Summary
Biz doğrudan yerli tümör bölgesine mürin türetilmiş pankreas duktal adenokarsinom hücre hatlarının ultrason güdümlü implantasyonu için bir protokol açıklar. Bu yaklaşım, enjeksiyondan sonraki 2-4 hafta içinde ultrason taraması ile saptanabilen pankreas tümörlerinin saptanmasıyla sonuçlandı ve cerrahi ortotopik implantasyona kıyasla periton duvarındaki tümör hücre tohumlama oranını önemli ölçüde azalttı.
Abstract
Melanom ve akciğer adenokarsinomimmün kontrol noktası ablukasının son başarısı immüno-onkoloji alanında galvaniz yanı sıra mevcut tedavilerin sınırlamaları ortaya koymuştur, hastaların çoğunluğu immünoterapi yanıt vermez gibi. Yeni ve etkili terapötik kombinasyonları hızlı bir şekilde belirlemek için doğru preklinik modellerin geliştirilmesi bu karşılanmayan klinik ihtiyacı gidermek için çok önemlidir. Pankreas duktal adenokarsinom (PDA) immün ototerapiye yanıt veren hastaların sadece % 2'si ile immün kontrol noktası bloka dirençli tümörün kanonik bir örneğidir. Genetiği değiştirilmiş KrasG12D+/-; Trp53R172H+/-; PDA Pdx-1 Cre (KPC) fare modeli insan hastalığı recapitulates ve preklinik ortamda dirençli immünoterapi için tedavilerin değerlendirilmesi için değerli bir araçtır, ancak tümör başlangıç lılık zamanı son derece değişkendir. PDA'nın cerrahi ortotopik tümör implantasyon modelleri KPC dokuya özgü tümör mikroortamının (TME) immünbiyolojik özelliklerini korumakla birlikte, zaman yoğun bir işlem gerektirir ve anormal iltihabı ortaya çıkarmasağlar. Burada, kpc kaynaklı PDA hücre hatlarını doğrudan fare pankreasına enjekte etmek için ultrason eşliğinde ortotopik tümör implantasyon modeli (UG-OTIM) kullanıyoruz. UG-OTIM tümörleri endojen doku bölgesinde büyür, PDA TME'nin histolojik özelliklerini sadakatle yeniden özetler ve periton duvarında minimal tohumlama ile enjeksiyondan sonra dört hafta kadar preklinik çalışmalar için kayıt boyutunda tümörlere ulaşırlar. Burada açıklanan UG-OTIM sistemi, murine PDA TME'de yeni terapötik kombinasyonların yüksek iş elde analizine olanak tanıyan hızlı ve tekrarlanabilir bir tümör modelidir.
Introduction
Pankreas duktal adenokarsinom (PDA) mevcut tedavilere refrakter bir kötü üne sahip agresif bir hastalıktır, kasvetli bir ile 5 yıllık sağkalım oranı ile 9%1. PDA son zamanlarda ABD'de kansere bağlı mortalitenin üçüncü önde gelen nedeni olmak için meme kanseri aştı ve ikinci önde gelen nedeni (sadece akciğer kanseri arkasında) 20302. Immünolojik olarak 'soğuk' PDA tümör mikroçevre karakteristik bir dizi (TME)-immünsupresif miyeloid hücre popülasyonlarının yüksek infiltrasyon içeren3,4,5,6,7, yoğun stromal birikimi8,9,10,11, ve T hücrelerinin bir eksikliği5,12,13-katkıda PDA14immünoterapilerin başarısızlığı. Bu amaçla, klinik olarak ilgili bir hayvan modelinin kullanımı in vivoimmünolojik olarak soğuk tümörler için yeni ilaç kombinasyonları etkinliğini araştırmak için önemli bir araçtır.
Genetiği değiştirilmiş KrasG12D+/-; Trp53R172H+/-; PDA Pdx-1 Cre (KPC) fare modeli sadakatle insan PDA belirgin klinik yönlerini özetler, hastalığın moleküler sürücüleri ve histopatolojik özellikleri de dahil olmak üzere15. KPC tümörleri tam immünoyonfarelerde kendiliğinden gelişir, kemoterapi dahil terapötik yaklaşımların sorgulanmasına olanak16,17, immünoterapi18,19,20,21, ve stroma hedefleme tedavisi9,11,22klinik deneme ortamında bu ilaçların uygulanması öncesinde. PDA bir preklinik modeli olarak birçok güçlü rağmen, Tümör başlangıcı olarak Spontan tümör gelişiminin son derece değişken ilerlemesi kPC farelerin kullanımı dezavantajlı 4 ila 40 hafta arasında değişebilir (böylece bakım büyük bir üreme kolonisi gerektiren)15. Ayrıca, KPC fareler poliklonal primer tümörler için potansiyele sahip23, ve hayvan sağlığı nda hızlı bir düşüş ve hastalık ilerledikçe kaşeksi ve asit gibi co-morbiditelerde artış var15.
Spontan KPC fare modeline alternatif bir pda24bir ortotopik implantasyon modeli kullanmaktır. Tümör hücre hatlarının doğal doku bölgesine doğrudan cerrahi implantasyonu PDA'nın dokuya özgü tümör mikroçevresini (TME) yeniden özetleyen daha uygun maliyetli ve öngörülebilir bir yöntemdir. Tümör implantasyonu genetik backcrossed farelere klonal tümör hücre hatları enjeksiyonu için izin verir5, KPC fare modeline üremek için zaman alıcı olacak ek genetik manipülasyonlar ile konak fareler için izin. Ancak, pankreas tümör implantasyonu karın duvarında dikiş yerinde anormal iltihabı tanıttı bir emek yoğun cerrahi işlem gerektirir24,25,26, ve genellikle uzun bir post-operatif iyileşme içerir27,28,29.
Kemirgenlere özgü transdüserler kullanılarak ultrason görüntülemedeki teknolojik gelişmeler gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlar. Periton boşluğunda enjeksiyon iğne hareketinin ultrason görüntüleme rehberliğinde, bir özellikle pankreas içine tümör hücreleri implant olabilir, cerrahi implantasyon ve ilişkili inflamasyon yokluğunda ortotopik tümör enjeksiyonları yararları yararlanarak. Bu yaklaşım, ultrason güdümlü ortotopik tümör implantasyon modeli olarak adlandırılmıştır (UG-OTIM) daha önce pankreas kanseri bir ksenogreft modelleri kurulmuştur30 yanı sıra Ewing sarkomu da dahil olmak üzere birçok diğer kanser modelleri, nöroblastom ve mesane kanseri31,32.
Burada, tümör hücre hatlarının mindik pankreasına ultrason eşliğinde enjeksiyonyapmak için ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Ortaya çıkan tümörlerin KPC TME'nin histolojik ve immünolojik özelliklerini yeniden ortaya çıkardığını ve bu nedenle immünoterapiler de dahil olmak üzere yeni terapötik kombinasyonları araştırmak için hızla en umut verici tedavileri ortaya çıkarmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz. klinik çalışmalara iletilir.
Protocol
Hayvan protokolleri Pennsylvania Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Kurumsal tarafından gözden geçirildi ve onaylandı. Dişi 5-6 haftalık C57Bl/6 fareler satın alındı (bkz. Malzemeler Tablosu)ve 1-3 hafta dinlendikten sonra kullanıldı. Üniversite Laboratuvarı Hayvan Kaynakları hayvan bakımı nezaret etti.
1. Enjeksiyon için PDA tümör hücre hatlarının hazırlanması
- Tümör hücresi (TC) ortamlarında KPC türetilmiş PDA hücre hattı büyümek: Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) ile birlikte 10% Fetal Sığır Serum (FBS), 2mM L-glutamin ve 83 μg/mL gentamicin.
- 37°C ve %5 CO2'detutulan şişelerde hücrelerin %80-85 oranında büyümesine izin verin.
- Hücreler ideal bir araya geldiklerinde, ortamları şişelerden ayırın ve yapBoz hücrelerinin tek katını örtmeye yetecek kadar sıcak (37°C), steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra kalan PBS Pipet.
- Her şişedeki monokatmanı 3-5 dakika boyunca 37°C'de veya hücreler dokunarak ayırana kadar sıcak (37°C) %0,05 tripsin-EDTA çözeltisi (Hanks'bazlı enzimsiz hücre ayrışma tamponunda %0,5 stok trypsin-EDTA seyreltilmiş %0,5 stok trypsin-EDTA) ekleyin ve 37°C'de tek katını kaplayın Şişe.
- Tripsinizasyon reaksiyonunu durdurmak için her şişeye 10-25mL soğuk (4°C), steril TC ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonu 50mL konik(ler) içine dökün, soğuk TC ortam ile 50mL doldurun.
- 4 °C'de 5 dakika 300g'de santrifüj. Soğuk, steril DMEM (serum içermeyen) supernatant atın ve pellet resuspend. Hücreleri toplamak için birden fazla konik tüp kullanıldıysa, tüm peletler bu adımda tek bir konik ile birleştirilebilir.
- Santrifüj 300g de 4 ° 5 dakika.
- Adımları 1.6-1.7'yi iki kez tekrarlayın. Son yıkamada, saymak için hücrelerin bir aliquot alın. İnvivo enjeksiyonlar için ≥90% hücre canlılığı önerilir.
- Tümör hücrelerinin istenilen konsantrasyonda PDA tümör hücrelerinin düzgün bir süspansiyon hazırlayın. Biz steril, soğuk DMEM veya PBS uygun miktarda 10-20 x 106 hücre / mL (250.000-500.000 hücre/ 25μL) kullanılan, ancak her hücre hattı in vivotitrated olmalıdır.
- Enjekte etmeye hazır olana kadar hücreleri soğuk, buz üzerinde tutun.
2. Farelerin Cerrahi Öncesi Hazırlanması
NOT: Bu adımın işlemden 24 saat önce yapılması önerilir.
- Deneysel fareler içeren kafesleri 37°C'ye kadar daha sıcak bir sete yerleştirin.
- Yeni, temiz kafesler edinin ve 37°C'ye ayarlanmış ikinci bir ısınma platformuna yerleştirin.
- Biyolojik güvenlik kabinini, indüksiyon odasını ve ultrason (ABD) aşamasını sterilantla iyice temizleyin (bkz. Malzemeler Tablosu).
- ABD sahnesinin ısınma fonksiyonunu 37°C'ye çevirin.
- Anestezi makinesini açın: tüp ayırıcıdaki kadranları, hava akışının yalnızca indüksiyon odasıyla sınırlı olması için ayarlayın. Oksijen tankını açın ve akış hızı 1 L/dk'ya ayarlayın.
- İndüksiyon odasına tek bir fare yerleştirin. Artık mobil ve nefes yavaşladı kadar fareyi izleyin.
- Bölme deki kadranları ayarlayın, böylece hem indüksiyon odasına hem de burun konisine hava akışına izin verilir. Fareyi indüksiyon odasından hızlıca hareket ettirin ve burun konisinde namlusu ile sıcak ABD sahnesinde ventral recumbency'ye yatırın.
- Ayak sıkışmasına karşı refleksif yanıtı gözlemleyerek indüksiyon seviyesini test edin. Yoksa, fare epilasyon için hazırdır.
- Doku dehidratasyonunu önlemek için her iki göze de az miktarda göz yağlayıcı yerleştirin (Bkz. Malzemeler Tablosu). Fareyi sahnede dorsal recumbency yatıyor şekilde açın. Karın ın maruz kalmasını en üst düzeye çıkarmak ve fareyi sahneye sabitlemek için üst ve alt ekstremiteleri kağıt bantla sahneye hafifçe yapıştırın.
- Karın üst sol kadranda cömert bir tabaka tüy dökücü krem uygulamak için steril bir pamuk ucu aplikatör kullanın. Depilatör dalak genel alanda uygulanmalı ve orta hatta doğru uzanmalıdır. Yaklaşık bir dakika oturup bekleyin.
- Saç dökülmesini kolayca ortadan kaldırdıktan sonra, kuru bir gazlı bez pedi ile karın temizliği ni silmek için pamuk ucu aplikatörünün karşı ucunu kullanarak epilasyon derecesini test edin. Sonra sıcak tuzlu küçük bir miktar ile gazlı bez temiz bir tabaka ıslak ve tamamen depilatory ajan kaldırmak için bir kez daha alanı silin. Kimyasal yanık riskini azaltmak için fare derisinde 2 tam dakikadoğrudan temas süresini geçmeyin.
- Saç yeterince karın çıkarıldıktan sonra, sıcak yeni, temiz kafes için fare dönün.
- İlk hayvan ABD sahnesinde epilasyon dan geçerken, bir sonraki hayvan indüksiyon odasına eklenebilir.
- Farelerin bir sonraki kafesi anestezi den önce, isofluran'ı kapatın ve indüksiyon odasını oksijenle yıkayın. İndüksiyon odasını ve ABD sahne/burun konisini sterilantla temizleyin. Tüm kafesler ve fareler epilasyon geçirene kadar adımları 2.5-2.14 tekrarlayın.
NOT: İmplantasyondan önce bir süre geçici olarak gıda çekilmesi ile oruç hayvanları, mide ve bağırsaklarda sindirilmemiş gıdalar nedeniyle karın organlarının görme engelini en aza indirmek için düşünülebilir (12-24 saat). Su kısıtlaması önerilmez. Hayvanlar oruç tutarsa, dehidratasyondan korunmak için tümör enjeksiyonu sonrası steril salin olan 1mL ılık (37°C) enjeksiyonu ile tedavi edilmesi önerilir.
3. PDA hücrelerinin Ultrason eşliğinde implantasyonu
NOT: Tüm ultrason işlemleri ultrason görüntüleme makinesi ve yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Transdüser 40 MHz merkezi frekansa ve 22-55 MHz bant genişliğine sahiptir.
- Ultrason platformını, platform yüzeyinin zemine paralel olduğunu ve araştırmacının hayvanın sol tarafına, hayvanın başını sağa doğru bakmasını sağlayacak şekilde ayarlayın. Transdüser pozisyonunu enine bir karın görüntüsü elde edilebilsin diye ayarlayın (Şekil 1A).
- 2.1-2.8 adımlarında açıklandığı gibi enjekte edilecek fareyi anesthetize edin. Adım 2.9'da açıklandığı gibi FAREYI ABD platformunda sabitle.
- Karın kılsız kısmına bol miktarda ılık (37°C) ultrason jeli uygulayın.
- Farenin karın temas için yavaşça transdüser indirin. Pankreas açıkça görünene kadar gerektiği gibi transdüser ayarlayın. Karın boşluğunun doğru bir yönünü sağlamak için sol böbrek ve dalak bulun.
NOT: Transdüser pozisyonu karın sol tarafına erişim sağlamak için değiştirildi çünkü, sahne kontrolleri üzerinde X ve Y ekseni şimdi ters. - 29G x 1/2" insülin şırıngasını (bkz. Malzemeler Tablosu)tümör hücresi süspansiyonunun 25°L'lik kısmıile yükleyin. Karın duvarında tümör hücre tohumlama en aza indirmek için enjeksiyon öncesi steril alkol hazırlık pedi ile iğne ucu silin.
- Künt kenarlı forceps kullanarak, istenilen enjeksiyon yerinde gerginliği artırmak için cilt ve periton duvarı kavramak. Şırıngayı ultrason platformu yüzeyine yaklaşık 25°-45° açıyla tutarak iğneyi deriden ve periton duvarından yavaşça geçirin. İğnenin bir sonraki adıma geçmeden önce periton duvarından delindiğini doğrulayın. İğne periton duvarını delerken küçük bir pop hissedilmelidir.
- Ultrason görselleştirme altında, doğrudan pankreas içine iğne kılavuzu (Şekil 1B-C). İğnenin pankreas dokusu içinde olduğunu doğrulayın ve şırınga namlusu yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirin. Yerleştirme doğruysa, şırınga varil hareket ederken iğne ucu pankreas dokusu içinde kalacaktır.
- Yavaş yavaş tümör hücrelerini enjekte ve pankreas içinde bir sıvı bolus oluşumu ile istenilen yerde implante edilmektedir hücreleri onaylamak (ultrason ekranında görünür, Şekil 1D).
NOT: Depresif piston sırasında bazı direnç hissedilmelidir. Bu karın boşluğuna sızıntı olasılığını artırır gibi pankreas birden fazla kez delmek için dikkatli olun. - Süspansiyon tam hacim enjekte edildikten ve bir sıvı bolus pankreas görülebilir sonra, çok birkaç saniye için iğne çok hareketsiz tutun. İğneyi fare karnından yavaşça geri çekerek enjekte edilen hücreleri rahatsız etmemeye özen li yorum.
- Fareyi temiz ve sıcak bir kafese yerleştirin ve farenin anesteziden tamamen kurtulduğundan emin olun. Tüm hayvanlar için bu işlemi tekrarlayın.
- Bir sonraki fareyi anestezi etmeden önce indüksiyon odasını ve ABD sahne/burun konisini sterilantla temizleyin.
- Tüm fareler enjekte edilene kadar 3.2-3.11 adımlarını tekrarlayın.
Representative Results
Bu raporun amacı, KPC kaynaklı PDA hücre hatlarının ultrason eşliğinde implantasyonu için ayrıntılı bir protokol sağlamaktı. Şekil 2-4'tegösterilen temsili deneylerde UG-OTIM tümörlerinin tutarlı bir oranda ve doza bağımlı bir şekilde büyüdüğünü doğrulatıyoruz. Ayrıca UG-OTIM tümörlerinin KPC TME'nin belirgin immünolojik ve histolojik özelliklerini yeniden ortaya çıkarmaktayız. Böylece, UG-OTIM sistemi hızla vivoyeni tedavi kombinasyonları ekrana yüksek iş verme şekilde kullanılabilir bir preklinik PDA fare modelidir.
Burada özetlenen UG-OTIM protokolü kullanılarak, fareler implantasyon için hazırlandı, ısıtmalı ultrason platformuna sabitlendi ve hem platformun hem de transdüserin konumları Şekil 1A'dagösterildiği gibi bu prosedüre göre ayarlandı. Yüksek çözünürlüklü ultrason görüntüleme, fare pankreası içinde böbrek veya dalak geçirilmeden hedeflenebilecek bir enjeksiyon bölgesini tanımlamak için kullanılmıştır(Şekil 1B). Ultrasonografik görselleştirme altında, iğne dikkatle periton duvarı ile karın boşluğuna tanıtıldı ve fare pankreas içine yönlendirilir (Şekil 1C). İğnenin doğru yerleştirilmesi sağlandıktan sonra tümör hücresi süspansiyonu pankreasa çok yavaş enjekte edildi. Başarılı bir implantasyon pankreas içinde bir kabarcık varlığı ile doğrulandı (Şekil 1D). İlk deneylerde fare kurban edildi ve işlemin etkinliği, brüt pankreas dokusundaki sıvı bolus'u doğrudan görselleştirerek doğrulandı (Şekil 1E).
Haftalık ultrason görüntüleme ile tümör implantasyonu ve büyüme hızı izlendi. Başarılı implantasyonlar deney süreboyunca pankreas sınırları içinde bulunan tümörler üretti(Şekil 2A). Ultrason yazılımı (bkz. Materyaller Tablosu)tümör alanı ve hacminin her zaman noktası için belirlenmesine izin verilen ve üretilecek ölçülen tümörlerin 3Boyutlu haritalama(Şekil 2B), ve 3Boyutlu görüntüler fare nekropsisi sırasında doğrulanmıştır (Şekil 2C). UG-OTIM işlemi sırasında yanlış bir hücre enjeksiyonu periton duvarı tümörü gelişimine neden olabilir (temsilibir görüntü Şekil 2Dgösterilir). Periton tümörü ile başvuran fareler ileri çalışmalardışında tutulabilir.
Klinik öncesi çalışmalarda kullanılmak üzere optimal hücre konsantrasyonu belirlemek için, c57Bl/6 KPC türetilmiş PDA hücre hattı (4662)9, altı bağımsız deneyde saf, yabani tip C57Bl/6 farelere enjekte edildi. Bu hücre hattı (in vitro altı kez geçitli) moleküler histokompatibilite kompleksi uyumsuzluk tümör ret antijenlerini önlemek için tam bir backcrossed KPC tümör taşıyan fare (>10 nesiller, SNP-analiz19tarafından doğrulandı) türetilmiştir. Tümör hücreleri düşük titre (1.25 x 106 hücre/25μL) ve yüksek titre (5 x 106 hücre/25°L) dozda enjekte edildi. Yüksek titre tümör enjeksiyonları, enjeksiyonlardan üç hafta sonra düşük titre kohortuna göre tümör taşıyan hayvanların daha büyük bir oranda sonuçlanmasına neden olur(Şekil 3A). Tümör başlangıcındaki gecikmeye rağmen, genel tümör büyüme hızı iki doz arasında anlamlı olarak farklı değildi(Şekil 3B). Benzer şekilde, iki kohort arasındaki sağkalım oranı önemli ölçüde farklı olmasa da, düşük titre kohortta(Şekil 3C)biraz daha iyi sağkalım eğilimine doğru veri eğilimi. Yüksek titre kohort ayrıca düşük titre kohort(Şekil 3D)dört hafta post-enjeksiyon ile preklinik çalışmalarda kayıt (≥20mm3 tümör hacmi olarak belirlenmiştir) tümörler ile farelerin daha büyük bir oranda üretti. Yüksek ve düşük titre kohortlardan gelen farelerin çoğunluğu 25. Bu protokolden alınan hücre dozlarında 4662 kullanılarak oluşmayan metastazlar farklı hücre hatları veya dozlarla modellenebilir33.
UG-OTIM yöntemi, ilk deneylerimizde zorlu olan istenilen enjeksiyon bölgesini doğru bir şekilde yerelleştirmek için ince motor becerilerinde ustalık gerektiriyordu. Bu nedenle, ultrason eşliğinde tümör implantasyonu yapılan toplam hayvan sayısına kıyasla pankreas içinde tümör gelişen hayvan sayısını (başarılı implantasyonlar) gösteren bir tablo dahil ettik(Tablo 1). Tümörlerin istenmeyen bir yerde (böbrek gibi) geliştiği veya enjeksiyon dan sonra altı hafta ya da tümör bulgusu olmaması durumunda hayvanlar gelecekteki analizlerden elendi. Her deneyden kayda uygun pankreas tümörü (≥20mm3 tümör hacmi) taşıyan farelerin oranının haftalık ilerlemesi Tablo 1'degösterilmiştir.
Geleneksel cerrahi ortotopik model yerine UG-OTIM yaklaşımının kullanılmasının bir yararı olup olmadığını belirlemek için (teknikte yeterlilik kazandıktan sonra zaman yatırımı nın ötesinde), her işlemden sonra farelerin periton duvarında PDA tümörlerinin tohumlamasını karşılaştırdık. Biz sadece 2/31 fareler (%6.5) bulundu UG-OTIM enjeksiyonları sonrası istenmeyen periton duvarı tümörleri gelişti, cerrahi enjeksiyon sonrası periton duvarı tümörleri gelişen 7/15 fareye kıyasla (%46.6, p < 0.0029) (Tablo 1). Böylece UG-OTIM yönteminde cerrahi implantasyona göre peritondaki ek tümörlerin tohumlama oranı büyük ölçüde azalmaktadır.
UG-OTIM tümörlerini taşıyan farelerin kurban edildikten sonra, tümörlerin brüt anatomisi spontan KPC tümörlerine benzediğini bulduk(Şekil 4A). Histolojik analizler, her iki modelde de benzer olan ve insan hastalığının morfolojisini özetleyen anormal duktal yapıların bir paterni göstermiştir(Şekil 4B). Hem KPC hem de UG-OTIM tümörlerinde immün infiltrasyonun araştırılması için temsili histolojik örnekler CD3 (T hücreleri tarafından ifade edilir) ve F4/80 (makrofajlarla ifade edilir) için boyandı. Her iki modelde de boyama desenleri T hücreleri tarafından kötü infiltrasyona sahip tümörleri ortaya çıkarmış(Şekil 4C),ancak makrofajlar tarafından çok fazla infiltrasyona neden olmuş(Şekil 4D). Bu bulgu çoğu insan ve KPC PDA örneklerinin immünolojik soğuk fenotip ile tutarlıdır5,7,12.
Şekil 1: PDA hücrelerinin mürin pankreasına ultrason eşliğinde implantasyonu. (A) Abdominal organların yüksek çözünürlüklü görüntüsünü elde etmek için kullanılan fare, ultrason evresi ve ultrason sondasının oryantasyonu. Sahne ve platformun standart oryantasyondan 90° döndürülde ve fare karnının sol üst kadranda kolay erişim sağladığını unutmayın. (B) Böbrek, dalak ve pankreas ın tanımlanmasını gösteren ultrasonografik görüntü. Burada enjeksiyon iğnesi fare nin karınına doğru konumlandırılır. (C) Fare pankreas içinde iğne gösteren ultrasonografik görüntü. (D) Ultrasonografik görüntü enjeksiyon yerinde kabarcık gösteren (mavi özetlenen) pankreas tümör hücrelerinin kontrollü enjeksiyonu sonrasında. (E) Laparotomi ultrason eşliğinde enjeksiyon sonrası pankreasta PDA hücreleri içeren sıvı bolus ortaya koymaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: UG-OTIM enjeksiyonu sonrası tümör büyümesinin izlenmesi. (A) UG-OTIM tümörütemsili ultrasonografik görüntü (mavi olarak özetlenen) 2, 3, ve 5 hafta post-enjeksiyon, belirtildiği gibi. (B) Temsilci ultrason yazılımı kullanılarak ug-OTIM tümörü 5 hafta sonrası enjeksiyon 3D görüntü yeniden. (C) UG-OTIM tümörütemsili brüt anatomisi 5 hafta sonrası fare nekropsi üzerine. (D) Periton duvarı tümörü temsili ultrasonografik görüntü subkutan tabakada 7 hafta sonrası enjeksiyon sonrası yanlış hücre enjeksiyonu sonrası büyüyen. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: PDA hücrelerinin ultrason eşliğinde enjeksiyonu sonrasında kayıt altına alılabilir tümörlerin doza bağlı başlangıçlı. (A) Şekil 1'de yüksek titer (500.000 hücre/25μL) veya düşük titer (125.000 hücre/25°L) tümör hücreleri ile tanımlandığı gibi enjeksiyon dan sonra belirtilen zaman noktalarında tümör taşıyan farelerin oranı belirtilir. (B) Farelerin tümör büyüme kinetiği (A), her sembol bir grup fareyi temsileder, hata çubukları SEM.(C) İnjektüleden sonra belirtilen zaman noktalarında canlı olan farelerin oranını gösterir. Tümörler >1000mm3 veya tümör komorbiditeleri nedeniyle vücut durumu zayıf sayılsa fareler ötenazi veya sansürlendi. (D) Fareler için kayıt edilebilir tümör başlangıçlı zaman (A). Kayıt yaptırabilen tümörler hacim olarak ≥20mm3 olarak kabul edilir. N=8-20 fare/deney ile yapılan 4 bağımsız deneyin veri temsilcisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Deney | Pankreas-tümör yatak/total enjeksiyonları | 1. Hafta (Kayıt) | 2. Hafta (Kayıt) | 3. Hafta (Kayıt) | 4. Hafta (Kayıt) | Tohumlu Periton Tümörleri |
| Yüksek Titer | 24/31 | Nd | 8/24 (3/24) | 15/24 (7/24) | 23/23 (20/23) | 2/20 |
| Düşük Titer | 11/17 | Nd | 3/11 (0/11) | 6/11 (3/11) | 9/11 (5/11) | 0/11 |
| Cerrahi Enjeksiyon | 15/17 | Nd | Nd | 15/15 (9/15) | 15/15 (14/15) | 7/15 |
Tablo 1: Cerrahi implantasyona göre başarılı UG-OTIM tümörlerinin sayısı. Yüksek veya düşük titre durumu başına 2-4 bağımsız deneyden elde edilen veriler, deney başına n=5-10 fare ile birleştirilir. "Cerrahi enjeksiyon", 125.000 tümör hücresinin abdominal laparoskopik cerrahi enjeksiyonu alan fareleri gösterir. "Tümör taşıyan" pankreas tümörü olan fareleri gösterir. "Kayıt" tümör hacmi >20mm3ile her zaman noktasında tümör taşıyan farelerin oranını gösterir. "Seeded Peritoneal Tümörler" tümör hücre enjeksiyonu periton duvarında tümörlerin eşlik eden tohumlama vardı tümör taşıyan farelerin toplam oranını gösterir. Pankreas dışındaki dokularda (yani böbrek) yanlış olarak ortaya çıkan tümörleri olan fareler "tümör taşıyan" popülasyonlardan (ancak toplam enjekte edilen farelere dahil) dışlandı. ND, belirlenmedi. Yüksek ve düşük titre gruplarını karşılaştıran periton duvarı tohumlama sıklığı cerrahi implantasyon ile birleştirilmiş, p < 0.0029 Mann-Whitney testi sonrası 2 kuyruklu T testi ile.
Şekil 4: UG-OTIM tümörleri KPC tümör mikroortamını yeniden ortaya kovardır. Temsili görüntüler gösterilir. Üst sıra, KPC tümörleri. Alt sıra, UG-OTIM tümörleri 5 hafta sonrası implantasyon. (A) Nekropsi üzerine eksised tümörlerin brüt anatomisi. (B) H&E (10X, bar=100μm) (C) CD3 (kahverengi) (10X, bar=100μm) için immünohistokimya boyama. (D) F4/80 (kırmızı) ve DAPI (mavi) (4X, bar=500μm) immünofloresan boyama. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Burada, murine PDA hücre hatlarının otokton doku bölgesine doğrudan implantasyonu için yüksek çözünürlüklü ultrasonografi kullanımının hem KPC hem de cerrahi ortotopik model sistemleri için güvenilir bir alternatif olduğunu gösterilmektedir. UG-OTIM, pda'nın immünopatolojik özelliklerini tümör tanısı ve güvenilir tümör büyüme kinetiklerine kısaltılmış bir zaman çerçevesi ile koruyan biyolojik olarak ilgili tümörler üretir. Ultrason güdümlü enjeksiyon bu nedenle ortoktik implante PDA tümörlertaşıyan farelerin hızlı üretimi için yararlı bir araç olarak hizmet verebilir, klinik olarak ilgili bir modelterapötik kombinasyonları araştırılması için izin.
Ultrason eşliğinde implantasyon preklinik araştırma standart modeller üzerinde önemli iyileştirmeler sunuyor. İlk olarak, bu işlem doğrudan tam C57BL/6 backcrossed PDA hücreleri murine pankreas implante ederek spontan tümörlerin gelişimi için KPC farelerin zaman yoğun izleme ortadan kaldırır. İkinci olarak, geleneksel cerrahi ortotopik enjeksiyonlar benzer, UG-OTIM yaklaşımı enjekte hücre hattı üzerinde kontrol sağlar, bir monoklonal tümör hücre hattı seçimi ve / veya hücre hattının ex vivo manipülasyon da dahil olmak üzere, yanı sıra tümör hücre implantasyonu alan konak üzerinde kontrol. Üçüncü olarak, bu minimal invaziv teknik sağkalım cerrahisi zorlu emek önler ve hayvanlar için karmaşık post-operatif iyileşme dönemi yanı sıra cerrahi yara iyileşmesi inflamatuar sinyalleri atlar. Son olarak, UG-OTIM tümörleri - cerrahi implantasyon benzer - Düşük T hücre infiltrasyonu ve yüksek makrofaj infiltrasyonu da dahil olmak üzere, KPC farelerde gözlenen TME recapitulate. Böylece, UG-OTIM modeli spontan KPC modelinde terapötik araştırmaları geciktiren ek komplikasyonlar olmadan KPC tümörlerinin temel özelliklerini korumaktadır.
Protokoldeki bir dizi kritik adım, tekniğin başarısı için ana önemsahibi olmak için anahtardır. Murine ultrason görüntüleme uzmanlık bu işlem için gereklidir, ancak pankreas ta başarılı bir şekilde implant hücreleri için gerekli el becerisi bağımsız olarak geliştirilmesi gereken bir beceri kümesidir. 12 saatlik ışık / karanlık döngüsü fareler için, bir gecede hayvanların oruç mide ve bağırsak ultrason ile pankreas, böbrek ve dalak görünümünü engelleyebilir herhangi bir sindirilmemiş gıda temizlendi sağladı. Ayrıca, ortotopik enjeksiyon için kullanılan her hücre hattı büyüme kinetik anlamak ve metastatik potansiyeli belirlemek için daha fazla deney önce titre edilmelidir33. Enjeksiyon sırasında, enjeksiyon yerinde cilt çimdik forseps kullanımı hafifçe hem deri ve periton duvarı ile delinmek için gerekli gerginlik yarattı. Prosedürde önemli bir adım dikkatle doku delinme veya dalak veya böbrek gibi bir off-hedef site delinme olmadan pankreas içine iğne rehberlik etmekoldu. Bir sıvı bolus onayı uygun dokuda başarılı tümör hücre enjeksiyonu en iyi göstergesi oldu. Enjeksiyondan sonra, iğne sıvı bolus rahatsız etmemek için yavaş yavaş geri çekilmelidir. DMEM veya Trypan Blue kullanarak yapılan bir dizi deneme enjeksiyonunun, bu enjeksiyon için gerekli olan ince motor becerilerde ustalık geliştirmeye yardımcı olduğunu bulduk.
Bu yordamın sorun giderme sırasında, protokolün başarısını etkileyen bir dizi etken belirledik. Deneme deneylerinde en sık hatamız implantasyon sırasında böbreği delikletmekti, bu da ilk deneylerimizde daha sık meydana gelen bu becerinin düzenli olarak kullanılmasının yeterliliği artırdığını düşündürüyordu. Ayrıca, sorun giderme aşamasında nekropside hem ultrason hem de direkt görüntüleme ile tümör hücre enjeksiyonu sonrası sıvı bolus varlığını doğrulayan başarılı enjeksiyon tekniğini geliştirdiğini bulduk. Enjeksiyon sırasında bir kabarcık oluşumu ultrason ile teyit edilmezse, iğne nin konumu tamamen tümör hücrelerinin kalan bolus serbest bırakmak için şırınga depresif önce ayarlanabilir. Ayrıca çok hızlı enjekte edilen süspansiyon hacimlerinin tümör hücrelerinin periton boşluğuna dökülmesine veya pankreastaki sıvı bolusunun çökmesine yol açtığını gözlemledik. Genellikle, bu hayvanlar n = 7 hayvan dışında pankreas tümörleri geliştirmek için gitti tümör hiçbir kanıt gösterdi 4 hafta sonrası enjeksiyon. Bu sonuç sadece ilk denemelerimizde rapor edildi (ve 6/7 hayvana düşük tümör hücresi enjekte edildi). Şüpheli tümör hücre enjeksiyonları olan fareler, ya da iğne nin yeniden konumlandırılması gerektiren, yakından pankreas dışında tümörlerin gelişimi için izlenmelidir.
Ultrason güdümlü yöntemin en önemli sınırlamaları gerekli aletlerin mevcudiyeti ve tümör implantasyonu ile ilişkili teknik beceridir. Prosedür tamamen steril değildir, fare ultrason platformuüzerinde steril olmayan enjekte edilir gibi, ultrason jel ilerler kenş ile şırınga ve iğne ucu. Bu çalışmaların başlamasından bu yana toplam 8 bağımsız deneyde n=148 farede enfeksiyon bulgusu görmememize rağmen, bu süreçte enfeksiyöz bir ajanın pankreasa enjeksiyon iğnesi ile girmesi mümkündür. Bu nedenle, protokolün mümkün olduğunca çok yönü (eldivenler, ultrason yüzeyleri, buz kutuları dahil) patojenlere potansiyel maruziyeti azaltmak için dezenfektan veya %70 etanol püskürtülmelidir. Mevcut protokolün ek bir sınırlama mevcut seyreltme de 4662 hücre hattı kullanarak metastaz eksikliği oldu. UG-OTIM sisteminde kullanılan her hücre hattı istenilen büyüme oranları nın yanı sıra metastatik potansiyel33için titre edilmelidir. Son olarak, mevcut protokolümüz tümör hücrelerini tek hücreli süspansiyona enjekte etmek için teknikler oluşturdu. Ancak, bir ekstrasellüler matriks substrat eklenmesi potansiyel tümör kurulmasını artırmak ve tümör hücre sızıntısını önlemek için eklenebilir (cerrahi implantasyon modellerinde kullanıldığı gibi27,30,31,32). Böylece, UG-OTIM sınırlamaları birçok ortotopik enjeksiyonlarda kullanılan hücre hatları uygun test ile aşılabilir.
Özetle, UG-OTIM modeli mürin pankreasa tümör hücrelerinin doku yönelimli enjeksiyon hassas bir yöntemdir. Bu minimal invaziv implantasyon tekniği, işlem süresini kısaltarak, cerrahi sonrası komplikasyonları en aza indirerek ve enjeksiyonun doğruluğunu artırarak hem araştırmacıya hem de hayvanlara yarar sağlar. UG-OTIM enjeksiyonlarından kaynaklanan tümörler spontan KPC tümörlerinin karakteristik immünbiyolojik özelliklerini korur, tümör başlangıcıiçin güvenilir zamana ve tekrarüretilebilir tümör büyüme kinetiğine sahiptir. Böylece UG-OTIM modeli, karşılanmayan en büyük klinik ihtiyacı olan hastalar için yeni tedavileri ortaya çıkarmak için terapötik kombinasyonları klinik öncesi bir ortamda sorgulamak için nispeten yüksek iş eldeli bir şekilde kullanılabilir.
Disclosures
Yazarların açıklamaları yok.
Acknowledgments
Yazarlar Dr Robert Vonderheide ve Vonderheide laboratuvarının tüm üyeleri, Pankreas Kanseri Fare Hastanesi, Dr Ben Stanger, Pennsylvania Üniversitesi Pankreas Kanseri Araştırma Merkezi tüm üyeleri ve Devora Delman için teşekkür etmek istiyorum yararlı tartışmalar. Bu çalışma Parker Kanser İmmünoterapi Fellow Ödülü (KTB) ve Pennsylvania Üniversitesi (CC) Pankreas Kanseri Araştırma Merkezi'nden fon tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Conicals | Thomas Scientific | 2602A26 | |
| Blunt edged forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Cell Dissociation Buffer | Thermo-Fisher | 13151014 | |
| Cotton Tipped swabs | Thermo-Fisher | 19062614 | |
| Covidien Monoject 3/10mL, 29G X 1/2" | Thermo-Fisher | 8881600145 | |
| Depilatory Agent | Amazon | Nair Body Lotion | |
| DMEM | Thermo-Fisher | 10-566-016 | |
| FBS | Gemini Bio-oroducts | 100-106 | |
| Flask | Sigma-Aldrich | CLS430825 | |
| Forceps (blunt edge) | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Gauze | Fisher | 13-761-52 | |
| Gentamicin | Thermo-Fisher | 15750060 | |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Isofluorane | Penn Vet Supply | VED1350 | |
| Isofluorane Vaporizer | VetEquip | 911103 | |
| L-glutamine | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Optixcare | MidWest Veterinary Supply | 052.50310.3 | |
| Paper Tape | Medline | MMM1530Z5 | |
| PBS | Thermo-Fisher | 14-190-250 | |
| Slide warmer | C&A Scientific | XH-2001 | |
| Sterilant (Clidox-S) | Fisher Scientific | NC0332382 (activator) NC9189926 (base) | Needs to be combined according to manufacturer's instructions |
| Sterile Alcohol prep pad | Covidien | 6818 | |
| Trypsin | Thermo-Fisher | 15090046 | |
| Ultrasound gel | Thermo-Fisher | 03-34-1LT | |
| Visualsonics Ultrasound Vevo 2100 | Visual Sonics | Vevo 2100 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Chao, T., Furth, E. E., Vonderheide, R. H. CXCR2-Dependent Accumulation of Tumor-Associated Neutrophils Regulates T-cell Immunity in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Immunology Research. 4 (11), 968-982 (2016).
- Steele, C. W., et al. CXCR2 Inhibition Profoundly Suppresses Metastases and Augments Immunotherapy in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. 29 (6), 832-845 (2016).
- Li, J., et al. Tumor Cell-Intrinsic Factors Underlie Heterogeneity of Immune Cell Infiltration and Response to Immunotherapy. Immunity. 49 (1), 178-193 (2018).
- Beatty, G. L., et al. Exclusion of T Cells From Pancreatic Carcinomas in Mice Is Regulated by Ly6C(low) F4/80(+) Extratumoral Macrophages. Gastroenterology. 149 (1), 201-210 (2015).
- Bayne, L. J., et al. Tumor-derived granulocyte-macrophage colony-stimulating factor regulates myeloid inflammation and T cell immunity in pancreatic cancer. Cancer Cell. 21 (6), 822-835 (2012).
- Beatty, G. L., et al. CD40 agonists alter tumor stroma and show efficacy against pancreatic carcinoma in mice and humans. Science. 331 (6024), 1612-1616 (2011).
- Lo, A., et al. Tumor-Promoting Desmoplasia Is Disrupted by Depleting FAP-Expressing Stromal Cells. Cancer Research. 75 (14), 2800-2810 (2015).
- Rhim, A. D., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 25 (6), 735-747 (2014).
- Ozdemir, B. C., et al. Depletion of Carcinoma-Associated Fibroblasts and Fibrosis Induces Immunosuppression and Accelerates Pancreas Cancer with Reduced Survival. Cancer Cell. 28 (6), 831-833 (2015).
- Clark, C. E., et al. Dynamics of the immune reaction to pancreatic cancer from inception to invasion. Cancer Research. 67 (19), 9518-9527 (2007).
- Stromnes, I. M., Hulbert, A., Pierce, R. H., Greenberg, P. D., Hingorani, S. R. T-cell Localization, Activation, and Clonal Expansion in Human Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Immunology Research. 5 (11), 978-991 (2017).
- Morrison, A. H., Byrne, K. T., Vonderheide, R. H. Immunotherapy and Prevention of Pancreatic Cancer. Trends in Cancer. 4 (6), 418-428 (2018).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
- Yip-Schneider, M. T., et al. Dimethylaminoparthenolide and gemcitabine: a survival study using a genetically engineered mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 13, 194 (2013).
- Frese, K. K., et al. Nab-Paclitaxel potentiates gemcitabine activity by reducing cytidine deaminase levels in a mouse model of pancreatic cancer. Cancer Discovery. 2 (3), 260-269 (2012).
- Stromnes, I. M., et al. T Cells Engineered against a Native Antigen Can Surmount Immunologic and Physical Barriers to Treat Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Cancer Cell. 28 (5), 638-652 (2015).
- Byrne, K. T., Vonderheide, R. H. CD40 Stimulation Obviates Innate Sensors and Drives T Cell Immunity in Cancer. Cell Reports. 15 (12), 2719-2732 (2016).
- Winograd, R., et al. Induction of T-cell Immunity Overcomes Complete Resistance to PD-1 and CTLA-4 Blockade and Improves Survival in Pancreatic Carcinoma. Cancer Immunology Research. 3 (4), 399-411 (2015).
- Keenan, B. P., et al. A Listeria vaccine and depletion of T-regulatory cells activate immunity against early stage pancreatic intraepithelial neoplasms and prolong survival of mice. Gastroenterology. 146 (7), 1784-1794 (2014).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
- Maddipati, R., Stanger, B. Z. Pancreatic Cancer Metastases Harbor Evidence of Polyclonality. Cancer Discovery. 5 (10), 1086-1097 (2015).
- Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. The evolving relationship of wound healing and tumor stroma. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (18), (2018).
- Kasper, M., et al. Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (10), (2010).
- Stuelten, C. H., et al. Acute Wounds Accelerate Tumorigenesis by a T Cell-Dependent Mechanism. Cancer Research. 68 (18), (2008).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods of Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Moreno, J. A., Sanchez, A., Hoffman, R. M., Nur, S., Lambros, M. P. Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models and Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Huynh, A. S., et al. Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound-guided injection of cells. Public Library of Science One. 6 (5), e20330 (2011).
- Thomas, T. T., et al. Utilization of Ultrasound-guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Jager, W., et al. Minimally invasive establishment of murine orthotopic bladder xenografts. Journal of Visualized Experiments. (84), e51123 (2014).
- Aiello, N. M., Rhim, A. D., Stanger, B. Z. Orthotopic injection of pancreatic cancer cells. , Cold Spring Harbor Protocols. (2016).
