Ultraljud-guidad ortotopisk implantation av murin Pancreatic ductal adenocarcinom

Summary

Vi beskriver ett protokoll för ultraljud guidad implantation av Murine-härledda bukspottskörteln duktal adenocarcinom cellinjer direkt i den infödda tumör webbplats. Detta tillvägagångssätt resulterade i pankreastumörer detekterbara av ultraljud skanning inom 2-4 veckor av injektion, och signifikant minskad andelen tumör cell seedning på peritonealväggen jämfört med kirurgisk ortotopisk implantation.

Abstract

Den senaste framgången med immun kontrollpunkt blockad i melanom och lung adenocarcinom har galvaniserat området immunonkologi samt avslöjade begränsningarna av nuvarande behandlingar, eftersom majoriteten av patienterna inte svarar på immunterapi. Utveckling av noggranna prekliniska modeller för att snabbt identifiera nya och effektiva terapeutiska kombinationer är avgörande för att hantera detta icke tillgodosedda kliniska behov. Pankreas duktal adenocarcinom (PDA) är ett kanoniskt exempel på en immun kontrollpunkt blockad resistenta tumör med endast 2% av patienter som svarar på immunterapi. Den genetiskt modifierade KRAS^{G12D +/-}; Trp53^{R172H +/-}; PDX-1 CRE (KPC) musmodell av PDA recapitulates mänskliga sjukdomar och är ett värdefullt verktyg för att bedöma terapier för immunterapi resistenta i prekliniska inställningen, men tiden till tumör debut är mycket varierande. Kirurgisk ortotopisk tumör implantation modeller av PDA upprätthålla immunobiologiska kännetecken av KPC vävnads-specifika tumör mikromiljö (TME) men kräver en tidskrävande förfarande och införa avvikande inflammation. Här använder vi en ultraljud-guidad ortotopisk tumör implantation Model (UG-OTIM) att icke-invasivt injicera KPC-härledda PDA cellinjer direkt i musen bukspottkörteln. UG-OTIM tumörer växa i endogena vävnad webbplats, troget recapitulate histologiska funktioner i PDA TME, och nå registrering stora tumörer för prekliniska studier av fyra veckor efter injektion med minimal seedning på peritonealväggen. Den UG-otim system som beskrivs här är en snabb och reproducerbar tumör modell som kan möjliggöra hög genomströmning analys av nya terapeutiska kombinationer i murina PDA TME.

Introduction

Bukspottskörteln duktal adenocarcinom (PDA) är en notoriskt aggressiv sjukdom som är refraktär mot nuvarande behandlingar, med en dyster 5-årig överlevnadsgrad 9%¹. PDA överträffade nyligen bröstcancer att bli den tredje ledande orsaken till cancerrelaterad dödlighet i USA och förväntas bli den näst vanligaste orsaken (bakom endast lungcancer) vid år 2030². Ett antal funktioner som kännetecknar den immunologiska “kalla” PDA tumör mikromiljö (TME)-inklusive hög infiltration av immunsuppressiva myeloida cellpopulationer^3,4,5,6,7, tät stromacellstumörer deposition^8,9,10,11, och en brist på T-celler^5,12,13-bidra till misslyckandet med immunoterapier i PDA¹⁴. För detta ändamål är användningen av en kliniskt relevant djurmodell ett viktigt verktyg för att undersöka effekten av nya läkemedelskombinationer för immunologiskt kalla tumörer in vivo.

Den genetiskt modifierade KRAS^{G12D +/-}; Trp53^{R172H +/-}; PDX-1 CRE (KPC) musmodell av PDA recapitulates troget salient kliniska aspekter av mänsklig PDA, inklusive de molekylära drivkrafterna för sjukdom och histopatologiska funktioner¹⁵. KPC tumörer utvecklas spontant i fullt immunkompetenta möss, möjliggör förhör av terapeutiska metoder inklusive kemoterapi^16,17, immunterapi^18,19,20,21, och stroma-inriktning terapi^9,11,22in vivo före administrering av dessa läkemedel i den kliniska prövningen inställningen. Trots sina många styrkor som en preklinisk modell av PDA, är användningen av KPC möss missgynnas av den mycket varierande utvecklingen av spontan tumörutveckling som tumör debut kan variera från 4 till 40 veckor (vilket kräver underhåll en stor avel koloni)¹⁵. Dessutom, KPC möss har potential för polyklonala primära tumörer²³, och det finns en snabb nedgång i djurhälsa och ökning av komsjuklighet inklusive kakexi och ascites som sjukdomen fortskrider¹⁵.

Ett alternativ till den spontana KPC musmodellen är att använda en ortotopisk implantation modell av PDA²⁴. Den direkta kirurgiska implantation av tumör cellinjer i den inhemska vävnaden platsen är en mer kostnadseffektiv och förutsägbar metod för går igenom vävnads-specifika tumör mikromiljö (TME) av PDA. Tumör implantation möjliggör injektion av klonala tumör cellinjer till genetiskt backkorsade möss⁵, möjliggör värd möss med ytterligare genetiska manipulationer som skulle vara tidskrävande att föda in till KPC musmodell. Emellertid, pankreastumör implantation kräver ett arbetsintensivt kirurgiskt ingrepp som introducerar avvikande inflammation vid suturen plats i bukväggen^24,25,26, och ofta innehåller en lång postoperativ återhämtning^27,28,29.

Tekniska framsteg inom ultraljudsfotografering med hjälp av gnagare-specifika givare ger högupplösta bilder i realtid. Styrs av ultraljud avbildning av injektion nål rörelse i bukhålan, kan man specifikt implantat tumörceller i bukspottkörteln, utnyttja fördelarna med ortotopisk tumör injektioner i avsaknad av kirurgisk implantation och tillhörande inflammation. Detta tillvägagångssätt, kallas ultraljud-guidad ortoämne tumör implantation Model (UG-otim) har tidigare fastställts i en xenograft modeller av bukspottkörtelcancer³⁰ samt i flera andra cancer modeller inklusive Ewing s sarkom, neuroblastom och cancer i urinblåsan^31,32.

Här, vi ger ett detaljerat protokoll för att utföra ultraljud-guidade injektioner av tumör cellinjer i till murin bukspottkörteln. Vi visar de resulterande tumörerna recapitulate de histologiska och immunologiska funktionerna i KPC TME och kan därför användas för att undersöka nya terapeutiska kombinationer, inklusive immunoterapier, för att snabbt avslöja de mest lovande behandlingarna att flytta fram till kliniska prövningar.

Protocol

Animal protokoll granskades och godkändes av den institutionella av djuromsorg och användning kommittén vid University of Pennsylvania. Kvinnliga 5-till-6-veckors-gamla C57Bl/6 möss köptes (se tabell över material) och används efter 1-3 veckors vila. Universitetarlaboratoriumet djur resurser övervakade djuromsorg. 1. beredning av PDA tumör cellinjer för injektion Grow KPC-härledda PDA cell linje i tumör cell (TC) media: Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) kompletteras med 10% foster bovint serum (FBS), 2mM L-glutamin och 83 μg/mL gentamicin. Låt cellerna växa till 80-85% sammanlänkning i flaskor som hålls vid 37 ° c och 5% CO2. När cellerna når ideala confluency, dekanera media från flaskor och tvätta två gånger med varm (37 ° c), steril fosfat-buffrad saltlösning (PBS), tillräckligt för att täcka enskiktslager av anhängare celler. Med pipett av kvarvarande PBS efter slutlig tvätt. Tillsätt varmt (37 ° c) 0,05% trypsin-EDTA lösning (0,5% Stock trypsin-EDTA utspädd 1:10 i hanksbaserade enzymfria cell dissociation buffert) för att täcka enskiktslager i varje kolv och inkubera vid 37 ° c i 3-5 minuter eller tills cellerna lossnar med att knacka på sidorna av Kolven. Tillsätt 10-25mL kallt (4 ° c), sterilt TC-material i varje kolv för att stoppa trypsiniseringsreaktionen. Häll cellsuspensionen i en 50mL konisk (s), fyll till 50mL med kallt TC media. Centrifugera vid 300g i 5 minuter vid 4 ° c. Kassera supernatanten och Omsuspendera pelleten i kallt, sterilt DMEM (serumfritt). Om flera koniska rör användes för att samla in celler, kan alla pellets kombineras till en enda konisk i detta steg. Centrifugera vid 300g i 5 minuter vid 4 °. Upprepa steg 1.6-1.7 två gånger. I tvätten, ta en alikvot av celler för räkning. Cellviabilitet på ≥ 90% rekommenderas för in vivo -injektioner. Förbered en enhetlig suspension av PDA tumörceller vid önskad koncentration av tumörceller. Vi använde 10-20 x 106 celler/mL (250 000 till 500 000 celler/25μl) i lämplig mängd steril, kall DMEM eller PBS, men varje cellinje bör titreras in vivo. Håll cellerna kallt, på is, tills redo att injicera. 2. pre-kirurgisk beredning av möss Obs: detta steg rekommenderas att utföras 24 timmar före ingreppet. Placera burar som innehåller experimentella möss på en varmare inställd på 37 ° c. Få nya, rena burar och placera på en andra uppvärmnings plattform inställd på 37 ° c. Rengör det biologiska säkerhetsskåpet, induktions kammaren och ultraljud (US)-stadiet med steriliserande (se tabell över material). Vrid uppvärmnings funktionen i US Stage till 37 ° c. Slå på anestesi maskinen: justera rattarna på röret splitter så att luftflödet är begränsat till induktion kammaren endast. Sätt på syre tanken och Ställ in flödet till 1 L/min. slå på isofluran spridare till 2-3%. Placera en enda mus i induktions kammaren. Övervaka musen tills inte längre mobil och andning har avtagit. Justera rattarna på splittern så att luftflödet är tillåtet både för induktions kammaren och näsan konen. Flytta snabbt musen från induktions kammaren och Lägg den i ventrala vilo på den varma amerikanska scenen med sin nos i näsan konen. Testa nivån av induktion genom att observera någon reflexiv svar på tå klämmande. Om det finns ingen, är musen redo för hårborttagning. Placera en liten mängd av ögat smörjmedel (se tabell över material) på båda ögonen för att förhindra vävnad uttorkning. Vrid musen så att den lägger i dorsala vilo på scenen. Försiktigt fästa de övre och nedre extremiteterna på scenen med papper tejp för att maximera exponeringen av buken och säkra musen till scenen. Använd en steril bomull-Tip applikator för att tillämpa en generös lager hårborttagnings kräm till den övre vänstra kvadranten av buken. Den hårborttagningsmedel bör tillämpas i det allmänna området av mjälten och sträcker sig mot mittlinjen. Låt sitta i ungefär en minut. Testa graden av hårborttagning genom att försiktigt använda den motsatta änden av bomulls spetsen applikatorn för att torka bort hårborttagnings kräm, när den tar bort lätt, torka av buken ren med en torr kompress pad. Sedan blöt ett rent lager av gasväv med en liten mängd varm saltlösning och torka området en gång till helt ta bort hårborttagnings medlet. Överskrid inte 2 fulla minuter av direkt kontakt på mus huden för att minska risken för frätskador. När håret har tillräckligt avlägsnats från buken, tillbaka musen till en ny, ren bur på varmare. Medan det första djuret genomgår hårborttagning på den amerikanska scenen, kan nästa djur läggas till induktions kammaren. Innan anesthetizing nästa bur av möss, stänga av isofluran och spola induktion kammaren med syre. Rengör induktions kammaren och US Stage/Nose Cone med sterilant. Upprepa steg 2.5-2.14 tills alla burar och möss har genomgått hårborttagning.Anmärkning: fasta djur genom tillfällig utsättning av föda under en period före implantation kan övervägas för att minimera visuell obstruktion av bukorganen på grund av osmält mat i magen och tarmarna (12-24 timmar). Vatten begränsning rekommenderas inte. Om djuren fastas, rekommenderas att de behandlas med en injektion av 1mL varm (37 ° c), steril saltlösning efter tumör injektion för att förhindra uttorkning. 3. ultraljud-guidad implantation av PDA-celler Obs: alla ultraljudsprocedurer utförs med hjälp av ultraljudsdiagnostik maskin och programvara (se tabell över material). Givaren har en centerfrekvens på 40 MHz och en bandbredd på 22-55 MHz. Justera ultraljud plattformen så att plattformens yta är parallellt med golvet och prövaren ansikten den vänstra sidan av djuret, med djurets huvud till höger. Justera givar positionen så att en tvärgående buk bild erhålls (figur 1a). Anesthetize musen som ska injiceras som beskrivs i steg 2.1-2.8. Stabilisera musen på den amerikanska plattformen enligt beskrivningen i steg 2,9. Applicera en generös mängd av den varma (37 ° c) ultraljudsgelen till den hårlösa delen av buken. Sänk försiktigt givaren för att kontakta musens buk. Justera givaren efter behov tills bukspottkörteln är klart synlig. Lokalisera vänster njure och mjälte för att ge en korrekt orientering av bukhålan.Eftersom givarens position har ändrats för att tillåta åtkomst till vänster sida av buken, är X-och Y-axeln på scen kontrollerna nu inverterad. Fyll på en 29G x 1/2 “insulinspruta (se tabell över material) med 25 μl tumör cells suspension. Torka nål spets med steril alkohol prep pad före injektion för att minimera tumör cell seedning i bukväggen. Använd trubbiga tången, greppa huden och peritonealväggen för att öka spänningen vid önskat injektionsställe. Håll sprutan vid ungefär en 25 °-45 ° vinkel mot ultraljudsplattformens yta, sakta framåt nålen genom huden och peritonealväggen. Bekräfta att nålen har punkteras genom peritonealväggen innan du fortsätter till nästa steg. En liten pop bör kännas när nålen genomborrar peritonealväggen. Under ultraljud visualisering, vägleda nålen direkt in i bukspottkörteln (figur 1B-C). Bekräfta nålen är inom bukspottkörteln vävnad genom att försiktigt flytta sprutan fat upp och ner. Om placeringen är korrekt kommer nålspetsen att ligga kvar i bukspottkörteln medan sprutcylindern rör sig. Injicera långsamt tumörcellerna och bekräfta att cellerna implanteras på önskad plats genom bildandet av en flytande bolus i bukspottkörteln (synlig på ultraljudsskärmen, figur 1D).Obs: visst motstånd bör kännas när du trycker ned kolven. Var noga med att inte tränga igenom bukspottkörteln flera gånger eftersom detta ökar sannolikheten för läckage i bukhålan. När hela volymen av suspensionen har injicerats och en flytande bolus kan ses i bukspottkörteln, hålla nålen mycket stilla i flera sekunder. Sakta återkalla nålen från mus buken, med stor omsorg att inte störa de injicerade cellerna. Placera musen i en ren, varm bur och se till att musen helt återhämtar sig från anestesi. Upprepa denna process för alla djur. Innan anesthetizing nästa mus, rengör induktion kammaren och US Stage/näsa konen med sterilant. Upprepa steg 3.2-3.11 tills alla möss har injicerats.

Representative Results

Målet med denna rapport var att tillhandahålla ett detaljerat protokoll för att utföra ultraljudsstyrd implantation av KPC-härledda PDA-celllinjer. I de representativa experiment som visas i figur 2-4, bekräftar vi att UG-otim tumörer växa i jämn takt och på ett dosberoende sätt. Dessutom visar vi att UG-OTIM tumörer recapitulate de framträdande immunologiska och histologiska funktioner i KPC TME. Således är UG-OTIM systemet en preklinisk PDA musmodell som kan användas i en hög genomströmning sätt att snabbt skärmen nya behandlings kombinationer in vivo. Med hjälp av UG-OTIM-protokollet som beskrivs här var mössen förberedda för implantation, säkrade till den uppvärmda ultraljudsplattformen och positionerna för både plattformen och givaren justerades för detta förfarande som visas i figur 1A. Högupplöst ultraljud Imaging användes för att identifiera ett injektionsställe inom mus bukspottkörteln som kan riktas utan perforering av antingen njure eller mjälte (figur 1B). Under ultraljud visualisering, nålen var noga infördes i bukhålan genom peritonealväggen och guidade in i musen bukspottkörteln (figur 1C). Efter korrekt placering av nålen fastställdes, tumör cellsuspensionen injicerades mycket långsamt i bukspottkörteln. En lyckad implantation bekräftades av närvaron av en bubbla i bukspottkörteln (figur 1D). I tidiga experiment, var musen offrades, och effekten av förfarandet kontrollerades genom att direkt visualisera en flytande bolus i brutto bukspottkörteln vävnad (figur 1E). Tumör implantation och tillväxttakt övervakades av veckovis ultraljudsundersökning. Framgångsrika implantationer producerade tumörer som ingick i gränserna för bukspottkörteln under hela experiment tiden (figur 2a). Ultraljud programvara (se tabell över material) som används tillåts för tumörområde och volym som skall bestämmas för varje gång punkt samt för 3D-kartläggning av uppmätta tumörer som skall genereras (figur 2B), och 3D-bilder bekräftades vid tidpunkten för mus obduktion (figur 2C). En felaktig cell injektion under UG-OTIM förfarande kan resultera i utveckling av en peritonealdialys vägg tumör (en representativ bild som visas i figur 2D). Möss som uppvisar peritonealtumörer kan uteslutas från fortsatta studier. För att bestämma koncentrationen av celler optimala för användning i prekliniska studier, en C57Bl/6 KPC-härledda PDA cellinjer (4662)9 injicerades i till naiva, vilda-typ C57BL/6 möss över sex oberoende experiment. Denna cellinjer (passaged in vitro sex gånger) härleddes från en helt BAKÅTKORSAD KPC tumör-bärande mus (> 10 generationer, bekräftas av SNP-analys19) för att förhindra molekylär histocompatibility komplexa obalans tumör avvisande antigener. Tumörceller injicerades vid en låg titer (1,25 x 106 celler/25μl) och vid en hög titer (5 x 106 celler/25μl) dos. De höga titer tumör injektioner resulterade i en större andel av tumör-bärande djur tre veckor efter injektioner jämfört med den låga titer kohort (figur 3a). Trots förseningen i tumör debut, den totala tumörtillväxt takten var inte signifikant annorlunda mellan de två doserna (figur 3B). Samtidigt som överlevnaden mellan de båda kohorterna inte var signifikant annorlunda, var data trenden mot en något förbättrad överlevnad i den låga titerkohorten (figur 3C). Den höga titerkohorten producerade också en större andel möss med tumörer som var inregistrerbara i prekliniska studier (utsedda till ≥ 20mm3 tumör volym) med fyra veckor efter injektion än den låga Titerkohorten (figur 3D). Majoriteten av möss från både höga och låga titerkohorter presenteras med inregistrerbara tumörer dag 25 och utvecklade slutstadiet sjukdomssymtom inklusive ascites (data visas inte). Metastaser, som inte förekommer med hjälp av 4662 vid cell doserna från detta protokoll, kan modelleras med olika cellinjer eller doser33. UG-OTIM-metoden krävde en behärskning av finmotorik för att exakt lokalisera önskat injektionsställe, vilket var utmanande i våra tidigaste experiment. Av denna anledning inkluderade vi en tabell som skildrar antalet djur som utvecklade tumörer i bukspottkörteln (framgångsrika implantationer) jämfört med det totala antalet djur som genomgick ultraljud-guidad tumör implantation (tabell 1). Djuren eliminerades från framtida analyser om tumörer utvecklades på en oönskad plats (dvs. njure) eller om det inte fanns några tecken på tumör i sex veckor efter injektionen, vilket indikeras. Den veckovisa progression av andelen möss med enrollable pankreastumörer (≥ 20mm3 tumör volym) från varje experiment visas också i tabell 1. För att avgöra om det fanns en fördel med att använda UG-OTIM tillvägagångssätt snarare än den traditionella kirurgiska ortotopisk modell (bortom tid investering efter att ha fått kunskaper om tekniken), jämförde vi seedning av PDA tumörer i peritonealväggen av möss efter varje förfarande. Vi fann att endast 2/31 möss (6,5%) utvecklade oavsiktliga peritonealväggstumörer efter UG-OTIM injektioner, jämfört med 7/15 möss som utvecklade peritoneala vägg tumörer efter kirurgisk injektion (46,6%, p < 0,0029) (tabell 1). Sålunda, graden av sådd ytterligare tumörer i bukhinnan reduceras kraftigt i UG-otim metod jämfört med kirurgisk implantation. Vid uppoffring av möss som bär UG-OTIM tumörer, fann vi att den grova anatomin av tumörerna liknade spontana KPC-tumörer (figur 4a). Histologisk analys visade ett mönster av onormala duktal strukturer som var liknande i båda modellerna och som återfått morfologin av den mänskliga sjukdomen (figur 4B). För att undersöka immun infiltrera inom både KPC och UG-OTIM tumörer, representativa histologiska prover färgas för CD3 (uttryckt av T-celler) och F4/80 (uttryckt av makrofager). I båda modellerna, färgning mönster avslöjade tumörer som var dåligt infiltrerats av T-celler (figur 4C), men mycket infiltrerade av makrofager (figur 4D). Detta konstaterande är förenligt med den immunologiska kallt fenotyp av de flesta mänskliga och KPC PDA prover5,7,12. Figur 1: ultraljud-guidad implantation av PDA-celler i murin bukspottkörteln. (A) orientering av mus, ultraljud skede, och ultraljud sond används för att få en högupplöst bild av bukorganen. Observera scenen och plattformen har vridit 90 ° från standardorienteringen för att ge enkel åtkomst till övre vänstra kvadranten av musens buk. (B) ultrasonografisk bild som skildrar identifieringen av njure, mjälte och bukspottkörtel. Här är injektionsnålen placerad mot musens buk. (C) ultrasonografisk bild som föreställer nålen i bukspottkörteln. (D) ultrasonografisk bild som skildrar bubblan vidinjektionsstället (beskrivs i blått) efter kontrollerad injektion av tumörceller i bukspottkörteln. (E) laparotomi avslöjar vätskan bolus innehåller PDA-celler i bukspottkörteln efter ultraljud guidad injektion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2: övervakning tumörtillväxt efter UG-OTIM injektion. (A) representativ ultraljud bild av UG-otim tumör (beskrivs i blått) vid 2, 3, och 5 veckor efter injektion, som anges. (B) representativ rekonstruerad 3D-bild av UG-otim tumör 5 veckor efter injektion med hjälp av ultraljud programvara. (C) representativ brutto anatomi av UG-otim tumör 5 veckor efter injektion vid mus nekropsy. (D) representativa ultraljud bild av en peritonealdialys vägg tumör växer i det subkutana skiktet efter felaktig cell injektion vid 7 veckor efter injektion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3: dosberoende debut av inregistrerbara tumörer efter ultraljud guidad injektion av PDA-celler. A) andelen tumör bär ande möss vid indikerade tidpunkter efter injektion enligt beskrivningen i figur 1 med hög titer (500 000 celler/25μl) eller låga titer (125 000 celler/25μl) tumörceller, enligt vad som anges. B) tumörens tillväxtkinetik hos möss från (a), varje symbol representerar en grupp möss, felstaplar indikerar SEM. (C) andelen möss från (a) levande vid indikerade tidpunkter efter injektion. Möss var euthanized eller censurerade om tumörer var > 1000mm3 eller kroppen skick var dålig på grund av tumör comorbidities. D) tid till inregistrerbar tumör debut för möss från (a). Inregistrerbara tumörer anses vara ≥ 20mm3 i volym. Data representant för 4 oberoende experiment med n = 8-20 möss/experiment. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. Experiment Bukspottkörteln-tumör lager/totala injektioner Vecka 1 (Inregistrerbar) Vecka 2 (Inregistrerbar) Vecka 3 (Inregistrerbar) Vecka 4 (Inregistrerbar) Seedade Peritonealtumörer Hög titer 24/31 Nd 8/24 (3/24) 15/24 (7/24) 23/23 (20/23) 2/20 Låg titer 11/17 Nd 3/11 (0/11) 6/11 (3/11) 9/11 (5/11) 0/11 Kirurgisk injektion 15/17 Nd Nd 15/15 (9/15) 15/15 (14/15) 7/15 Tabell 1: antal lyckade UG-OTIM-tumörer jämfört med kirurgisk implantation. Data kombinerat från 2-4 oberoende experiment per högt eller lågt titertillstånd med n = 5-10 möss per experiment. “Kirurgisk injektion” indikerar möss som fick buken laparoskopisk kirurgisk injektion av 125 000 tumörceller. “Tumör-bärande” indikerar möss med en bukspottkörtel tumör. “Enrollable” indikerar andelen tumör-bärande möss vid varje tidpunkt med en tumör volym > 20mm3. “Seedade Peritonealtumörer” indikerar den totala andelen av tumör-bärande möss som hade samtidig seedning av tumörer på peritonealväggen från tumör cells injektion. Möss med tumörer som uppvisar felaktigt i andra vävnader än bukspottkörteln (dvs njure) exkluderades från “tumör bär ande” populationer (men inkluderade i totala injicerade möss). ND, ej bestämd. Frekvens av peritonealdialys vägg sådd jämföra höga och låga titer grupper kombinerat kontra kirurgisk implantation, p < 0,0029 via 2-tailed T test med Mann-Whitney post-test. Figur 4: UG-OTIM tumörer recapitulate den KPC tumör mikromiljö. Representativa bilder visas. Översta raden, KPC tumörer. Nedersta raden, UG-OTIM tumörer vid 5 veckor efter implantation. A) bruttoanatomi av exciserade tumörer vid obduktion. (B) H & E (10X, bar = 100μm) (C) immunohistokemi färgning för CD3 (brun) (10X, bar = 100μm). D) immunofluorescensfärgning av F4/80 (röd) och DAPI (blå) (4x, bar = 500μm). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Vi visar här att användningen av högupplöst ultraljud för att direkt implantation av murina PDA cellinjer till autoktona vävnad webbplats är ett tillförlitligt alternativ till både KPC och kirurgiska ortotopiska modellsystem. UG-OTIM producerar biologiskt relevanta tumörer som behåller immunopatologiska funktioner PDA med en förkortad tidsram för tumör-diagnos och tillförlitlig tumörtillväxt kinetik. Ultraljud guidad injektion kan därför fungera som ett användbart verktyg för snabb produktion av möss som bär ortotopiskt implanterade PDA tumörer, möjliggör utredning av terapeutiska kombinationer i en kliniskt relevant modell.

Ultraljud-guidad implantation erbjuder viktiga förbättringar jämfört med standardmodeller av preklinisk undersökning. För det första, detta förfarande eliminerar tidskrävande övervakning av KPC möss för utveckling av spontana tumörer genom att direkt implantera fullt C57BL/6 backkorsade PDA celler i murina bukspottkörteln. För det andra, liknande traditionella kirurgiska ortotopiska injektioner, UG-OTIM tillvägagångssätt möjliggör kontroll över cellinjer injiceras, inklusive val av en monoklonal tumör cellinjer och/eller ex vivo manipulation av cellinjer, samt kontroll över den mottagande som får tumör cell implantation. För det tredje undviker denna minimalinvasiva teknik det ansträngande arbetet med överlevnads kirurgi och kringgår den komplicerade postoperativa återhämtnings perioden för djuren samt inflammatoriska signaler från kirurgisk sårläkning. Slutligen, UG-OTIM tumörer-liknar kirurgisk implantation-recapitulate den TME observerats i KPC möss, inklusive låg T cell infiltration och hög makrofaginfiltration. Således, UG-OTIM modellen behåller viktiga funktioner i KPC tumörer utan ytterligare komplikationer som retard terapeutiska undersökningar i den spontana KPC-modellen.

Ett antal kritiska steg i protokollet är nyckeln till att behärska för att lyckas med tekniken. Expertis i murina ultraljud avbildning är viktigt för detta förfarande, men den manuella skicklighet som krävs för att framgångsrikt implantat celler i bukspottkörteln är en färdighet som måste utvecklas självständigt. För möss på en 12-timmars ljus/mörker cykel, fasta djuren över natten säkerställde magen och tarmarna rensas från osmält mat som kan blockera syn på bukspottkörteln, njure och mjälte med ultraljud. Dessutom bör varje cellinje som används för ortotopisk injektion titreras innan ytterligare experiment för att förstå tillväxtkinetik och bestämma den metastaserande potentialen³³. Under injektionen skapade användningen av pinps för att nypa huden vidinjektionsstället den spänning som behövs för att försiktigt punktera genom både huden och peritonealväggen. Ett avgörande steg i förfarandet var att noggrant vägleda nålen i bukspottkörteln utan att perforera vävnaden eller punktera en off-Target webbplats som mjälte eller njure. Bekräftelse av en flytande bolus var den bästa indikatorn på framgångsrik tumör cells injektion i rätt vävnad. Efter injektion ska injektionsnålen dras ut långsamt för att inte störa vätske bolus. Vi fann att en serie av rättegång injektioner med antingen DMEM eller Trypan blå bidragit till att utveckla en behärskning av de fina motoriska färdigheter som behövs för denna injektion.

Under felsökningen av den här proceduren identifierade vi ett antal faktorer som påverkade protokollets framgång. I försöks experiment, vårt vanligaste fel var perforering njuren under implantation, som inträffade oftare i våra tidiga experiment tyder på att regelbunden motion av denna färdighet förbättrar kompetensen. Dessutom, vi fann att bekräfta närvaron av en vätska bolus efter tumör cells injektion via både ultraljud och direkt visualisering på obduktion under felsöknings fasen förbättrad framgångsrik injektion teknik. Om bildandet av en bubbla inte bekräftas av ultraljud under injektionen, kan placeringen av nålen justeras innan du helt deprimerande sprutan för att frigöra resterande bolus av tumörceller. Vi observerade också att suspension volymer injiceras för snabbt resulterade i spill av tumörceller i bukhålan eller kollaps av vätskan bolus i bukspottkörteln. Generellt, dessa djur fortsatte att utveckla pankreastumörer med undantag av n = 7 djur som visade inga tecken på tumör 4 veckor efter injektion. Detta resultat rapporterades endast i våra första försök (och 6/7 djur injicerades med en låg titer av tumörceller). Möss som har tvivelaktiga tumör cell injektioner, eller kräver omplacering av nålen, bör övervakas noga för utveckling av tumörer utanför bukspottkörteln.

De främsta begränsningarna av ultraljud-guidad metod är tillgängligheten av de nödvändiga instrumenten och den tekniska skicklighet i samband med tumör implantation. Proceduren är inte helt steril, eftersom musen injiceras icke-sterilely på ultraljud plattformen, med sprutan och nålspetsen passerar genom ultraljud gelen. Även om vi inte har sett några tecken på infektion i n = 148 möss över totalt 8 oberoende experiment sedan de inledde dessa studier, är det möjligt att ett smittämne kan komma in i bukspottkörteln genom injektionsnålen under denna process. Som sådan, så många aspekter av protokollet som möjligt (inklusive handskar, ultraljud ytor, is lådor) bör sprutas med desinfektionsmedel eller 70% etanol för att minska den potentiella exponeringen för patogener. En ytterligare begränsning av det nuvarande protokollet var bristen på metastaser med hjälp av cell linjen 4662 vid de aktuella spädningar. Varje cellinje som används i UG-OTIM-systemet bör titreras för önskad tillväxttakt samt metastaserande potential³³. Slutligen etablerade vårt nuvarande protokoll tekniker för injicering av tumörceller i en encellig suspension. Emellertid, tillägg av en extracellulär matris substrat kan läggas till potentiellt förbättra tumör etablering och förhindra tumör cell läckage (eftersom det används i kirurgiska implantations modeller^27,30,31,32). Sålunda, många av begränsningarna av UG-OTIM kan övervinnas med lämplig testning av cellinjer som används i ortotopiska injektioner.

Sammanfattnings, UG-OTIM modellen är en exakt metod för vävnads-riktad injektion av tumörceller i den murina bukspottkörteln. Denna minimalinvasiva implantations teknik gynnar både prövaren och djuren genom att minska Procedurtiden, minimera postkirurgiska komplikationer och förbättra noggrannheten hos injektionen. Tumörer som härrör från UG-OTIM injektioner behålla de karakteristiska immunologiska egenskaperna hos spontana KPC-tumörer, har tillförlitlig tid till tumör debut, och reproducerbara tumörtillväxt kinetik. Således UG-OTIM modell kan användas i en relativt hög genomströmning sätt att förhöra terapeutiska kombinationer i en preklinisk miljö för att avslöja nya behandlingar för patienter med störst icke tillgodosedda kliniska behov.

Materials

50 mL Conicals	Thomas Scientific	2602A26
Blunt edged forceps	Fine Science Tools	11000-12
Cell Dissociation Buffer	Thermo-Fisher	13151014
Cotton Tipped swabs	Thermo-Fisher	19062614
Covidien Monoject 3/10mL, 29G X 1/2"	Thermo-Fisher	8881600145
Depilatory Agent	Amazon	Nair Body Lotion
DMEM	Thermo-Fisher	10-566-016
FBS	Gemini Bio-oroducts	100-106
Flask	Sigma-Aldrich	CLS430825
Forceps (blunt edge)	Fine Science Tools	11000-12
Gauze	Fisher	13-761-52
Gentamicin	Thermo-Fisher	15750060
Induction Chamber	VetEquip	941444
Isofluorane	Penn Vet Supply	VED1350
Isofluorane Vaporizer	VetEquip	911103
L-glutamine	Thermo-Fisher	25030081
Optixcare	MidWest Veterinary Supply	052.50310.3
Paper Tape	Medline	MMM1530Z5
PBS	Thermo-Fisher	14-190-250
Slide warmer	C&A Scientific	XH-2001
Sterilant (Clidox-S)	Fisher Scientific	NC0332382 (activator) NC9189926 (base)	Needs to be combined according to manufacturer's instructions
Sterile Alcohol prep pad	Covidien	6818
Trypsin	Thermo-Fisher	15090046
Ultrasound gel	Thermo-Fisher	03-34-1LT
Visualsonics Ultrasound Vevo 2100	Visual Sonics	Vevo 2100