Summary
Describimos un protocolo para la implantación guiada por ultrasonido de líneas celulares de adenocarcinoma ductal pancreático derivados de la murino directamente en el sitio del tumor nativo. Este enfoque resultó en tumores pancreáticos detectables por la ecografía dentro de 2-4 semanas de la inyección, y redujo significativamente la proporción de la sesión de células tumorales en la pared peritoneal en comparación con la implantación ortotópica quirúrgica.
Abstract
El reciente éxito del bloqueo del punto de control inmune en el melanoma y el adenocarcinoma pulmonar ha galvanizado el campo de la inmunooncología y ha revelado las limitaciones de los tratamientos actuales, ya que la mayoría de los pacientes no responden a la inmunoterapia. El desarrollo de modelos preclínicos precisos para identificar rápidamente combinaciones terapéuticas novedosas y eficaces es fundamental para abordar esta necesidad clínica insatisfecha. El adenocarcinoma ductal pancreático (PDA) es un ejemplo canónico de un tumor resistente al bloqueo del punto de control inmune con solo el 2% de los pacientes que responden a la inmunoterapia. El KrasG12D+/-con ingeniería genética; Trp53R172H+/-; Pdx-1 Cre (KPC) modelo de ratón de PDA recapitula la enfermedad humana y es una herramienta valiosa para evaluar terapias para la inmunoterapia resistente en el entorno preclínico, pero el tiempo hasta el inicio del tumor es altamente variable. Los modelos quirúrgicos de implantación tumoral ortotópica de PDA mantienen las señas de identidad inmunobiológicas del microambiente tumoral específico del tejido KPC (TME), pero requieren un procedimiento intensivo en tiempo e introducen inflamación aberrante. Aquí, utilizamos un modelo de implantación de tumores ortotópicos guiadopor por ultrasonido (UG-OTIM) para inyectar de forma no invasiva líneas celulares PDA derivadas de KPC directamente en el páncreas del ratón. Los tumores UG-OTIM crecen en el sitio del tejido endógeno, recapitulan fielmente las características histológicas del PDA TME y alcanzan tumores del tamaño de la inscripción para estudios preclínicos en cuatro semanas después de la inyección con una sembración mínima en la pared peritoneal. El sistema UG-OTIM descrito aquí es un modelo tumoral rápido y reproducible que puede permitir un análisis de alto rendimiento de nuevas combinaciones terapéuticas en el PDA TME murino.
Introduction
El adenocarcinoma ductal pancreático (PDA) es una enfermedad notoriamente agresiva que es refractaria a los tratamientos actuales, con una triste tasa de supervivencia de 5 años de 9%1. PDA recientemente superó el cáncer de mama para convertirse en la tercera causa de mortalidad relacionada con el cáncer en los Estados Unidos y se proyecta que se convertirá en la segunda causa principal (solo detrás del cáncer de pulmón) para el año 20302. Una serie de características características del microambiente tumoral de PDA inmunológicamente 'frío' (TME)-incluyendo la alta infiltración de las poblaciones de células mieloides inmunosupresoras3,4,5,6,7, densa deposición estromal8,9,10,11, y una escasez de células T5,12,13-contribuyen a el fracaso de las inmunoterapias en PDA14. Con este fin, el uso de un modelo animal clínicamente relevante es una herramienta esencial para investigar la eficacia de nuevas combinaciones de fármacos para tumores inmunológicamente fríos in vivo.
El KrasG12D+/-con ingeniería genética; Trp53R172H+/-; Pdx-1 Cre (KPC) modelo de ratón de PDA recapitula fielmente aspectos clínicos destacados de PDA humano, incluyendo los factores moleculares de la enfermedad y características histopatológicas15. Los tumores de KPC se desarrollan espontáneamente en ratones totalmente inmunocompetentes, lo que permite interrogar enfoques terapéuticos como quimioterapia16,17,inmunoterapia18,19,20,21,y terapia de focalización de estroma9,11,22invivo antes de la administración de estos fármacos en el entorno del ensayo clínico. A pesar de sus muchas fortalezas como modelo preclínico de PDA, el uso de ratones KPC se desfavorea por la progresión altamente variable del desarrollo tumoral espontáneo, ya que la aparición del tumor puede oscilar entre 4 y 40 semanas (por lo que requiere el mantenimiento de una gran colonia de cría)15. Además, los ratones KPC tienen el potencial de tumores primarios policlonales23,y hay una rápida disminución de la salud animal y un aumento de las co-morbilidades incluyendo caquexia y ascitis a medida que la enfermedad progresa15.
Una alternativa al modelo de ratón KPC espontáneo es utilizar un modelo de implantación ortotópica de PDA24. La implantación quirúrgica directa de líneas celulares tumorales en el sitio del tejido nativo es un método más rentable y predecible para recapitular el microambiente tumoral específico del tejido (TME) de PDA. La implantación tumoral permite la inyección de líneas celulares tumorales clonales a ratones genéticamente cruzados5,lo que permite que los ratones huésped con manipulaciones genéticas adicionales que llevarían mucho tiempo se reproduzcan en el modelo de ratón KPC. Sin embargo, la implantación de tumores pancreáticos requiere un procedimiento quirúrgico intensivo en mano de obra que introduce inflamación aberrante en el sitio de la sutura en la pared abdominal24,25,26,y a menudo incluye una larga recuperación postoperatoria27,28,29.
Los avances tecnológicos en imágenes por ultrasonido mediante transductores específicos para roedores proporcionan imágenes de alta resolución en tiempo real. Guiado por la ecografía del movimiento de la aguja de inyección en la cavidad peritoneal, se pueden implantar específicamente células tumorales en el páncreas, aprovechando los beneficios de las inyecciones tumorales ortotópicas en ausencia de implantación quirúrgica e inflamación asociada. Este enfoque, llamado modelo de implantación de tumores ortotópicos guiados por ultrasonido (UG-OTIM) se ha establecido previamente en modelos de xenoinjerto de cáncer pancreático30, así como en varios otros modelos de cáncer, incluyendo sarcoma de Ewing, neuroblastoma y cáncer de vejiga31,32.
Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para realizar inyecciones guiadas por ultrasonido de líneas celulares tumorales en el páncreas murino. Mostramos los tumores resultantes recapitular las características histológicas e inmunológicas de la KPC TME y, por lo tanto, se pueden utilizar para investigar nuevas combinaciones terapéuticas, incluidas las inmunoterapias, para revelar rápidamente los tratamientos más prometedores para moverse avance en los ensayos clínicos.
Protocol
Los protocolos animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pensilvania. Se compraron ratones C57Bl/6 femeninos de 5 a 6 semanas (ver Tabla de Materiales)y se utilizaron después de 1-3 semanas de descanso. El Laboratorio Universitario de Recursos Animales supervisó el cuidado de los animales.
1. Preparación de líneas celulares tumorales PDA para inyección
- Cultivar la línea celular PDA derivada de KPC en medios de células tumorales (TC): Medio águila modificada (DMEM) de Dulbecco complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2mM de L-glutamina y gentamicina de 83 g/ml.
- Permita que las células crezcan hasta un 80-85% de confluencia en matraces mantenidos a 37oC y 5%CO2.
- Una vez que las células alcanzan una confluencia ideal, decantar los medios de los matraces y lavar dos veces con solución salina caliente (37oC), estéril con fosfato tampón (PBS), suficiente para cubrir la monocapa de las células adherentes. Pipeta de PBS restante después del lavado final.
- Añadir una solución cálida (37oC) 0,05% de trippsina-EDTA (0,5% de stock de trippsina-EDTA diluida 1:10 en tampón de disociación de células sin enzimas a base de Hanks) para cubrir la monocapa en cada matraz e incubar a 37oC durante 3-5 minutos o hasta que las células se seden con golpes en los lados del Frasco.
- Añadir 10-25 ml de medios de TC estériles (4oC) a cada matraz para detener la reacción de trippsinización. Vierta la suspensión celular en un cónico(s) de 50 ml, llene a 50 ml con medios TC fríos.
- Centrífuga a 300g durante 5 minutos a 4oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en DMEM estéril y frío (sin suero). Si se utilizaron varios tubos cónicos para recoger células, todos los pellets se pueden combinar en un solo cónico en este paso.
- Centrífuga a 300g durante 5 minutos a 4o.
- Repita los pasos 1.6-1.7 dos veces. En el lavado final, tome una alícuota de células para contar. Se recomienda la viabilidad celular del 90 % para las inyecciones in vivo.
- Preparar una suspensión uniforme de las células tumorales PDA a la concentración deseada de células tumorales. Utilizamos 10-20 x 106 células/ml (250.000 a 500.000 celdas/25 ol) en la cantidad apropiada de DMEM o PBS estériles y fríos, pero cada línea celular debe ser valorada in vivo.
- Mantenga las células frías, sobre hielo, hasta que estén listas para inyectarse.
2. Preparación prequirúrgica de ratones
NOTA: Se recomienda realizar este paso 24 horas antes del procedimiento.
- Coloque las jaulas que contengan ratones experimentales en un calentador establecido a 37 oC.
- Obtenga jaulas nuevas y limpias y colóquelas en una segunda plataforma de calentamiento establecida en 37oC.
- Limpie a fondo el gabinete de seguridad biológica, la cámara de inducción y la etapa de ultrasonido (EE.UU.) con esterilizante (ver Tabla de Materiales).
- Gire la función de calentamiento de la etapa de EE. UU. a 37oC.
- Encienda la máquina de anestesia: ajuste los diales del divisor de tubo para que el flujo de aire esté restringido únicamente a la cámara de inducción. Encienda el tanque de oxígeno y ajuste al caudal a 1 L/min. Encienda el vaporizador de isoflurano a 2-3%.
- Coloque un solo ratón en la cámara de inducción. Supervise el ratón hasta que ya no esté móvil y la respiración se haya ralentizado.
- Ajuste los diales en el divisor de modo que se permita el flujo de aire tanto a la cámara de inducción como al cono de la nariz. Mueva rápidamente el ratón de la cámara de inducción y ponerlo en la recumbencia ventral en la etapa cálida de los Estados Unidos con su hocico en el cono de la nariz.
- Pruebe el nivel de inducción observando cualquier respuesta reflexiva al pellizco de los dedos de los dedos. Si no hay ninguno, el ratón está listo para la depilación.
- Coloque una pequeña cantidad de lubricante para los ojos (ver Tabla de Materiales)en ambos ojos para prevenir la deshidratación de los tejidos. Gire el ratón para que quede en la recumbencia dorsal en el escenario. Adherir suavemente las extremidades superior e inferior al escenario con cinta adhesiva para maximizar la exposición del abdomen y asegurar el ratón al escenario.
- Utilice un aplicador estéril de punta de algodón para aplicar una generosa crema depilatoria de capa en el cuadrante superior izquierdo del abdomen. El depilatorio debe aplicarse en la zona general del bazo y extenderse hacia la línea media. Deja que te sentas un minuto.
- Pruebe el grado de depilación utilizando suavemente el extremo opuesto del aplicador de punta de algodón para limpiar la crema depilatoria, una vez que se retire fácilmente, limpie el abdomen con una gasa seca. Luego moje una capa limpia de gasa con una pequeña cantidad de salina caliente y limpie el área una vez más para eliminar completamente el agente depilatorio. No exceda los 2 minutos completos de contacto directo sobre la piel del ratón para reducir la posibilidad de quemaduras químicas.
- Una vez que el cabello se ha quitado lo suficiente del abdomen, vuelva a colocar el ratón en una jaula nueva y limpia en el calentador.
- Mientras que el primer animal está sometido a la depilación en la etapa de Estados Unidos, el siguiente animal se puede añadir a la cámara de inducción.
- Antes de anestesiar la siguiente jaula de ratones, apague el isoflurano y enjuague la cámara de inducción con oxígeno. Limpie la cámara de inducción y el cono de etapa/nariz de EE. UU. con esterilizante. Repita los pasos 2.5-2.14 hasta que todas las jaulas y ratones hayan sufrido depilación.
NOTA: Los animales en ayunas por abstinencia temporal de alimentos durante un período antes de la implantación se pueden considerar para minimizar la obstrucción visual de los órganos abdominales debido a alimentos no digeridos en el estómago y los intestinos (12-24 horas). No se recomienda la restricción de agua. Si los animales son ayunados, se recomienda que sean tratados con una inyección de 1 ml de calor (37 oC), solución salina estéril después de la inyección tumoral con el fin de prevenir la deshidratación.
3. Implantación guiada por ultrasonido de células PDA
NOTA: Todos los procedimientos de ultrasonido se realizan utilizando una máquina de imágenes por ultrasonido y un software (ver Tabla de Materiales). El transductor tiene una frecuencia central de 40 MHz y un ancho de banda de 22-55 MHz.
- Ajuste la plataforma de ultrasonido de tal manera que la superficie de la plataforma sea paralela al suelo y el investigador se dirija hacia el lado izquierdo del animal, con la cabeza del animal a la derecha. Ajuste la posición del transductor para obtener una imagen abdominal transversal(Figura 1A).
- Anestetizar el ratón para ser inyectado como se describe en los pasos 2.1-2.8. Estabilice el ratón en la plataforma estadounidense como se describe en el paso 2.9.
- Aplica una generosa cantidad de gel de ultrasonido caliente (37oC) en la sección sin pelo del abdomen.
- Baje suavemente el transductor para ponerse en contacto con el abdomen del ratón. Ajuste el transductor según sea necesario hasta que el páncreas sea claramente visible. Localice el riñón izquierdo y el bazo para proporcionar una orientación precisa de la cavidad abdominal.
NOTA: Debido a que se ha cambiado la posición del transductor para permitir el acceso al lado izquierdo del abdomen, los ejes X e Y de los controles del escenario ahora se invierten. - Cargue una jeringa de insulina de 29G x 1/2" (ver Tabla de Materiales)con 25 oL de suspensión de células tumorales. Limpie la punta de la aguja con una almohadilla de preparación de alcohol estéril antes de la inyección para minimizar la sesión de células tumorales en la pared abdominal.
- Con fórceps de borde contundente, agarre la piel y la pared peritoneal para aumentar la tensión en el lugar de inyección deseado. Sosteniendo la jeringa en un ángulo de aproximadamente 25o-45o a la superficie de la plataforma de ultrasonido, adelantado lentamente la aguja a través de la piel y la pared peritoneal. Confirme que la aguja se ha perforado a través de la pared peritoneal antes de continuar con el siguiente paso. Un pequeño pop debe sentirse mientras la aguja perfora la pared peritoneal.
- En la visualización por ultrasonido, guíe la aguja directamente hacia el páncreas(Figura 1B-C). Confirme que la aguja está dentro del tejido del páncreas moviendo suavemente el barril de la jeringa hacia arriba y hacia abajo. Si la colocación es correcta, la punta de la aguja permanecerá dentro del tejido del páncreas mientras el barril de la jeringa se está moviendo.
- Inyectar lentamente las células tumorales y confirmar que las células se están implantando en el lugar deseado mediante la formación de un bolo líquido dentro del páncreas (visible en la pantalla de ultrasonido, Figura 1D).
NOTA: Se debe sentir cierta resistencia mientras se deprime el émbolo. Tenga cuidado de no perforar el páncreas varias veces, ya que esto aumenta la probabilidad de fugas en la cavidad abdominal. - Una vez que se ha inyectado el volumen completo de la suspensión y se puede ver un bolo líquido en el páncreas, mantener la aguja muy quieta durante varios segundos. Retraiga lentamente la aguja del abdomen del ratón, teniendo mucho cuidado de no molestar a las células inyectadas.
- Coloque el ratón en una jaula limpia y cálida y asegúrese de que el ratón se recupere completamente de la anestesia. Repita este proceso para todos los animales.
- Antes de anestesiar el siguiente ratón, limpie la cámara de inducción y el cono de etapa/nariz de EE. UU. con esterilizante.
- Repita los pasos 3.2-3.11 hasta que se hayan inyectado todos los ratones.
Representative Results
El objetivo de este informe era proporcionar un protocolo detallado para realizar la implantación guiada por ultrasonido de líneas celulares PDA derivadas de KPC. En los experimentos representativos mostrados en la Figura 2-4, confirmamos que los tumores UG-OTIM crecen a un ritmo constante y de manera dependiente de la dosis. Además, demostramos que los tumores UG-OTIM recapitulan las características inmunológicas e histológicas del KPC TME. Por lo tanto, el sistema UG-OTIM es un modelo de ratón PDA preclínico que se puede utilizar de una manera de alto rendimiento para examinar rápidamente nuevas combinaciones de tratamiento in vivo.
Utilizando el protocolo UG-OTIM descrito aquí, los ratones fueron preparados para la implantación, asegurados a la plataforma de ultrasonido calentado y las posiciones tanto de la plataforma como del transductor se ajustaron para este procedimiento como se muestra en la Figura 1A. Se utilizaron imágenes por ultrasonido de alta resolución para identificar un lugar de inyección dentro del páncreas del ratón que podría ser dirigido sin perforación del riñón o del bazo(Figura 1B). Bajo visualización ultrasonográfica, la aguja se introdujo cuidadosamente en la cavidad abdominal a través de la pared peritoneal y se guió hacia el páncreas del ratón(Figura 1C). Después de la correcta colocación de la aguja, la suspensión de la célula tumoral se inyectó muy lentamente en el páncreas. Una implantación exitosa se confirmó por la presencia de una burbuja dentro del páncreas(Figura 1D). En los primeros experimentos, el ratón fue sacrificado, y la eficacia del procedimiento se verificó visualizando directamente un bolo fluido en el tejido bruto del páncreas(Figura 1E).
La implantación y la tasa de crecimiento del tumor se monitorizaron mediante imágenes por ultrasonido semanales. Las implantaciones exitosas produjeron tumores que estaban contenidos dentro de los bordes del páncreas durante el tiempo del experimento(Figura 2A). El software de ultrasonido (ver Tabla de Materiales)utilizado permitió determinar el área y el volumen del tumor para cada punto de tiempo, así como para el mapeo 3D de tumores medidos que se generarán(Figura 2B),y las imágenes 3D se confirmaron en el momento de la necropsia del ratón(Figura 2C). Una inyección celular inadecuada durante el procedimiento UG-OTIM puede dar lugar al desarrollo de un tumor de pared peritoneal (una imagen representativa de la cual se muestra en la Figura 2D). Los ratones que presentan tumores peritoneales pueden ser excluidos de estudios posteriores.
Para determinar la concentración de células óptimas para su uso en estudios preclínicos, se inyectó una línea celular PDA derivada de C57Bl/6 KPC (4662)9 en ratones ingenuos de tipo salvaje C57Bl/6 a través de seis experimentos independientes. Esta línea celular (pasajeada in vitro seis veces) se deriva de un ratón con tumores KPC completamente cruzado (>10 generaciones, confirmado por el análisis SNP19)para prevenir los antígenos de rechazo tumoral complejo de histocompatibilidad molecular. Las células tumorales se inyectaron a un titer bajo (1,25 x 106 células/25 l) y a una dosis alta de titer (5 x 106 células/25 ol). Las inyecciones de tumores de marea alta dieron lugar a una mayor proporción de animales portadores de tumores tres semanas después de las inyecciones en comparación con la cohorte de mareas bajas(Figura 3A). A pesar del retraso en la aparición del tumor, la tasa global de crecimiento del tumor no fue significativamente diferente entre las dos dosis(Figura 3B). Del mismo modo, si bien la tasa de supervivencia entre las dos cohortes no fue significativamente diferente, la tendencia de los datos hacia una supervivencia ligeramente mejorada en la cohorte de los mareas bajas(Figura 3C). La cohorte de mareas altas también produjo una mayor proporción de ratones con tumores que fueron instables en estudios preclínicos (designados en un volumen tumoral de 20 mm3) en cuatro semanas después de la inyección que la cohorte de marea baja(Figura 3D). La mayoría de los ratones de cohortes de mareas altas y bajas presentaron tumores enrollables para el día 25 y desarrollaron síntomas de la enfermedad en etapa terminal, incluida la ascitis (datos no mostrados). Las metástasis, que no se producen utilizando 4662 en las dosis celulares de este protocolo, pueden modelarse con diferentes líneas o dosis celulares33.
El método UG-OTIM requería un dominio de las habilidades motoras finas para localizar con precisión el sitio de inyección deseado, lo que fue un reto en nuestros primeros experimentos. Por esta razón, incluimos una tabla que describe el número de animales que desarrollaron tumores dentro del páncreas (implantes exitosos) en comparación con el número total de animales que se sometieron a implantes tumorales guiados por ultrasonido(Tabla 1). Los animales fueron eliminados de análisis futuros si los tumores se desarrollaron en un lugar no deseado (es decir, riñón) o si no había evidencia de tumor en seis semanas después de la inyección, como se indica. La progresión semanal de la proporción de ratones que llevan tumores pancreáticos increibles (volumen tumoral de 20 mm3) de cada experimento también se muestra en la Tabla 1.
Para determinar si hubo un beneficio al utilizar el enfoque UG-OTIM en lugar del modelo ortotópico quirúrgico tradicional (más allá de la inversión en el tiempo después de obtener competencia en la técnica), comparamos la sembración de tumores PDA en la pared peritoneal de ratones después de cada procedimiento. Encontramos que sólo 2/31 ratones (6.5%) desarrollaron tumores de pared peritoneal no intencional después de las inyecciones de UG-OTIM, en comparación con 7/15 ratones que desarrollaron tumores de pared peritoneal después de la inyección quirúrgica (46,6%, p < 0,0029) (Tabla 1). Por lo tanto, la tasa de sembración de tumores adicionales en el peritoneo se reduce en gran medida en el método UG-OTIM en comparación con la implantación quirúrgica.
Tras el sacrificio de ratones con tumores UG-OTIM, encontramos que la anatomía gruesa de los tumores era similar a los tumores espontáneos de KPC(Figura 4A). El análisis histológico demostró un patrón de estructuras ductales anormales que era similar en ambos modelos y que recapitulaba la morfología de la enfermedad humana(Figura 4B). Para investigar el infiltrado inmune dentro de los tumores KPC y UG-OTIM, se teñiron muestras histológicas representativas para CD3 (expresado por células T) y F4/80 (expresado por macrófagos). En ambos modelos, los patrones de tinción revelaron tumores que estaban mal infiltrados por las células T(Figura 4C),pero altamente infiltrados por los macrófagos(Figura 4D). Este hallazgo es consistente con el fenotipo inmunológicamente frío de la mayoría de las muestras de PDA humanas y KPC5,7,12.
Figura 1: Implantación guiada por ultrasonido de células PDA en el páncreas murino. (A) Orientación del ratón, la etapa de ultrasonido y la sonda de ultrasonido utilizada para obtener una imagen de alta resolución de los órganos abdominales. Tenga en cuenta que el escenario y la plataforma se han girado 90o desde la orientación estándar para permitir un fácil acceso al cuadrante superior izquierdo del abdomen del ratón. (B) Imagen ultrasonográfica que representa la identificación de riñón, bazo y páncreas. Aquí la aguja de inyección se coloca contra el abdomen del ratón. (C) Imagen ultrasonográfica que representa la aguja dentro del páncreas del ratón. (D) Imagen ultrasonográfica que representa la burbuja en el lugar de inyección (esbozada en azul) después de la inyección controlada de células tumorales en el páncreas. (E) Laparotomía que revela el bolo líquido que contiene células PDA en el páncreas después de la inyección guiada por ultrasonido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Seguimiento del crecimiento del tumor después de la inyección de UG-OTIM. (A) Imagen ultrasonográfica representativa del tumor UG-OTIM (esbozada en azul) a las 2, 3 y 5 semanas posteriores a la inyección, como se indica. (B) Representante reconstruyó la imagen 3D del tumor UG-OTIM 5 semanas después de la inyección utilizando el software de ultrasonido. (C) Anatomía bruta representativa del tumor UG-OTIM 5 semanas después de la inyección en la necropsia del ratón. (D) Imagen ultrasonográfica representativa de un tumor de pared peritoneal que crece en la capa subcutánea después de una inyección celular inadecuada a las 7 semanas posteriores a la inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Inicio dependiente de la dosis de tumores ininscribibles después de la inyección guiada por ultrasonido de células PDA. (A) Proporción de ratones portadores de tumores en los puntos de tiempo indicados después de la inyección, tal como se describe en la Figura 1 con células tumorales de marea alta (500.000 células/25 ol) o titer bajo (125.000 células/25 ol), como se indica. (B) Cinética de crecimiento tumoral de ratones de (A), cada símbolo representa un grupo de ratones, las barras de error indican SEM. (C) Proporción de ratones de (A) vivos en los puntos de tiempo indicados después de la inyección. Los ratones fueron eutanasiados o censurados si los tumores eran >1000mm3 o la condición corporal era deficiente debido a las comorbilidades tumorales. (D) Tiempo de inicio de tumor ininscribible para ratones desde (A). Los tumores que se pueden inscribir se consideran de 20 mm3 de volumen. Representante de datos de 4 experimentos independientes con ratones/experimentos n.o 8-20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Experimento | Pancreas-tumor rodamiento/inyecciones totales | Semana 1 (Inscripble) | Semana 2 (Inscripble) | Semana 3 (Enrollable) | Semana 4 (Enrollable) | Tumores peritoneales sembrados |
| High Titer | 24/31 | Nd | 8/24 (3/24) | 15/24 (7/24) | 23/23 (20/23) | 2/20 |
| Titer bajo | 11/17 | Nd | 3/11 (0/11) | 6/11 (3/11) | 9/11 (5/11) | 0/11 |
| Inyección quirúrgica | 15/17 | Nd | Nd | 15/15 (9/15) | 15/15 (14/15) | 7/15 |
Tabla 1: Número de tumores UG-OTIM exitosos en comparación con la implantación quirúrgica. Datos combinados de 2-4 experimentos independientes por condición de titer alto o bajo con ratones n.o 5-10 por experimento. La "inyección quirúrgica" indica ratones que recibieron inyección quirúrgica laparoscópica abdominal de 125.000 células tumorales. "Tumores" indica ratones con un tumor pancreático. "Enrollable" indica la proporción de ratones portadores de tumores en cada punto de tiempo con un volumen tumoral >20mm3. "Tumores peritoneales sembrados" indica la proporción total de ratones portadores de tumores que tenían la sembración concomitante de tumores en la pared peritoneal a partir de la inyección de células tumorales. Los ratones con tumores que se presentaban incorrectamente en tejidos distintos del páncreas (es decir, riñón) fueron excluidos de las poblaciones "portadoras de tumores" (pero incluidos en ratones inyectados en total). ND, no determinado. Frecuencia de las semillas de pared peritoneal comparando los grupos de títeres altos y bajos combinados frente a la implantación quirúrgica, p < 0.0029 a través de la prueba T de 2 colas con la post-prueba de Mann-Whitney.
Figura 4: Los tumores UG-OTIM recapitulan el microambiente tumoral de KPC. Se muestran imágenes representativas. En la fila superior, tumores de KPC. En la fila inferior, tumores UG-OTIM a las 5 semanas después de la implantación. (A) Anatomía bruta de los tumores extirpados en la necropsia. (B) H&E (10X, bar-100m) (C) Tinción inmunohistoquímica para CD3 (marrón) (10X, bar-100m). (D) Tinción inmunofluorescente de F4/80 (rojo) y DAPI (azul) (4X, bar-500m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Aquí mostramos que el uso de la ultrasonografía de alta resolución para dirigir la implantación de líneas celulares DEDa murinas al sitio de tejido autóctono es una alternativa confiable tanto a los sistemas de modelos ortopédicos de KPC como quirúrgicos. UG-OTIM produce tumores biológicamente relevantes que conservan las características inmunopatológicas del PDA con un plazo más corto al diagnóstico de tumores y cinética de crecimiento tumoral confiable. Por lo tanto, la inyección guiada por ultrasonido puede servir como una herramienta útil para la producción rápida de ratones que llevan tumores PDA implantados ortotótópicamente, lo que permite la investigación de combinaciones terapéuticas en un modelo clínicamente relevante.
La implantación guiada por ultrasonido ofrece mejoras importantes con respecto a los modelos estándar de investigación preclínica. En primer lugar, este procedimiento elimina el control intensivo de tiempo de los ratones KPC para el desarrollo de tumores espontáneos mediante la implantación directa de células PDA cruzadas completamente C57BL/6 en el páncreas murino. En segundo lugar, al igual que las inyecciones ortotópicas quirúrgicas tradicionales, el enfoque UG-OTIM permite controlar la línea celular inyectada, incluyendo la selección de una línea celular tumoral monoclonal y/o la manipulación ex vivo de la línea celular, así como el control sobre el huésped que recibe la implantación de la célula tumoral. En tercer lugar, esta técnica mínimamente invasiva evita el arduo trabajo de la cirugía de supervivencia y evita el complicado período de recuperación postoperatoria para los animales, así como las señales inflamatorias de la cicatrización quirúrgica de heridas. Por último, los tumores UG-OTIM - similares a la implantación quirúrgica - recapitulan el TME observado en los ratones KPC, incluyendo la infiltración baja de células T y la alta infiltración de macrófagos. Por lo tanto, el modelo UG-OTIM conserva las características clave de los tumores de KPC sin las complicaciones adicionales que retrasan las investigaciones terapéuticas en el modelo KPC espontáneo.
Una serie de pasos críticos en el protocolo son clave para dominar el éxito de la técnica. La experiencia en imágenes por ultrasonido murino es esencial para este procedimiento, pero la destreza manual necesaria para implantar con éxito las células en el páncreas es un conjunto de habilidades que debe desarrollarse de forma independiente. En el caso de los ratones en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, el ayuno de los animales durante la noche aseguró que el estómago y los intestinos se despejaran de cualquier alimento no digerido que pudiera bloquear la vista del páncreas, riñón y bazo por ultrasonido. Además, cada línea celular utilizada para la inyección ortotópica debe ser valorada antes de más experimentos para entender la cinética de crecimiento y determinar el potencial metastásico33. Durante la inyección, el uso de fórceps para pellizcar la piel en el lugar de inyección creó la tensión necesaria para perforar suavemente a través de la piel y la pared peritoneal. Un paso clave en el procedimiento fue guiar cuidadosamente la aguja hacia el páncreas sin perforar el tejido o perforar un sitio fuera del objetivo, como el bazo o el riñón. La confirmación de un bolo líquido fue el mejor indicador de la inyección exitosa de células tumorales en el tejido adecuado. Después de la inyección, la aguja debe retirarse lentamente para no perturbar el bolo líquido. Encontramos que una serie de inyecciones de ensayo utilizando DMEM o Trypan Blue ayudó a desarrollar un dominio de las habilidades motoras finas necesarias para esta inyección.
Durante la solución de problemas de este procedimiento, identificamos una serie de factores que afectaron el éxito del protocolo. En los experimentos de prueba, nuestro error más frecuente fue perforar el riñón durante la implantación, que se produjo con más frecuencia en nuestros primeros experimentos sugiriendo que el ejercicio regular de esta habilidad mejora la competencia. Además, encontramos que confirmar la presencia de un bolo líquido después de la inyección de células tumorales a través de ultrasonido y visualización directa en la necropsia durante la fase de solución de problemas mejoró la técnica de inyección exitosa. Si la formación de una burbuja no se confirma por ultrasonido durante la inyección, la ubicación de la aguja se puede ajustar antes de presionar completamente la jeringa para liberar el bolo restante de las células tumorales. También observamos que los volúmenes de suspensión inyectados demasiado rápido resultaron en el derrame de células tumorales en la cavidad peritoneal o el colapso del bolo líquido en el páncreas. Por lo general, estos animales desarrollaron tumores pancreáticos con la excepción de los animales no 7 que no mostraban evidencia de tumor 4 semanas después de la inyección. Este resultado se notificó sólo en nuestros primeros intentos (y 6/7 animales fueron inyectados con un marea baja de células tumorales). Los ratones que tengan inyecciones de células tumorales cuestionables, o que requieran reposicionamiento de la aguja, deben ser estrechamente monitoreados para el desarrollo de tumores fuera del páncreas.
Las principales limitaciones del método guiado por ultrasonido son la disponibilidad de los instrumentos requeridos y la habilidad técnica asociada con la implantación de tumores. El procedimiento no es completamente estéril, ya que el ratón se inyecta de forma no estéril en la plataforma de ultrasonido, con la jeringa y la punta de la aguja pasando a través del gel de ultrasonido. Aunque no hemos visto evidencia de infección en ratones n.o 148 en un total de 8 experimentos independientes desde que iniciamos estos estudios, es posible que un agente infeccioso pueda entrar en el páncreas a través de la aguja de inyección durante este proceso. Como tal, tantos aspectos del protocolo como sea posible (incluyendo guantes, superficies de ultrasonido, cajas de hielo) deben ser rociados con desinfectante o 70% etanol para reducir la exposición potencial a patógenos. Una limitación adicional del protocolo actual fue la falta de metástasis utilizando la línea celular 4662 en las diluciones actuales. Cada línea celular utilizada en el sistema UG-OTIM debe ser valorada para las tasas de crecimiento deseadas, así como el potencial metastásico33. Finalmente, nuestro protocolo actual estableció técnicas para inyectar células tumorales en una suspensión de una sola célula. Sin embargo, la adición de un sustrato de matriz extracelular podría añadirse para mejorar potencialmente el establecimiento del tumor y prevenir la fuga de células tumorales (ya que se utiliza en los modelos de implantación quirúrgica27,30,31,32). Por lo tanto, muchas de las limitaciones de UG-OTIM se pueden superar con pruebas adecuadas de las líneas celulares que se utilizan en las inyecciones ortotópicas.
En resumen, el modelo UG-OTIM es un método preciso de inyección dirigida por tejido de células tumorales en el páncreas murino. Esta técnica de implantación mínimamente invasiva beneficia tanto al investigador como a los animales al reducir el tiempo de procedimiento, minimizar las complicaciones postquirúrgicas y mejorar la precisión de la inyección. Los tumores derivados de las inyecciones de UG-OTIM conservan las características inmunobiológicas de los tumores espontáneos de KPC, tienen un tiempo fiable hasta la aparición del tumor y una cinética de crecimiento tumoral reproducible. Por lo tanto, el modelo UG-OTIM se puede utilizar de una manera relativamente alta en el rendimiento para interrogar combinaciones terapéuticas en un entorno preclínico para revelar nuevos tratamientos para pacientes con la mayor necesidad clínica no satisfecha.
Disclosures
Los autores no tienen revelaciones.
Acknowledgments
Los autores desean dar las gracias al Dr. Robert Vonderheide y a todos los miembros del laboratorio Vonderheide, todos miembros del Hospital de Mouse de Cáncer de Páncreas, el Dr. Ben Stanger, el Centro de Investigación del Cáncer de Páncreas de la Universidad de Pensilvania, y Devora Delman por discusiones útiles. Este trabajo está respaldado por la financiación del Premio Parker Institute for Cancer Immunotherapy Fellow Award (KTB) y el Pancreatic Cancer Research Center de la Universidad de Pensilvania (CC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Conicals | Thomas Scientific | 2602A26 | |
| Blunt edged forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Cell Dissociation Buffer | Thermo-Fisher | 13151014 | |
| Cotton Tipped swabs | Thermo-Fisher | 19062614 | |
| Covidien Monoject 3/10mL, 29G X 1/2" | Thermo-Fisher | 8881600145 | |
| Depilatory Agent | Amazon | Nair Body Lotion | |
| DMEM | Thermo-Fisher | 10-566-016 | |
| FBS | Gemini Bio-oroducts | 100-106 | |
| Flask | Sigma-Aldrich | CLS430825 | |
| Forceps (blunt edge) | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Gauze | Fisher | 13-761-52 | |
| Gentamicin | Thermo-Fisher | 15750060 | |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Isofluorane | Penn Vet Supply | VED1350 | |
| Isofluorane Vaporizer | VetEquip | 911103 | |
| L-glutamine | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Optixcare | MidWest Veterinary Supply | 052.50310.3 | |
| Paper Tape | Medline | MMM1530Z5 | |
| PBS | Thermo-Fisher | 14-190-250 | |
| Slide warmer | C&A Scientific | XH-2001 | |
| Sterilant (Clidox-S) | Fisher Scientific | NC0332382 (activator) NC9189926 (base) | Needs to be combined according to manufacturer's instructions |
| Sterile Alcohol prep pad | Covidien | 6818 | |
| Trypsin | Thermo-Fisher | 15090046 | |
| Ultrasound gel | Thermo-Fisher | 03-34-1LT | |
| Visualsonics Ultrasound Vevo 2100 | Visual Sonics | Vevo 2100 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Chao, T., Furth, E. E., Vonderheide, R. H. CXCR2-Dependent Accumulation of Tumor-Associated Neutrophils Regulates T-cell Immunity in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Immunology Research. 4 (11), 968-982 (2016).
- Steele, C. W., et al. CXCR2 Inhibition Profoundly Suppresses Metastases and Augments Immunotherapy in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. 29 (6), 832-845 (2016).
- Li, J., et al. Tumor Cell-Intrinsic Factors Underlie Heterogeneity of Immune Cell Infiltration and Response to Immunotherapy. Immunity. 49 (1), 178-193 (2018).
- Beatty, G. L., et al. Exclusion of T Cells From Pancreatic Carcinomas in Mice Is Regulated by Ly6C(low) F4/80(+) Extratumoral Macrophages. Gastroenterology. 149 (1), 201-210 (2015).
- Bayne, L. J., et al. Tumor-derived granulocyte-macrophage colony-stimulating factor regulates myeloid inflammation and T cell immunity in pancreatic cancer. Cancer Cell. 21 (6), 822-835 (2012).
- Beatty, G. L., et al. CD40 agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreatic carcinoma in mice and humans. Science. 331 (6024), 1612-1616 (2011).
- Lo, A., et al. Tumor-Promoting Desmoplasia Is Disrupted by Depleting FAP-Expressing Stromal Cells. Cancer Research. 75 (14), 2800-2810 (2015).
- Rhim, A. D., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 25 (6), 735-747 (2014).
- Ozdemir, B. C., et al. Depletion of Carcinoma-Associated Fibroblasts and Fibrosis Induces Immunosuppression and Accelerates Pancreas Cancer with Reduced Survival. Cancer Cell. 28 (6), 831-833 (2015).
- Clark, C. E., et al. Dynamics of the immune reaction to pancreatic cancer from inception to invasion. Cancer Research. 67 (19), 9518-9527 (2007).
- Stromnes, I. M., Hulbert, A., Pierce, R. H., Greenberg, P. D., Hingorani, S. R. T-cell Localization, Activation, and Clonal Expansion in Human Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Immunology Research. 5 (11), 978-991 (2017).
- Morrison, A. H., Byrne, K. T., Vonderheide, R. H. Immunotherapy and Prevention of Pancreatic Cancer. Trends in Cancer. 4 (6), 418-428 (2018).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
- Yip-Schneider, M. T., et al. Dimethylaminoparthenolide and gemcitabine: a survival study using a genetically engineered mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 13, 194 (2013).
- Frese, K. K., et al. Nab-Paclitaxel potentiates gemcitabine activity by reducing cytidine deaminase levels in a mouse model of pancreatic cancer. Cancer Discovery. 2 (3), 260-269 (2012).
- Stromnes, I. M., et al. T Cells Engineered against a Native Antigen Can Surmount Immunologic and Physical Barriers to Treat Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. 28 (5), 638-652 (2015).
- Byrne, K. T., Vonderheide, R. H. CD40 Stimulation Obviates Innate Sensors and Drives T Cell Immunity in Cancer. Cell Reports. 15 (12), 2719-2732 (2016).
- Winograd, R., et al. Induction of T-cell Immunity Overcomes Complete Resistance to PD-1 and CTLA-4 Blockade and Improves Survival in Pancreatic Carcinoma. Cancer Immunology Research. 3 (4), 399-411 (2015).
- Keenan, B. P., et al. A Listeria vaccine and depletion of T-regulatory cells activate immunity against early stage pancreatic intraepithelial neoplasms and prolong survival of mice. Gastroenterology. 146 (7), 1784-1794 (2014).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
- Maddipati, R., Stanger, B. Z. Pancreatic Cancer Metastases Harbor Evidence of Polyclonality. Cancer Discovery. 5 (10), 1086-1097 (2015).
- Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. The evolving relationship of wound healing and tumor stroma. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (18), (2018).
- Kasper, M., et al. Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (10), (2010).
- Stuelten, C. H., et al. Acute Wounds Accelerate Tumorigenesis by a T Cell-Dependent Mechanism. Cancer Research. 68 (18), (2008).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods of Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Moreno, J. A., Sanchez, A., Hoffman, R. M., Nur, S., Lambros, M. P. Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models and Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Huynh, A. S., et al. Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound-guided injection of cells. Public Library of Science One. 6 (5), e20330 (2011).
- Thomas, T. T., et al. Utilization of Ultrasound-guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Jager, W., et al. Minimally invasive establishment of murine orthotopic bladder xenografts. Journal of Visualized Experiments. (84), e51123 (2014).
- Aiello, N. M., Rhim, A. D., Stanger, B. Z. Orthotopic injection of pancreatic cancer cells. , Cold Spring Harbor Protocols. (2016).
