Summary
Представлено здесь протокол для всего монтажа на месте РНК гибридизации анализа в зебрафиш и трубки формирования анализа в пациента полученных плюрипотентных стволовых клеток, полученных эндотелиальных клеток для изучения роли эндоглина в сосудистой формирования.
Abstract
Сосудистое развитие определяется последовательным выражением конкретных генов, которые могут быть изучены, выполняя на месте гибридизации анализов у зебры на различных стадиях развития. Для изучения роли эндоглина (анг) в формировании сосудов во время развития наследственной геморрагической телеангиэктазии (HHT), морфолино-опосредованный целенаправленный нокдаун eng у зебры используются для изучения его височной экспрессии и связанных с ними функций. Здесь, всего монтажа на месте РНК гибридизации (WISH) используется для анализа eng и его вниз по течению генов в эмбрионах зебры. Кроме того, анализы формирования труб выполняются в HHT пациента полученных плюрипотентных стволовых клеток дифференцированных эндотелиальных клеток (iPSC-ECs; с eng мутаций). Специфическая система усиления сигнала, использующая всю сумму В Situ Hybridization - WISH обеспечивает более высокое разрешение и более низкие фоновые результаты по сравнению с традиционными методами. Чтобы получить лучший сигнал, время после фиксации корректируется до 30 мин после гибридизации зонда. Поскольку флуоресценция окрашивания не является чувствительным в эмбрионах зебры, он заменяется диаминобезидин (DAB) окрашивания здесь. В этом протоколе линии iPSC, полученные от HHT пациента, содержащие мутацию eng, дифференцированы в эндотелиальные клетки. После покрытия пластины с подвальной мембранной матрицы в течение 30 минут при 37 градусов по Цельсию, iPSC-ECs посеяны в качестве монослой в колодцы и хранятся при 37 градусов по Цельсию в течение 3 ч. Затем длина трубки и количество ветвей рассчитываются с помощью микроскопических изображений. Таким образом, с этим улучшенным протоколом WISH, показано, что снижение экспрессии eng влияет на образование эндотелиальных прародителей в эмбрионах зебры. Это также подтверждается анализами формирования трубки с использованием iPSC-ECs, полученных от пациента с HHT. Эти анализы подтверждают роль eng в раннем развитии сосудов.
Introduction
Одна мутация на eng (CD105) была зарегистрирована у пациентов с HHT. Мутация приводит к увеличению пролиферации ЕС и уменьшению потока опосредованного удлинения ЕС1,2. Кроме того, ранее сообщалось, что дефицит ENG снижает экспрессию эндотелиальных маркеров (т.е. kdrl, cdh5, hey2) у зебры3. Эндоглин,в основном выраженный в эндотелиальных клетках, является трансмембранным гликопротеином и функционирует как ко-рецептор для преобразования фактора роста (TGF-) членов семьи. Он направляет bMP9 связывания на поверхности клетки для регулирования вниз по течению гена, в том числе id1 выражение, чтобы вызвать дифференциацию стволовых клеток к ECs4. Таким образом, ген eng играет важную роль в васкулогенезе и сосудистом заболевании человека5,,6. Мы ранее рассмотрели влияние эндоглинное нокдауна на формирование сосудов в эмбрионах зебры, после чего был проведен анализ eCs, полученных iPSCs, приобретенных у пациента HHT, несущего eng мутацию7. Этот протокол демонстрирует влияние дефицита ЭНГ на экспрессию эндотелиального маркера-прародителя и образование труб, что является количественным методом измерения в пробирке ангиогенеза.
Для изучения пространственной и временной экспрессии, WISH используется для обнаружения экспрессии генов in vivo8. На месте гибридизации (ISH) является метод использования помеченных зондов с дополнением последовательностей целевых нуклеинных кислот (ДНК или мРНК) для обнаружения и визуализации целевых гибридов нуклеиновой кислоты в фиксированном образце. Процесс усиливает сигналы экспрессии генов in vivo и используется для обнаружения экспрессии генов с помощью микроскопии. WISH широко используется в различных образцовых животных, особенно у зебры9. Он также используется для получения следующих данных: 1) модели пространственного/временного выражения генов, которые предоставляют информацию о функции гена и классификации; и 2) специально выраженные генные маркеры, которые используются в высокопроизводительных наркотиков или мутантовскрининга 10.
Хромогенные зонды легко деградируют с традиционной хромосомой на месте гибридизации (CISH), что приводит к высокому фоновому шуму и неспецифических сигналов11,12. Метод WISH использует два независимых двойных зонда, которые предназначены для гибридизации для таргетинга последовательностей РНК. Каждый зонд содержит 18-25 последовательности, дополняющие целевую РНК и 14 базовых хвостовой последовательности (концептуализированный как К). Целевые зонды используются в паре (двойной). Две хвостовые последовательности вместе образуют 28 базовый сайт гибридизации для преусилителя, который содержит 20 связывающих участков для усилителя. Усилитель, в свою очередь, содержит 20 связывающих сайтов для зонда метки и теоретически может дать до 8000 меток для каждой целевой последовательности РНК.
Эта передовая технология облегчает одновременное усиление сигнала и подавление фона для достижения одномолекулярной визуализации при сохранении морфологии тканей13. Дальнейшая модификация методов WISH основана на предыдущих исследованиях14,включая дополнительную фиксацию и окрашивание DAB. Здесь предусмотрен улучшенный протокол WISH, который может работать, даже если целевая РНК частично уменьшена или деградирует. Преимущества включают в себя, что она может быть завершена в 24 ч без RNase условиях. Сигналы также могут быть одновременно обнаружены через несколько каналов от нескольких целей, и результаты являются последовательными и совместимыми с результатами различных платформ автоматизации высокой пропускной записи.
Результаты животных моделей не обязательно отражают то же явление, что происходит у людей. ENG содержит две пары консервированных цистеинов, C30-C207 и C53-C182, которые образуют дисульфидные мосты в сиротских регионах. Для дальнейшего изучения роли eng в HHT пациентов, трубки формирования анализы с iPSCs, полученных из пациентов HHT были проведены в клетках без / с eng мутаций (Cys30Arg, C30R)15. После того, как Кубота и др. впервые сообщили о эксперименте по образованию труб16,асссеия была разработана несколькими способами. Он был использован для выявления ангиогенных или антиангиогенных факторов, определить сигнальные пути в ангиогенезе, и определить гены, регулирующие ангиогенез17.
До наличия пациента полученных iPSC-ECs, исследователи использовали в первую очередь культивированные ECs для изучения ангиогенза16. Тем не менее, для эндотелиальных клеток, это техническая задача преобразовать экзогенных генов с вирусом, из-за ограниченного числа прохода, что ECs может пройти. Это потому, что вряд ли достаточно клеточного материала, чтобы быть собраны из человеческих сосудов либо от хирургии или соответствующих утвержденных доноров. С изобретением метода поколения iPSC Синья Яманака, оргтеи человека, полученные из iPSCs, могут быть надежно использованы в экспериментах in vitro, как сообщалось ранее18.
Использование вирусно трансиндуцированных ЭК с ограниченным количеством и проходов может быть достаточно для исследования сигналов, но для функциональных исследований, лучше генерировать мутант плюрипотентных стволовых клеток линий, (либо iPSCs или CRISPER / Cas9-целевых hESCs), а затем дифференцировать их в ECs для ангиогенеза исследований, которые используют трубки формирования анализы19. Формирование труб может быть использовано для оценки функции эндотелиальных клеток, несущих мутации. Этот протокол также описывает образование трубки на пластине ангиогенеза, которая является простым, экономичным и воспроизводимым методом.
Ниже протокол обеспечивает надежный и системный метод для изучения роли конкретных генов в сосудистом образовании, наряду с деталями для in vivo экспрессии шаблона и in vitro функциональной количественной оценки для моделирования заболеваний человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике исследований медицинской школы Университета Чжэцзян.
1. Гибридизация whole-mount на месте
- Зебрафиш линии животноводства и воспроизводства
- Кормите и поднимайте всех взрослых зебры при 26-28 градусах По Цельсию в рециркулирующей системе аквакультуры с 14 ч свет/10 ч темного цикла на каждый день. Используйте линии зебры AB (дикого типа) для следующих процедур.
- Положите слой гальки в нижней части ящика для размножения в качестве укрытия для яиц. Группа родительской рыбы в соотношении 2:1 (т.е. две женщины и один мужчина) в каждой коробке. Пусть самка рыбы нерестится в течение 1 дня. В конце нереста, удалить родителей рыбы немедленно, чтобы предотвратить их от еды яйца.
- Впрысните 2 нг морфолинои и 500 пг мРНК в одноклеточные эмбрионы с помощью системы инъекций Femto Jet под микроскопом (endoglin-MOs последовательность: 5'-GATGAACTCAACCGTCTCTGAT-3'; 5-mispair control MOs последовательность: 5'-AAACACCACATCTCTCTCTC-3').
- Инкубировать зиготы в кислую морскую воду при 27 градусах по Цельсию в течение примерно 48 ч.
- Сбор и фиксация эмбрионов зебры
- Используйте пластиковый трубопроводный пипетка для сбора 20-40 эмбрионов зебры из циркулирующей воды системы (pH 5.0) в трубке 1,5 мл, когда они дехорионатируются и достигают определенного периода развития. Добавьте 1 мл свежеприготовленного 4% раствора PFA при комнатной температуре (RT).
ПРИМЕЧАНИЕ: Период, в течение которого выбранный эмбрион основан на цели эксперимента. В таблице 1 показано время фиксации, необходимое для различных эмбриональных периодов. - Удалить раствор фиксации, мыть эмбрионы с фосфат-буферизированным раствором с Tween-20 (PBST, разбавить 1 мл Tween в 1000 мл раствора PBS) 3x для 5 мин каждый на RT.
- Обезвоживать эмбрионы через инкубацию в серии 25%, 50% и 75% метанола (разбавленного в PBST) в течение 5 мин каждый. Перенесите эмбрионы на 100% метанол на 5 мин и замените свежим метанолом. Храните эмбрионы при -20 градусов по Цельсию на ночь или дольше.
- Используйте пластиковый трубопроводный пипетка для сбора 20-40 эмбрионов зебры из циркулирующей воды системы (pH 5.0) в трубке 1,5 мл, когда они дехорионатируются и достигают определенного периода развития. Добавьте 1 мл свежеприготовленного 4% раствора PFA при комнатной температуре (RT).
- Гидратация и пищеварение
- Увлажняют эмбрионы, которые сохранились в 100% метаноле с помощью сито с нейлоновой сеткой внизу, чтобы последовательно мыть эмбрионы в колодцах 12 колодцев с серией 75%, 50% и 25% метанола (разбавленного в ПМСТ) по 5 мин каждая. Вымойте эмбрионы с PBST 3x в течение 5 минут каждый на RT.
- Добавьте 50 кл тенеазы K (10 мг/мл) в трубку с эмбрионами и следуйте времени пищеварения в таблице 2 на RT.
- Удалите протеиназа K и мыть эмбрионы с PBST 3x в течение 5 минут каждый на RT.
- Гибридизация зонда и постфиксация
- Поместите зонды, разработанные в соответствии с последовательностями мРНК каждого гена, в систему гибридизатина в размере 40 градусов по Цельсию до тех пор, пока осадок не растворится, который должен занять 10 мин. Смешайте целевые зонды, например (XM_007116,7) и еще два важных гена включают в раннее образование мезодерного эндотеиального протеже (здесь, aplnr NM_001075105.1» и nrp1a NM_001040326.1) в трубке 1,5 мл при соотношении 50:1:1.
- Добавьте 50-100 л смешанных целевых зондов в каждую трубку с эмбрионами, затем инкубировать на ночь при 40 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно смешанные зонды должны быть предварительно разогреты до 40 градусов по Цельсию и охлаждаться до RT перед использованием. - Приготовьте раствор цитрата соля 0.2x с помощью Tween-20 (SSCT): растворите 175,3 г NaCl и 88 г цитрата натрия в 1 л dH2O, чтобы получить 20x раствор SSC. Затем разбавить раствор 1:100 в dH2O, чтобы получить раствор 0,2 х SSCT. Разбавить Tween-20 1:1000 в растворе 0.2x SSCT.
- Перенесите переработанные зонды в новую трубку. Вымойте эмбрионы в 0.2x SSCT раствор 3x на 15 минут каждый на RT. Переработанные зонды можно повторно использовать 5x-10x.
- Используйте 4% параформальдегида (PFA), чтобы исправить эмбрионы в течение 30 минут на RT. Вымойте эмбрионы в 0,2x SSCT раствор 3x для 15 мин каждый на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Работа Гросс-Thebing и др. предполагает пост-фиксирующий период 10 мин14, но фактическая сумма должна быть скорректирована соответствующим образом. Здесь мы протестировали 10 мин после фиксации 3x, и чувствительность DAB умирает значительно влияет. После исследования убедитесь, что 0,5-1,0 ч фиксации является оптимальным состоянием (более короткий период фиксации не может дать четкий сигнал от целевой РНК, а соответствующее продление времени фиксации помогает укрепить сигнал и обеспечить меньше фонового шума).
- Последовательное усилитель и гибридизация зонда этикетки
- Удалите раствор SSCT и замените 50 Зл Amp 1. Разрешить эмбрионам поселиться в Amp 1 при 40 градусах по Цельсию в течение 30 минут. Затем промойте эмбрионы в 0,2x SSCT раствор3x на 15 минут каждый на RT.
- Удалите раствор SSCT и добавьте 50 зл Имп 2. Разрешить эмбрионам поселиться при 40 градусах по Цельсию в течение 15 мин. Затем промойте эмбрионы в 0,2x SSCT раствор3x на 15 минут каждый на RT.
- Удалите раствор SSCT, добавьте 50 кЛ Amp 3 и слегка коснитесь трубки. Затем инкубировать эмбрионы при 40 градусах по Цельсию в течение 30 минут. Вымойте эмбрионы в растворе 0,2x SSCT 3x на 15 мин каждый на RT.
- Удалите раствор SSCT, добавьте 50 qL Amp 4 dropwise и осторожно коснитесь трубки. Затем инкубировать эмбрионы при 40 градусах по Цельсию в течение 15 мин. Вымойте эмбрионы в 0,2x SSCT 3x по 15 минут каждый на RT.
- Противодействие и микроскопия
- Удалите раствор SSCT и добавьте 50 кВ DAPI к каждой трубке. Инкубировать эмбрионы на ночь при 4 градусах Цельсия.
- Вымойте эмбрионы с PBST и подготовить их для визуализации с помощью 1% низкой точки плавления агароз (LMP) растворенный в 100 мл dH2O) в чашке Петри заполнены PBST.
- Используйте комплект субстрата по пероксидазе DAB, чтобы испачкать образец. Добавьте цветные реагенты A, B и C (по 50 л каждый) к 1 мл дистиллированной воды и хорошо перемешайте, чтобы получить полную рабочую жидкость DAB. Добавить жидкость к образцу и накрыть 10 мин.
- Вымойте образец тщательно с PBST после окрашивания.
- Используйте оптический микроскоп с фотографической функцией для визуализации образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: При съемке позже трубки следует заворачивать в алюминиевую фольгу и хранить при 4 градусах Цельсия.
2. Труба формирования асссе
ПРИМЕЧАНИЕ: Eng eng мутант и wildtype ECs (контроль) были дифференцированы от iPSCs, полученных от пациента HHT (здесь, 62-летняя пациентка с рецидивирующим эпистаксисом с 22 лет, желудочно-кишечные кровотечения, легочные артериовенозные пороки развития, проведение неправильной эг мутации в положении c.88T'gt;C exon 2) и здоровый донор (без eng мутации), которые были предоставлены Пекинского союза медицинский колледж больницы с одобрением от комитета по этике исследования колледжа.
- Культура элементов управления и HHT iPSC клеток
- Добавьте определенный объем подвальной мембранной матрицы (например, Matrigel) в 6 хорошо клеточной культурной пластины, чтобы покрыть дно колодца и инкубировать пластины в течение 1 ч при 37 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: При первом использовании мембранной матрицы подвала, хранящейся при -20 градусах Цельсия, инкубировать на льду или в морозно-свободном холодильнике 4 градусов по Цельсию до тех пор, пока разморозится. Затем разбавить в 1:100 в DMEM/F12, а затем распределить разбавителя в 200 тюбиков, содержащих по 100 л каждый. Храните трубки при температуре -20 градусов и избегайте повторных замерзаний и оттаивания. При добавлении разбавленной мембранной матрицы подвала не создавайте пузырьков. После добавления разбавленной мембранной матрицы подвала, встряхните 6 хорошо пластины осторожно вручную, так что она равномерно покрывает дно. - После покрытия пластины, удалить используемый подвальный мембраны матримный раствор из скважин. Затем добавьте 2 мл среды mTeSR1 в каждую скважину, и пластины iPSCs собраны из последнего прохода примерно 1 х 106 за скважину.
- Добавьте определенный объем подвальной мембранной матрицы (например, Matrigel) в 6 хорошо клеточной культурной пластины, чтобы покрыть дно колодца и инкубировать пластины в течение 1 ч при 37 градусов по Цельсию.
- Генерация и расширение eCs из iPSC
- После примерно 4 дней культуры iPSC, обмен культуры среды с BEL среды дополняется активицина А (25 нг/мл), BMP4 (30 нг/мл), VEGF165 (50 нг /мл), и CHIR99021 (1,5 мкм). Выращивайте клетки в течение 3 дней для генерации клеток мезодерма.
- Замените среду, описанную в шаге 2.2.1, на белизну, дополненную VEGF (50 нг/мл) и SB431542 (10 мкм) на 4 дня для расширения сосудистых ЭК. Лечить клетки с той же средой и культуры в течение еще 3-4 дней.
- Используйте CD31-динабии для очистки зрелых сосудистых ECs: обратитесь к инструкциям в cd31-динабии комплект, который связывает человека CD31 антитела с магнитными бусинами, чтобы объединить CD31 молекул, выраженных на ECs, а затем собирать CD31-положительных клеток с помощью элютионного буфера. Поддержание и расширение очищенных eCs в среде EC-SFM, содержащей VEGF165 (30 нг/мл), bFGF (30 нг/мл) и FBS (1%).
- Покрытие эндотелиальных клеток на пластинах с покрытием Matrigel и микроскопия
- Добавьте 10 qL матрицы мембраны подвала в наилучшим образом для того чтобы покрыть плиты ангиогенеза (см. Таблица материалов)и инкубировать на 30 min на 37 C.
- Урожай эндотелиальных клеток после проверки эндотелиальных маркеров CD31 и VE-кадерин с иммунофлюоресценции окрашивания и вновь приостановить их в эндотелиальной среде роста 2 путем pipetting неоднократно. Добавьте 50 кЛ клеточной суспензии (2 х 105 клеток/мл) на затвердевную матрицу и инкубировать клетки в течение 3-5 ч при 37 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед экспериментом по формированию трубки следует проверить эндотелиальные маркеры, чтобы убедиться в надлежащем фенотипе функциональных эндотелиальных клеток. 1 х 104 ячейки на скважину является идеальным числом для формирования трубки. Слишком много или слишком мало клеток не способствуют образованию трубки. Добавить клетки со стороны блюда и не прикасайтесь к матрице мембраны подвала. Используйте легкий микроскоп в поле высокого увеличения, чтобы проверить клетки и сфотографировать.
- Количественные результаты образования труб
- Наблюдайте за результатами с помощью микроскопа с высоким разрешением и сфотографируйте по крайней мере 10 областей для каждой группы для получения надежной статистики данных.
- Изучите образование эндотелиальной трубки: оцените степень образования трубки путем осмотра общей длины трубки, номера трубки и точек ветки. Оцените и подсчитайте количество и длину ветвей с помощью программного обеспечения ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Целое крепление на месте гибридизации основано на принципе, похожем на флуоресценцию резонансной передачи энергии. Он предназначен для улучшения как чувствительности и специфичности в zebrafish ISH, а также усилить целевые сигналы, не влияя на фоновый сигнал.
В 24 л.с. зебры эмбрионов, эндоглин высоко выражен в задней кардинальной вены (PCV), межсегментных сосудов (ISVs), и крови островов3. Трудно контролировать время окрашивания в традиционной хромогенной гибридизации на месте (CISH), при этом в некоторых регионах возникают непозитивные сигналы, такие как желтковый мешок(рисунок 1А). Для исследования роли eng в раннем развитии сосудов, гемогенный эндотелиальный маркер был использован(aplnra), а также другой эндотелиальный маркер прародителя(nrp1a) для изучения того, какой тип эндотелия был затронут заглушителем20. eng Выражение aplnra и nrp1a было слабым в 24 л.с. эмбрионов. По сравнению с CISH, слабый сигнал от двух генов был четко продемонстрирован в области хвоста после нокдауна eng в WISH(рисунок 1B). Нокдаун ENG РНК вызвало снижение экспрессии двух типов эндотелиальных клеток маркера генов экспрессии в модели HHT животных.
Перед проведением экспериментов на дифференцированных iPSCs, клетки были определены и подтверждены как ECs. Морфологически они предстали в виде булыжника. Выражение эндотелиальной поверхности клеток молекулярных маркеров CD31, CD146, VE-кадерин, и vWF было подтверждено с IF окрашивания21. После магнитной изоляции с помощью CD31, функциональный результат был проведен, как описано ниже.
Здесь, труба формирования ассе был выполнен с использованием eng мутант и контроль iPSC полученных эндотелиальных клеток. Статистический анализ проводился на основе количества, ветвей и длины трубок. Новый параметр был также введен на основе предыдущей работы3, точки ангиогенеза, с тем чтобы отразить образование трубки эндотелиальных клеток. В конце концов, было установлено, что eng мутант эндотелиальных клеток формируется меньше ветвей, чем контроль эндотелиальных клеток, и что ветви в eng мутант эндотелиальных клеток значительно увеличилось после стимуляции с сосудистыми эндотелиального фактора роста (VEGF) (Рисунок 2A, B). Мутация в eng привела к дефектному образованию трубки сосуда.
Рисунок 1: Эндоглин нокдаун уменьшил выражение эндотелиальных маркеров. (A) CISH и WISH были выполнены, чтобы определить выражение эндоглина в 24 л.с. эмбрионов (n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Красная коробка представляет увеличенную область. Шкала баров 200 мкм. (B) aplnra и nrp1a выражение WISH в 24 л.с. зебрафиш эмбрионов управления-MO и eng-MO группы. Красная стрелка указывает на области, где экспрессия этих генов значительно снизилась. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Формирование трубы eng mutant и управление iPSC-ECs. (A) Формирование трубки четырьмя группами, в ключая контрольную группу, контрольный элемент VEGF (контроль ные эндотелиальные клетки , 30 нг/мл VEGF), eng mutant(eng mutant endothelial cells) группа, и eng mutant - VEGF(eng mutant endothelial клетки) группа. Формирование труб было оценено и сфотографировано после 3 ч. Шкала баров 100 мкм. (B) Количественные результаты формирования трубки показаны. На крытой области количество ветвей и их длина труб были рассчитаны Image J. Ошибка баров представляют SD средних значений из трех независимых экспериментов. Значение P считалось статистически значимым, когда qp qlt; 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Эмбриональный период | Время фиксации |
| 4-клеток до 8 л.с. | 4 часа |
| 8 л.с. до 24 л.с. | 1 час |
| 24 л.с. до 4 dpf | 30 минут |
Таблица 1: Время фиксации, необходимое для различных эмбриональных этапов.
| Эмбриональный период | Время пищеварения |
| 4-клеток до 8 л.с. | 2 минуты |
| 8 л.с. до 24 л.с. | 5 минут |
| 24 л.с. до 4 dpf | 10 минут |
Таблица 2: Время пищеварения, необходимое для различных эмбриональных этапов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол применил улучшенную цельномонтажную платформу анализа РНК на месте для анализа зебры и анализов образования труб на iPSC-ECs, полученных от пациента HHT. Традиционный метод ISH требует более длительного экспериментального цикла с дополнительными экспериментальными шагами. Протокол имеет некоторые важные улучшения, использование независимых двойных зондов и iPSCs, полученных от пациента с HHT, которые были применены в WISH анализы и трубки формирования, соответственно. Эти уточнения имеют решающее значение для повышения чувствительности обнаружения по сравнению с тем, что наблюдается с традиционным ISH. Уникально разработанные зонды и усиление сигнала цели позволяют обнаружить редко выраженные транскрипты(aplnra плохо выраженный ген в 24 hpf зародышах). Одной из модификаций является дополнительная фиксация после гибридизации зонда. Дополнительная фиксация может улучшить сочетание зондов и транскриптов. DAB окрашивание также применяется, а не флуоресценции окрашивания, потому что было установлено, что было трудно выполнить флуоресценции окрашивания в некоторых генов с низким изобилием. Затем, iPSCs были использованы для ангиогенеза анализы, что повышает значимость и актуальность клиники этой работы. Генерация iPSCs требует строгих условий культуры и представляет собой ограничение протокола.
Необходимо выделить некоторые критические шаги. При анализе WISH время переваривания эмбрионов зебры должно соблюдаться в строгом соответствии с текстом. Более короткое время пищеварения не может гарантировать, что зонд успешно сочетается с транскриптами. В отличие от этого, расширенное время пищеварения уничтожит целостность эмбрионов. В экспериментах по формированию трубки время визуализации должно быть хорошо контролируемым. Как правило, эндотелиальные клетки станут трубами в течение 12 ч, но трубчатая структура имеет тенденцию к распаду после 24 ч. Номер клетки также важн для образования пробки, по мере того как плотность клетки которая слишком высока или слишком низка может вести к несутому образованию пробки. Если трудно вызвать эндотелиальные клетки, чтобы сформировать трубки, полезно включить добавление факторов роста, таких как VEGF в среде культуры в качестве положительного контроля для проверки способности eCs формировать трубчатые структуры.
Таким образом, усовершенствованный метод WISH считается выгодным методом для лабораторных рабочих процессов. Недавно наша исследовательская группа начала тестировать этот анализ в клинических образцах. Учитывая более высокую чувствительность и более эффективное обнаружение, чем наблюдается в традиционных методах, этот улучшенный метод WISH имеет значительные перспективы для разработки и внедрения РНК на основе молекулярной диагностики22.
Производительность анализа формирования трубки с использованием пациента iPSC-ECs позволяет подтвердить результаты исследований на животных, а также выявление вызывающих заболевание мутаций из одного нуклеотидного полиморфизма в гене eng. Сочетание этих методов разъясняет роль eng в сосудистой формации и провести потенциал в генной коррекции пациента iPSC-ECs для сердечно-сосудистой клеточной терапии23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от Национальной ключевой программы исследований и разработок Китая-ствола клеток и трансляционных исследований (грант номер 2016YFA0102300 (в Цзюйнь Ян);Фонд науки о природе Китая (грант no 81870051, 81670054 (в Jun Yang)) ; Инновационный фонд медицинских наук CAMS (CIFMS) (грант No 2016-I2M-4-003 (в Цзюнь Ян)) ; PUMC Молодежный Найдено и фундаментальных научно-исследовательских фондов для центральных университетов (грант номер 2017310013 (к Fang Чжоу)) ".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide Angiogenesis | ibidi | 81506 | Cell culture |
| Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | Signal Amplification |
| Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | Signal Amplification |
| Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | Signal Amplification |
| Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | Signal Amplification |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Growth factor-reduced Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNAase-free Water |
| Human Endothelial-SFM | Thermofisher | 11111044 | Cell culture |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Fixed Cells |
| Protease K | ACD | SDS 322337 | Digest tissue |
| Sodium Citrate | Sigma | 6132-04-3 | SSCT solution: Wash Buffer |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | Growth factor |
References
- Jin, Y., et al. Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling. Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).
- Sugden, W. W., et al. Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues. Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).
- Zhang, D., et al. Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish - implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia. Bioscience Reports. 39 (5), (2019).
- Lawera, A., et al. Role of soluble endoglin in BMP9 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).
- Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2019).
- Gomez-Puerto, M. C., et al. Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension. The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).
- Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family. Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).
- Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies. Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).
- Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nature Communications. 7, 13787 (2016).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
- Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas. Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).
- Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH. Methods. 98, 50-59 (2016).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).
- Fang, Z., et al. EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Pulmonary Circulation. , (2019).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).
- Clayton, Z. E., et al. Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model. Bioscience Reports. 38 (4), (2018).
- Rufaihah, A. J., et al. Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease. Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).
- Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association. Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).
- Wang, L. Y., et al. Apelin attenuates TGF-β1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-ε in human renal tubular epithelial cells. Peptides. 96, 44-52 (2017).
- El Hallani, S., et al. Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature. Biomed Research International. , 1-9 (2014).
- Anderson, C. M., et al. Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).
- Sun, X., Tan, G., Liew, R. Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).
