنا جدولا يصور عدد الماشية التي طورت الأورام داخل البنكرياس (عمليات زرع ناجحه) مقارنه بالعدد الإجمالي للحيوانات التي خضعت لغرس الأورام الموجهة فوق الصوتية (الجدول 1). تم التخلص من الكائنات الحيوانية من التحاليل المستقبلية إذا تطورت الأورام في مكان غير مرغوب فيه (اي الكلي) أو إذا لم يكن هناك دليل علي وجود ورم بمقدار سته أسابيع بعد الحقن ، كما هو مبين. ويرد أيضا في الجدول 1التقدم الأسبوعي لنسبه الفئران التي تحمل أورام البنكرياس انرولابل (≥ 20mm3 حجم الورم) من كل تجربه.
لتحديد ما إذا كان هناك فائده لاستخدام نهج UG-OTIM بدلا من نموذج التقويم التقليدي الجراحية (بعد الاستثمار في الوقت بعد اكتساب الكفاءة في هذه التقنية) ، قارننا البذر من أورام المساعد الشخصي الرقمي في جدار الصفاق من الفئران بعد كل اجراء. وجدنا ان 2/31 فقط الفئران (6.5%) وضعت غير مقصوده الأورام الجدار البريتوني بعد حقن UG-OTIM, مقارنه 7/15 الفئران التي وضعت الأورام الجدار البريتوني بعد الحقن الجراحي (46.6%, p < 0.0029) (الجدول 1). التالي ، فان معدل بذر الأورام الاضافيه في الصفاق ينخفض إلى حد كبير في طريقه UG-OTIM بالمقارنة مع الزرع الجراحي.
عند التضحية من الفئران التي تحمل الأورام UG-OTIM ، وجدنا ان التشريح الإجمالي للأورام كان مماثلا لأورام الفيلق العفوية (الشكل 4ا). واظهر التحليل النسيجي نمطا من الهياكل الانبوبيه غير الطبيعية التي كانت متشابهة في كلا النموذجين والتي لخصت شكل المرض البشري (رقم 4ب). للتحقيق في التسلل المناعي في كل من فيلق حماية كوسوفو وأورام UG-OTIM ، كانت العينات النسيجية التمثيلية ملطخه بالنسبة لCD3 (التي عبرت عنها خلايا T) و F4/80 (التي عبر عنها الضامة). في كلا النموذجين ، كشفت أنماط تلطيخ الأورام التي تم اختراقها بشكل سيئ من قبل الخلايا T (الرقم 4ج) ، ولكن تسللت إلى حد كبير من قبل الضامة (الشكل 4د). هذا الاستنتاج يتسق مع النمط الظاهري الباردة المناعية لمعظم البشرية والفيلق المساعد الشخصي الكويتي عينات5،7،12.
الشكل 1: غرس الموجات فوق الصوتية من خلايا المساعد الشخصي الرقمي في البنكرياس المورين. (ا) توجيه الماوس ، والموجات فوق الصوتية المرحلة ، والموجات فوق الصوتية المسبار تستخدم للحصول علي صوره عاليه الدقة من أعضاء البطن. لاحظ المرحلة والمنصة قد تحولت 90 درجه مئوية من الاتجاه القياسي للسماح سهوله الوصول إلى الربع الأيسر العلوي من البطن الماوس. (ب) صوره ultrasonographic التي تصور تحديد الكلي والطحال والبنكرياس. هنا يتم وضع ابره الحقن ضد البطن الماوس. (ج) صوره ultrasonographic تصور الابره داخل البنكرياس الماوس. (د) صوره الموجات فوق الصوتية التي تصور فقاعه في موقع الحقن (المبينة باللون الأزرق) بعد الحقن الخاضعة للرقابة من الخلايا السرطانية في إلى البنكرياس. (ه) بضع البطن للكشف عن السائل البولي الذي يحتوي علي خلايا PDA في البنكرياس بعد الحقن بالموجات فوق الصوتية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رصد نمو الورم بعد حقن UG-OTIM. (ا) صوره تمثيليه بالموجات فوق الصوتية لورم UG-otim (المبينة باللون الأزرق) في 2 و 3 و 5 أسابيع بعد الحقن ، كما هو مبين. (ب) أعاده تمثيل الصورة ثلاثية الابعاد لورم UG-otim 5 أسابيع بعد الحقن باستخدام برنامج الموجات فوق الصوتية. (ج) التشريح الإجمالي التمثيلي لورم UG-otim 5 أسابيع بعد الحقن علي الماوس العنكبوت. (د) صوره تمثيليه الموجات فوق الصوتية للورم الجدار البريتوني المتزايد في طبقه تحت الجلد بعد حقن الخلية غير لائق في 7 أسابيع بعد الحقن. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: ظهور الأورام الانرولابله التي تعتمد علي الجرعة بعد حقن الموجات فوق الصوتية من خلايا PDA. (ا) نسبه الفئران الحاملة للورم في النقاط الزمنيه المشار اليها بعد الحقن كما هو موصوف في الشكل 1 مع الخلايا السرطانية العالية (500,000 خلايا/25μl) أو منخفضه (125,000 خلايا/25μl) ، كما هو مبين. (ب) حركيه نمو الورم من الفئران من (ا) ، كل رمز يمثل مجموعه من الفئران ، تشير القضبان خطا SEM. (ج) نسبه الفئران من (ا) الحية في النقاط الزمنيه المشار اليها بعد الحقن. وكانت الفئران رحيم أو رقابه إذا كانت الأورام > 1000mm3 أو حاله الجسم كانت فقيره بسبب الامراض المصاحبة للورم. (د) الوقت المناسب لظهور ورم انرولابل للفئران من (ا). وتعتبر الأورام انرولابل لتكون ≥ 20mm3 في الحجم. ممثل البيانات من 4 تجارب مستقله مع n = 8-20 الفئران/التجربة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| التجربه | البنكرياس-الأورام الحاملة/مجموع الحقن | الأسبوع الأول (انرولابل) | الأسبوع الثاني (انرولابل) | الأسبوع الثالث (انرولابل) | الأسبوع الرابع (انرولابل) | الأورام البريتونية المصنفة |
| ارتفاع Titer | 24/31 | Nd | 8/24 (3/24) | 15/24 (7/24) | 23/23 (20/23) | 2/20 |
| المنخفضة Titer | 11/17 | Nd | 3/11 (0/11) | 6/11 (3/11) | 9/11 (5/11) | 0/11 |
| الحقن الجراحي | 15/17 | Nd | Nd | 15/15 (9/15) | 15/15 (14/15) | 7/15 |
الجدول 1: عدد الأورام الناجحة UG-OTIM بالمقارنة مع الزرع الجراحي. البيانات مجتمعه من 2-4 التجارب المستقلة لكل حاله عاليه أو منخفضه عيار مع n = 5-10 الفئران في التجربة. "الحقن الجراحي" يشير إلى الفئران التي تلقت البطن حقن الجراحية بالمنظار من الخلايا السرطانية 125,000. "وإذ تضع الورم" يشير إلى الفئران مع ورم البنكرياس. "انرولابل" يشير إلى نسبه الفئران الحاملة للورم في كل نقطه زمنيه مع حجم الورم > 20mm3. "الأورام البريتونية المصنفة" تشير إلى النسبة الاجماليه للفئران الحاملة للورم التي كان لها البذر المصاحب للأورام علي الجدار الصفاقي من حقن الخلايا السرطانية. تم استبعاد الفئران التي تقدم الأورام بشكل غير صحيح في الانسجه الأخرى غير البنكرياس (اي الكلي) من السكان "الحاملة للورم" (ولكنها مدرجه في مجموع الفئران المحقونة). ND ، لم يتحدد. تواتر البذر الجدار البريتوني مقارنه بين المجموعات العالية والمنخفضة عيار مجتمعه مقابل زرع الجراحية ، ف < 0.0029 عن طريق 2-الذيل T اختبار مع مان ويتني بعد الاختبار.
الشكل 4: الأورام UG-OTIM تلخص البيئة المجهرية السرطانية لفيلق حماية كوسوفو. يتم عرض الصور التمثيلية. الصف العلوي ، أورام الفيلق. الصف السفلي ، الأورام UG-OTIM في 5 أسابيع بعد زرع. (ا) التشريح الإجمالي للأورام الخبيثة عند الاستئصال. (B) H & E (10x ، شريط = 100μm) (ج) مناعي تلطيخ لCD3 (براون) (10x ، شريط = 100μm). (د) تلطيخ النيون المناعي من F4/80 (الأحمر) و dapi (الأزرق) (4x ، شريط = 500μm). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Discussion
ونعرض هنا ان استخدام الموجات فوق الصوتية عاليه الدقة لغرس خطوط خلايا murine PDA المباشرة في موقع الانسجه الاصليه هو بديل موثوق به لكل من فيلق حماية كوسوفو والانظمه الجراحية لنماذج العظام. تنتج UG-OTIM الأورام ذات الصلة بيولوجيا التي تحتفظ بالميزات المناعية لPDA مع اطار زمني مختصر لتشخيص الورم وحركيه نمو الورم الموثوقه. الموجات فوق الصوتية الحقن الموجهة يمكن بالتالي ان تكون أداه مفيده للإنتاج السريع من الفئران التي تحمل الأورام المساعد الشخصي الرقمي زرعها ، مما يسمح للتحقيق في تركيبات علاجيه في نموذج ذي صله سريريا.
الموجات فوق الصوتية-غرس الموجهة تقدم تحسينات هامه علي النماذج القياسية للتحقيق قبل السريرية. أولا ، يلغي هذا الاجراء الرصد المكثف للوقت لفئران فيلق حماية كوسوفو لتطوير الأورام العفوية عن طريق الغرس المباشر لخلايا المساعد الشخصي الرقمي بالبالكامل C57BL/6 في البنكرياس المريد. ثانيا ، علي غرار الحقن الجراحية التقليدية التقويمية ، ونهج UG-OTIM يسمح للسيطرة علي خط الخلية التي تم حقنها ، بما في ذلك اختيار خط الخلية الورم الأحادي و/أو التلاعب السابقة فيفو من خط الخلية ، فضلا عن السيطرة علي المضيف تلقي زرع الخلايا السرطانية. ثالثا ، هذه التقنية الطفيفة التوغل تتجنب العمل الشاق لجراحه البقاء علي قيد الحياة وتتجاوز فتره النقاهة المعقدة بعد العملية للحيوانات وكذلك الإشارات التهابيه من التئام الجروح الجراحية. وأخيرا ، الأورام UG-OTIM-علي غرار زرع الجراحية-تلخيص TME لاحظت في الفئران الفيلق ، بما في ذلك تسرب الخلايا المنخفضة T وتسرب عاليه الضامة. وهكذا ، يحتفظ نموذج UG-OTIM بالسمات الرئيسية لأورام فيلق حماية كوسوفو دون التعقيدات الاضافيه التي تؤخر التحقيقات العلاجية في نموذج فيلق حماية كوسوفو العفوي.
عدد من الخطوات الهامه في البروتوكول هي المفتاح لإتقان لنجاح هذه التقنية. الخبرة في التصوير بالموجات فوق الصوتية murine ضروري لهذا الاجراء ، ولكن البراعة اليدوية المطلوبة لزرع الخلايا بنجاح في البنكرياس هو مجموعه من المهارات التي يجب تطويرها بشكل مستقل. بالنسبة للفئران في دوره الضوء/الظلام التي مدتها 12 ساعة ، فان صيام الحشرات بين عشيه وضحيها ضمن المعدة والأمعاء تم تطهيرها من اي طعام غير مهضوم يمكن ان يمنع رؤية البنكرياس والكلي والطحال بالموجات فوق الصوتية. بالاضافه إلى ذلك ، يجب معايره كل خط خلوي يستخدم لحقن العظام قبل اجراء المزيد من التجارب لفهم حركيه النمو وتحديدال33المحتملة المنتشرة. اثناء الحقن ، واستخدام ملقط لقرصه الجلد في موقع الحقن خلق التوتر اللازمة لثقب بلطف من خلال كل من الجلد والجدار البريتوني. وكانت الخطوة الرئيسية في هذا الاجراء لتوجيه الابره بعناية في البنكرياس دون تثقيب الانسجه أو ثقب موقع خارج الهدف مثل الطحال أو الكلي. وكان تاكيد البلعه السائل أفضل مؤشر لحقن الخلايا السرطانية ناجحه في الانسجه السليمة. بعد الحقن ، يجب سحب الابره ببطء حتى لا يزعج السائل البولي. وجدنا ان سلسله من الحقن التجريبية باستخدام اما DMEM أو الأزرق تريبان ساعد علي تطوير إتقان المهارات الحركية الدقيقة اللازمة لهذا الحقن.
واثناء استكشاف الأخطاء وإصلاحها لهذا الاجراء ، حددنا عددا من العوامل التي أثرت علي نجاح البروتوكول. في التجارب التجريبية ، كان الخطا الأكثر شيوعا لدينا هو تثقيب الكلي اثناء الغرس ، والذي حدث بشكل أكثر تكرارا في تجاربنا المبكرة مما يوحي بان الممارسة المنتظمة لهذه المهارة تحسن الكفاءة. بالاضافه إلى ذلك ، وجدنا ان تاكيد وجود البلعه السائل بعد حقن الخلايا السرطانية عن طريق الموجات فوق الصوتية والتصور المباشر في تشريح اثناء مرحله استكشاف الأخطاء وإصلاحها تحسين تقنيه الحقن الناجحة. إذا لم يتم تاكيد تشكيل فقاعه عن طريق الموجات فوق الصوتية اثناء الحقن ، ويمكن تعديل موقع الابره قبل الاكتئاب تماما حقنه للإفراج عن البلعه المتبقية من الخلايا السرطانية. لاحظنا أيضا ان احجام التعليق حقن بسرعة كبيره أسفرت عن انسكاب الخلايا السرطانية في التجويف البريتوني أو انهيار السائل بوليوس في البنكرياس. عموما ، ذهبت هذه الكائنات لتطوير أورام البنكرياس باستثناء n = 7 الحيوانية التي أظهرت اي دليل علي الورم 4 أسابيع بعد الحقن. تم الإبلاغ عن هذه النتيجة فقط في محاولاتنا الاولي (وتم حقن 6/7 الحيوانية مع انخفاض عيار من الخلايا السرطانية). يجب مراقبه الفئران التي لديها حقن الخلايا السرطانية مشكوك فيها ، أو تتطلب أعاده تموضع الابره ، عن كثب لتطوير الأورام خارج البنكرياس.
وتتمثل القيود الرئيسية للأسلوب الموجه فوق الصوتية في توافر الاداات المطلوبة والمهارة التقنية المرتبطة بغرس الأورام. الاجراء ليس معقما تماما ، كما يتم حقن الماوس غير معقم علي منصة الموجات فوق الصوتية ، مع حقنه وطرف ابره يمر من خلال هلام الموجات فوق الصوتية. علي الرغم من اننا لم نر اي دليل علي وجود عدوي في n = 148 الفئران عبر ما مجموعه 8 تجارب مستقله منذ بدء هذه الدراسات ، فمن الممكن ان العامل المعدية يمكن ان تدخل البنكرياس من خلال ابره الحقن خلال هذه العملية. علي هذا النحو ، يجب رش العديد من جوانب البروتوكول قدر الإمكان (بما في ذلك القفازات ، وأسطح الموجات فوق الصوتية ، وصناديق الثلج) مع مطهر أو 70 ٪ الايثانول للحد من التعرض المحتمل لمسببات الامراض. ومن القيود الاضافيه علي البروتوكول الحالي عدم وجود ورم خبيث باستخدام خط الخلية 4662 في التخفيفات الحالية. وينبغي معايره كل خط خلوي يستخدم في نظام UG-OTIM لمعدلات النمو المرجوة فضلا عنال33المحتملة المنتشرة. وأخيرا ، إنشا بروتوكولنا الحالي تقنيات لحقن الخلايا السرطانية في تعليق أحاديه الخلية. ومع ذلك ، فان أضافه الركيزة مصفوفة خارج الخلية يمكن ان تضاف إلى احتمال تعزيز إنشاء الورم ومنع تسرب الخلايا السرطانية (كما يتم استخدامه في نماذج زرع الجراحية27،30،31،32). التالي ، يمكن التغلب علي العديد من القيود المفروضة علي UG-OTIM مع الاختبار المناسب للخطوط الخلوية المستخدمة في حقن العظام.
وباختصار ، فان نموذج UG-OTIM هو طريقه دقيقه لحقن الخلايا السرطانية الموجهة للانسجه في البنكرياس المريد. هذه التقنية غرس الحد الأدنى الغازية فوائد كل من المحقق والحيوانية عن طريق الحد من الوقت الاجراء ، والحد من مضاعفات ما بعد الجراحة وتحسين دقه الحقن. الأورام الناجمة عن حقن UG-OTIM تحتفظ بالسمات المناعية المميزة لأورام الفيلق العفوية ، ولها وقت موثوق لظهور الورم ، وحركيه نمو الورم القابلة للتكرار. التالي يمكن استخدام نموذج UG-OTIM بطريقه عاليه الانتاجيه نسبيا لاستجواب التركيبات العلاجية في وضع ما قبل السريرية للكشف عن العلاجات الجديدة للمرضي الذين يعانون من أكبر حاجه سريريه لم تلب.
Disclosures
ولم يفصح صاحبا البلاغ عن ذلك.
Acknowledgments
ويود أصحاب البلاغ ان يشكروا الدكتور روبرت فونديرهايد وجميع أعضاء مختبر فونديرهايد ، وجميع أعضاء مستشفي الفئران المصابة بسرطان البنكرياس ، والدكتور بن ستانغر ، ومركز بحوث سرطان البنكرياس في جامعه بنسلفانيا ، وديدورا ديلمان مناقشات مفيده. ويدعم هذا العمل عن طريق التمويل من معهد باركر للسرطان العلاج المناعي جائزه زميل (KTB) ومركز أبحاث سرطان البنكرياس في جامعه بنسلفانيا (CC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Conicals | Thomas Scientific | 2602A26 | |
| Blunt edged forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Cell Dissociation Buffer | Thermo-Fisher | 13151014 | |
| Cotton Tipped swabs | Thermo-Fisher | 19062614 | |
| Covidien Monoject 3/10mL, 29G X 1/2" | Thermo-Fisher | 8881600145 | |
| Depilatory Agent | Amazon | Nair Body Lotion | |
| DMEM | Thermo-Fisher | 10-566-016 | |
| FBS | Gemini Bio-oroducts | 100-106 | |
| Flask | Sigma-Aldrich | CLS430825 | |
| Forceps (blunt edge) | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Gauze | Fisher | 13-761-52 | |
| Gentamicin | Thermo-Fisher | 15750060 | |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Isofluorane | Penn Vet Supply | VED1350 | |
| Isofluorane Vaporizer | VetEquip | 911103 | |
| L-glutamine | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Optixcare | MidWest Veterinary Supply | 052.50310.3 | |
| Paper Tape | Medline | MMM1530Z5 | |
| PBS | Thermo-Fisher | 14-190-250 | |
| Slide warmer | C&A Scientific | XH-2001 | |
| Sterilant (Clidox-S) | Fisher Scientific | NC0332382 (activator) NC9189926 (base) | Needs to be combined according to manufacturer's instructions |
| Sterile Alcohol prep pad | Covidien | 6818 | |
| Trypsin | Thermo-Fisher | 15090046 | |
| Ultrasound gel | Thermo-Fisher | 03-34-1LT | |
| Visualsonics Ultrasound Vevo 2100 | Visual Sonics | Vevo 2100 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Chao, T., Furth, E. E., Vonderheide, R. H. CXCR2-Dependent Accumulation of Tumor-Associated Neutrophils Regulates T-cell Immunity in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Immunology Research. 4 (11), 968-982 (2016).
- Steele, C. W., et al. CXCR2 Inhibition Profoundly Suppresses Metastases and Augments Immunotherapy in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. 29 (6), 832-845 (2016).
- Li, J., et al. Tumor Cell-Intrinsic Factors Underlie Heterogeneity of Immune Cell Infiltration and Response to Immunotherapy. Immunity. 49 (1), 178-193 (2018).
- Beatty, G. L., et al. Exclusion of T Cells From Pancreatic Carcinomas in Mice Is Regulated by Ly6C(low) F4/80(+) Extratumoral Macrophages. Gastroenterology. 149 (1), 201-210 (2015).
- Bayne, L. J., et al. Tumor-derived granulocyte-macrophage colony-stimulating factor regulates myeloid inflammation and T cell immunity in pancreatic cancer. Cancer Cell. 21 (6), 822-835 (2012).
- Beatty, G. L., et al. CD40 agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreatic carcinoma in mice and humans. Science. 331 (6024), 1612-1616 (2011).
- Lo, A., et al. Tumor-Promoting Desmoplasia Is Disrupted by Depleting FAP-Expressing Stromal Cells. Cancer Research. 75 (14), 2800-2810 (2015).
- Rhim, A. D., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 25 (6), 735-747 (2014).
- Ozdemir, B. C., et al. Depletion of Carcinoma-Associated Fibroblasts and Fibrosis Induces Immunosuppression and Accelerates Pancreas Cancer with Reduced Survival. Cancer Cell. 28 (6), 831-833 (2015).
- Clark, C. E., et al. Dynamics of the immune reaction to pancreatic cancer from inception to invasion. Cancer Research. 67 (19), 9518-9527 (2007).
- Stromnes, I. M., Hulbert, A., Pierce, R. H., Greenberg, P. D., Hingorani, S. R. T-cell Localization, Activation, and Clonal Expansion in Human Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Immunology Research. 5 (11), 978-991 (2017).
- Morrison, A. H., Byrne, K. T., Vonderheide, R. H. Immunotherapy and Prevention of Pancreatic Cancer. Trends in Cancer. 4 (6), 418-428 (2018).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
- Yip-Schneider, M. T., et al. Dimethylaminoparthenolide and gemcitabine: a survival study using a genetically engineered mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 13, 194 (2013).
- Frese, K. K., et al. Nab-Paclitaxel potentiates gemcitabine activity by reducing cytidine deaminase levels in a mouse model of pancreatic cancer. Cancer Discovery. 2 (3), 260-269 (2012).
- Stromnes, I. M., et al. T Cells Engineered against a Native Antigen Can Surmount Immunologic and Physical Barriers to Treat Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. 28 (5), 638-652 (2015).
- Byrne, K. T., Vonderheide, R. H. CD40 Stimulation Obviates Innate Sensors and Drives T Cell Immunity in Cancer. Cell Reports. 15 (12), 2719-2732 (2016).
- Winograd, R., et al. Induction of T-cell Immunity Overcomes Complete Resistance to PD-1 and CTLA-4 Blockade and Improves Survival in Pancreatic Carcinoma. Cancer Immunology Research. 3 (4), 399-411 (2015).
- Keenan, B. P., et al. A Listeria vaccine and depletion of T-regulatory cells activate immunity against early stage pancreatic intraepithelial neoplasms and prolong survival of mice. Gastroenterology. 146 (7), 1784-1794 (2014).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
- Maddipati, R., Stanger, B. Z. Pancreatic Cancer Metastases Harbor Evidence of Polyclonality. Cancer Discovery. 5 (10), 1086-1097 (2015).
- Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. The evolving relationship of wound healing and tumor stroma. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (18), (2018).
- Kasper, M., et al. Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (10), (2010).
- Stuelten, C. H., et al. Acute Wounds Accelerate Tumorigenesis by a T Cell-Dependent Mechanism. Cancer Research. 68 (18), (2008).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods of Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Moreno, J. A., Sanchez, A., Hoffman, R. M., Nur, S., Lambros, M. P. Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models and Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Huynh, A. S., et al. Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound-guided injection of cells. Public Library of Science One. 6 (5), e20330 (2011).
- Thomas, T. T., et al. Utilization of Ultrasound-guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Jager, W., et al. Minimally invasive establishment of murine orthotopic bladder xenografts. Journal of Visualized Experiments. (84), e51123 (2014).
- Aiello, N. M., Rhim, A. D., Stanger, B. Z. Orthotopic injection of pancreatic cancer cells. , Cold Spring Harbor Protocols. (2016).
