Summary
本手稿描述了使用高频超声成像测量腹部主动脉瘤小鼠模型上的光径、脉冲传播速度、不强度和径向应变的详细方案。
Abstract
腹部主动脉瘤 (AAA) 定义为腹部主动脉的局部扩张,其内光直径 (MILD) 超过其原始尺寸的 1.5 倍。临床和实验研究表明,小动脉瘤可能破裂,而大动脉瘤的亚群可能保持稳定。因此,除了测量主肠的内光直径外,对船壁结构特征的了解可以为评估AAA的稳定性提供重要信息。主动脉硬化最近成为确定血管壁早期变化的可靠工具。脉冲传播速度 (PPV) 以及不透度和径向应变是用于评估主动脉刚度的非常有用的超声方法。该协议的主要目的是提供一种全面的技术,用于使用超声成像系统获取图像并分析由MILD、PPV、不透度和径向应变确定的主主的结构和功能特性。
Introduction
腹部主动脉瘤(AAA)代表一种严重的心血管疾病,其特征是主动脉的永久局部扩张,超过原始血管直径的1.5倍1。AAA在美国死亡率排名前13位。AAA的进展归因于主动脉壁的退化和乳突分裂,最终导致主动脉破裂。主动脉壁的这些变化可能发生,没有显著增加最大宫内直径(MILD),从而表明,仅MILD不足以预测疾病的严重程度3。因此,需要确定其他因素来检测主动脉壁的初始变化,这可能指导早期治疗方案。该协议的总体目标是为使用超声波成像(以脉冲传播速度 (PPV)、不扩展性和径向应变的测量为特征,为评估主动脉功能特性提供实用指南。
Daugherty及其同事首先描述的一种研究AAA的具有良好特征的实验模型,涉及通过Apoe-/-小鼠4的渗透泵进行血管紧张症II(AngII)的皮下输注。使用超声波成像对MILD的精确测量有助于描述这种小鼠模型5中的AAA。虽然在AAA开发过程中组织学的变化得到了广泛的研究,但船壁的功能特性变化,如主动脉刚度,并没有得到很好的描述。该协议强调将高频超声与精密分析相结合作为研究AAA时间进展的有力工具。具体来说,这些方法使我们能够评估由PPV、不强度和径向应变测量的容器壁的功能特性。
最近对AAA的人类受试者以及鼠乳酸酶诱导的AAA模型的临床研究表明,主动脉刚度与主动脉直径6、7之间存在正相关关系。PPV是主动脉刚度的指标,被认为是量化血管壁6、8刚度变化的极佳测量指标。PPV是通过测量脉冲波形在血管沿线两个位点的传递时间来计算的,从而提供主动脉刚度的区域评估。我们最近已经证明,PPV测量的主动脉刚度增加,在使用原子力显微镜确定的细胞水平上,与动脉瘤发育正相关9。此外,文献还表明,主动脉刚度可能先于动脉扩张,因此在AAA10开发过程中,可提供有关血管壁区域内在特性的有用信息。同样,不测量性和应变测量是测量动脉适应性早期变化的定量工具。健康的动脉是灵活和弹性的,而随着刚度增加和弹性降低,不粘度和应变降低。在这里,我们为使用高频超声系统测量小鼠的MILD、PPV、失散性和径向应变提供了实用的指南和分步协议。该协议提供了技术方法,应结合特定超声成像仪器手册和随附的视频教程提供的基本信息进行使用。重要的是,在我们手中,所述的成像协议提供了可重复的准确数据,这些数据在实验AAA的发展和进展研究中显得有价值。
为了进一步证明超声成像的效用,我们提供了从我们自己的研究中拍摄的示例图像和测量,这些研究旨在使用药理学方法来预防实验性AAA11。具体来说,切口信号已被建议涉及血管发育和炎症的多个方面12。使用基因单倍素和药理学方法,我们先前已经证明,Notch抑制通过防止巨噬细胞在血管损伤部位的渗透,减少小鼠AAA的发展。对于目前的文章,使用药理方法的Notch抑制,我们专注于主动脉刚度和与AAA相关的因素之间的关系。这些研究表明,Notch抑制降低主动脉刚度,这是AAA级11的量度。
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Protocol
处理小鼠和超声成像的规程得到了密苏里大学动物护理和使用委员会的批准(动物协议号8799),并根据AAALAC国际进行。
1. 小鼠的设备设置和制备
- 设备设置
- 打开超声波仪器、超声波凝胶加热器和加热垫。
- 打开超声波程序,输入每个鼠标的研究名称和描述性信息。
- 选择应用程序作为常规映像。
- 选择合适的传感器进行腹部成像 (图 1B,C)。在本实验中,使用MS400传感器。
- 确保麻醉的电子曲和氧气水平足以用于每个实验阶段。
- 清洁超声波动物成像平台。
- 鼠标准备
- 将鼠标保持架放在加热垫(36.5 至 38.5 °C)的顶部。
- 轻轻地握住鼠标的尾部,并放置在充满氧气的旋翼室中。
- 将直流和氧气流向感应室。
- 打开非卢兰蒸发器,将子组水平设置为 1-2 vol/vol.将氧气罐压力打开至 1-2 L/min。
- +2分钟后,在捏住鼠标的脚垫时,通过没有戒断反射来确认麻醉的充分深度。
- 接下来,关闭感应室供应分支,打开指向麻醉鼻锥的分支。
- 将小鼠从感应室转移到超声波成像阶段,并将麻醉锥置于动物的鼻子上。
- 将动物成像平台大约 10° 倾斜到右下角,以实现最佳扫描(图 1B)。
- 在小鼠的两只眼睛中加入一滴无菌眼科溶液,以防止麻醉下干燥。
- 将鼠标置于苏皮纳位置,将鼠标的鼻子插入麻醉锥中。
- 使用棉签将电极凝胶涂到所有四个爪子上,并将爪子胶带涂在动物成像平台上的铜引线上,用于心电图读数(图1C)。
- 使用剪发器在成像部位修剪头发,然后涂抹脱毛霜以去除剩余的毛皮。离开不到1分钟。
- 用湿纸巾轻轻擦去奶油和头发。
- 监测呼吸,确保心率保持在450-550次/分钟之间。如果低于此水平,减少离心流,并等待心率恢复。
- 将预热的超声波凝胶(37°C)涂抹在制备的皮肤部位,并将传感器连接到其支架上,然后向下安装,直到接触凝胶(图1C)。
2. 腹部主塔的超声成像
- 水平放置传感器(即垂直于鼠标中线)。
- 使用棉签的木棒平滑超声波凝胶并去除气泡。
- 接触凝胶后,降低传感器,将隔膜下方0.5 -1厘米放置。现在开始观察图像。
- 在短轴视图中可视化腹部主塔 (图 1C)。
注: B 模式是解剖学定位主塔并定位传感器的默认和最有效的模式。腹部主塔由在短轴(即主轴的圆周横截面)中使用彩色多普勒和功率多普勒模式的脉动流来识别。调整动物舞台上的微操作器和传感器,将主塔的横截面带到图像的中心。 - 顺时针轻轻旋转传感器 90°,然后缓慢调整 x 轴微操作器旋钮,在长轴视图中(主轴的纵向部分)中可视化主摆。
注:在许多情况下,胃肠道气体可能会干扰图像,或者主塔可能未处于最佳角度,以允许清晰的长轴视图。缓慢和水平地调整传感器的角度,直到获得可接受的长轴视图。如果问题仍然存在,请提升传感器,检查传感器下的气泡,稍微调整动物阶段的倾斜角度,重新涂抹凝胶,然后重复所有步骤。 - 分别使用"焦点"和"焦点深度"切换设置主塔区域的对焦区域和深度。手动调整时间增益补偿滑块,使主塔的流明变暗,以实现主塔壁的最佳对比度。
- 调整y 轴操纵器,以可视化上一级肾动脉和右肾动脉的分支点。使用右肾动脉作为地标来捕捉上主动脉的图像(图2A)。
- 在上主塔上记录至少 100 帧 B 模式图像。
- 按 Cinestore 保存 B 模式图像。
- 按仪器键盘上的M 模式按钮以启用 M 模式录制。滚动光标球,将黄色指示线带到具有清晰血管壁图像的正常主动脉部分,或到观察到动脉瘤最大直径的部分。
- 按下SV/栅极切换并调整光标球,以确保测量支架中包括容器壁。按更新记录 M 模式测量值,然后按Cinestore进行捕获 (图 2A,B)。
注: 动脉瘤的最大直径可能与主动脉的最佳长轴视图不在同一成像平面上。对于每个 M 模式测量,稍微调整 x 轴操纵器旋钮,以确保捕获每个部分的 MILD。 - 要获得 ECG 门基赫兹可视化 (EKV) 图像,请按B 模式按钮返回 B 模式录制。
注:如果图像不清晰,则调整 x 轴操纵器,以在截面长度(即 > 6 mm)上壁上壁上实现最清晰的图像。 - 按键盘上的"物理设置"按钮,然后选择"呼吸浇注"。手动调整浇注延迟和窗口,以便仅在呼吸波的平坦部分记录数据。记录部分将在呼吸波的跟踪上显示为彩色块。
注:如果不调整呼吸门,EKV图像将因动物在呼吸过程中的正常运动而模糊。 - 按EKV 按钮可启用 EKV 模式。在相应的菜单中,选择"标准分辨率"和"帧速率 3000"或更高。选择继续录制EKV图像。按电影商店保存图像。使用 EKV 模式图像获得脉冲传播速度 (PPV)、不透度和径向应变的测量值。
注:如果呼吸出现异常波动、动物呼吸过快或帧速率设置过高,EKV 记录可能会失败。在这种情况下,将帧速率设置为较低,并等待动物呼吸稳定。将帧速率设置为 3000 通常适用于小鼠和大鼠。
3. 成像后步骤
- 用用温水润湿的纸巾轻轻擦拭小鼠腹部的超声波凝胶。
- 将鼠标放回家庭笼子的加热垫上。
- 关闭异胶机,用湿巾清洁动物成像平台和传感器。
- 将超声波扫描期间收集的图像数据传输到硬盘。
- 关闭超声波仪器。
- 小鼠从麻醉中恢复并发出警报后,取出加热垫并将笼子返回到动物外壳架。
4. 腹部主动脉图像分析
- 分析 M 模式图像以测量 MILD
- 打开超声波程序,输入每个鼠标的研究名称和描述性信息。
- 打开分析软件中的超声波数据并打开 M 模式图像并暂停心跳。
- 单击"测量"。
- 从下拉选项中选择血管包。单击"深度",在从内壁延伸到墙壁的主动脉流明上绘制一条线(图 2C,D)。
注:为了保持一致性,当主数最大化时,应在心脏周期的收缩阶段进行测量。在三个不同的心跳中绘制三条线,以获得 MILD 的精确和平均测量值。在 AAA 中,测量是在主塔的最大扩张处进行的。建议在收集图像之前快速观察动物 4-6 小时,以避免肠道运动受到干扰,并确保图像清晰。
- 脉冲传播速度分析
- 打开 EKV 图像并暂停检测信号。
- 单击名称图标,打开分析软件(例如 Vevo Vac)上的新窗口。
- 单击PPV 选项(图3D中的箭头 )。主塔的图像将进一步显示一个小窗口。
- 通过单击上部容器壁并拖动指针约 4 mm 覆盖上主塔的两个壁来绘制矩形框。
注:保持所有图像的框长度一致 (±4 毫米)。用户可以通过旋转来调整矩形框以对齐框,然后选择线,然后拖动到被分析的容器上的新位置,以获得脉冲波最合适和清晰的拐点。来自矩形的垂直数据线将显示并标识为 ROI 上的左侧(上图)和右侧(下图)。为了更好地可视化脉冲波的拐点,有时仅对上壁上的绘制框有用,如图3所示。软件将自动计算 PPV (m/s)。但是,最好手动调整紫色线,以设置脉冲波上的确切拐点,PPV 会相应地更改。 - 最后,选择"接受"命令以保存 PPV 值。将图形和数据导出到数据存储驱动器。
- 失散性和径向应变分析
- 打开 EKV 图像并暂停检测信号。
- 单击软件图标。该软件将打开一个新的窗口。
- 单击跟踪的新 ROI,并在容器的两面墙壁上绘制一个矩形框。该软件将自动跟踪船只的上壁和下壁。用户可以通过单击绿色点来调整轨迹以对齐墙壁(图 4A,B)。
- 现在接受跟踪。该软件将计算所选 ROI 中的不强度性 (1/Mpa)。
- 对于径向应变测量,请从左上角的菜单栏中选择相应的应变选项。径向应变和切向应变的图像将打开。
- 获取径向应变值 (%)通过在曲线的峰上移动光标。将数据导出为图像或视频格式(图4A,B)。
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Representative Results
图2A和图2B分别显示了小鼠正常和动脉瘤主动脉的代表性M模式图像。 上腹主动脉由右肾动脉和上流的动脉旁的位置确定(图2A)。在收缩性心脏周期的三个不同心跳处,在正常动脉瘤和动脉瘤中,用于计算MILD的代表性图像分别如图2C,D所示。在主动脉瘤已经形成的情况下,亮度直径是通过在最大扩张区域的流明的两个内缘之间绘制一条垂直的黄线来确定的(图2B)。通常对三个独立的测量值进行平均值,以确定精确的内部光径。
图3显示了用于PPV分析的腹部主塔的代表性EKV图像。PPV的计算方式是在上主塔的发光壁上绘制一个矩形框(图3E),并调整从矩形框获得的数据紫色垂直线(图3F)。应调整紫色线以设置脉冲波的拐点。代表EKV图像的腹部主大肠适合分析不强度和径向应变如图4所示。抗性和径向应变是通过跟踪上主塔的亮度壁来计算的,如图4E所示。不强度值 (1/MPa) 是通过从框的下拉菜单中选择不强度/弹性选项(红色箭头,图 4F)获得的。径向应变 (%)通过选择径向应变选项(图4G)并将光标移动到径向应变图的峰值(图4H)获得。
我们验证了PPV在AAA的安II诱导小鼠模型中的重要性,并进一步研究了Notch抑制剂(N-_N-(3,5-二苯乙酰)-L-丙基-(S)-苯基甘醇t-丁基酯的治疗潜力;DAPT)关于预先建立的AAA的进展和稳定性。具体来说,所有这些动脉瘤研究是在8-10周大的Apoe-/-雄性小鼠输注后通过公布的协议4,13。在安二输液第28天,小鼠被随机分成两组,并施用车辆或DAPT(10毫克/千克),直到第56天13日牺牲。跨腹腔超声成像显示MILD、PPV逐渐增加,不变性和径向应变减少,对第28天对AngII的反应(图5A-E)。与安二号相比,安吉输液从第28天到56日温和微增,而DAPT与安吉独立(图5A和图5B)相比,MILD没有显著变化( 图5A和图5B)。然而,PPV逐渐增加,从第28天到第56天,安二输注和DAPT显著减少PPV在第56天进一步增加(图5C)。抗性及径向应变,评估血管壁弹性的参数随安格II输注而降低,而DAPT无显著效果(图5D和5E)。请务必了解 PWV 在第 28 天与 MILD 的强相关(R2=0.51,图 5F),而在第 56 天,相关性相对较弱(R2=0.22)(图 5G)。AAA 的主动脉刚度主要与主动脉壁结构的变化有关。从组织学上讲,AngII输注增加了主动脉中层的胶原蛋白降解和蛋白流活性(图5H,顶行)。DAPT 处理最大限度地减少了 ECM 降解中的此类变化(图 5H,底部行)。
图 1:仪器的设置。(A) 超声波机的整体视图,以及麻醉和凝胶加热器的感应室。(B) 成像平台和传感器系统的特写视图.(C) 传感器放置视图,同时捕获腹部主塔的短轴图像。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:分析M模图像,以获得最大内光直径(MILD)。显示了小鼠的正常主动脉 (A) 和主动脉与腹部主动脉瘤 (B) 的 M 模式图像.( C ) 和(D ), MILD 在正常小鼠(C) 和 AAA (D) 小鼠的上主主曲中,在心脏周期的收缩阶段绘制。三个不同心跳的测量如图所示,并计算平均值。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:用于获取脉冲传播速度(PPV)的EKV图像分析。从正常鼠标大托收集的 EKV 图像。分析是通过单击测量 (A) 和软件图标 (B) 来完成的.右侧将显示一个新窗口,图标位于右侧,如C所示。现在,点击PPV(D),再一次,一个小窗口会出现(E)。在流明的上壁上画一个矩形框,如 E 所示,然后单击"接受"。PPV 值将如F(箭头)所示获得。调整紫色线以设置脉冲波 (G) 的拐点。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:不强度和径向应变的测量。从正常鼠标大托收集的 EKV 图像。分析是通过单击测量 (A) 和软件图标 (B) 来完成的.右侧将显示一个新窗口,图标位于右侧,如C所示。现在,点击跟踪新的ROI (D),一个新的窗口会出现一个新的窗口,在流明的上壁和下壁上显示痕迹,如E和点击接受。不强度值将在表中获得,如F中显示的那样。对于应变,单击应变 (G)。该窗口将显示径向应变值(,绿色突出显示框),因为光标位于径向应变图(H) 的峰值上。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:PPV与已建立的AAA中主大的结构特征相关。(A) 代表性的跨腹腔超声图像显示MILD在第0、28、42和56天指示的实验组在Apoe-/-小鼠。DAPT 于第 28 天启动。点状的黄色线条勾勒出流明。(B) 在指示组(紫色和绿色显示安II + 车辆和安吉 ® DAPT 处理小鼠 (n=16-18) 中,对 MILD 进行量化。(C、 D 和 E)在安吉和DAPT治疗(n=8)不同日子的PPV、不强度和径向应变。(F 和 G), 显示皮尔逊在第 28 天(F)和第 56(G) 的 PPV 和 MILD 之间的相关性的图表。(H) 代表组织学图像胶原蛋白染色(染色三铬,被视为蓝色染色)和蛋白水解活性,在原位酶学,无论是否DAPT处理第56天。图基多比较测试用于数据分析。•P<0.05;ns = 非显著性。以 H 为单位缩放 50 μm。这个数字改编自夏尔马等人(2019年),《科学报告》(SREP-19-16491B)11。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
超声成像提供了一种强大的技术,通过测量PPV、不透度和径向应变来确定主主的功能特性。这些测量对于研究AAA的小鼠模型特别有指导意义,并且体内方法允许收集对了解主动脉病理学的时间发展可能很重要的纵向数据。具体来说,在腹部主动脉的测量通过PPV、不均匀性和径向应变在腹部主动脉中通过分析EKV数据确定,并被认为是AAA不稳定性16的独立危险因素。这些协议中描述的技术相对直接,只需 8-10 分钟,从一个鼠标获取图像集。所有图像最好由单个操作员使用定义明确且一致的地标进行收集,以生成可重现的精确数据。
有一些潜在的因素需要这些技术专业知识来应用这些工具。例如,首先,PPV不能只反映局部动脉壁的AAA发展程度,因为它是对区域动脉刚度的间接测量。其次,如果中壁损坏,则很难准确测量PPV。第三,在没有操作仪器的专业知识的情况下获得清晰的分辨率图像可能具有挑战性。在最新版本的超声成像系统中,其中减少了斑点噪声和伪影,同时保存并增强了小型动物研究的数据采集,解决了其中一些问题。
过去用于确定主动脉刚度的技术(多普勒、微血管造影、磁共振成像)的重点仅限于二维图像。从超声成像中计算出的PPV已经作为一种可靠和可重复的方法来确定主动脉刚度,似乎独立于动脉压力9,17。需要注意的是,使用最大直径作为标准指数的 AAA 的现行定义并不总是与临床观察可靠相关。例如,小动脉瘤可能破裂,而一些大动脉瘤往往保持稳定18,19,20。主动脉硬化是一种早期变化,产生主动脉壁应力,触发动脉瘤生长,并重塑10,并已与Mmp2和Mmp9在AAA10的小鼠模型强相关。因此,除了主塔的直径外,功能分析可能提供重要信息,以评估AAA的进展和稳定性。
利用这些协议,我们研究了一种强效药理学Notch抑制剂(2S-N-+(3,5-二氟化苯甲苯)乙酰®-L-丙烯-2-苯基甘氨酸1,1-二甲基乙酯酯的治疗潜力;DAPT)使用AAA1的安格II诱导小鼠模型,对预先建立的AAA的进展和稳定性。跨腹腔超声成像显示,在Apoe-/-小鼠对AngII的反应中,MILD、PWV的增减和变性株比第28天的对照组减少。在第28天至第56天(图5)之后,MILD没有进一步增加。然而,PPV逐渐增加,在第56天明显高于第28天。在DAPT抑制Notch信号作用下,MILD小鼠在第56天与安格II本身没有显著差异。有趣的是,DAPT阻止了PPV的进一步增加,使其明显低于第56天(图5C)。DAPT处理没有显著影响不失性或径向应变(图5D,E)。有趣的是,PPV在第28天(R2=0.51)与MILD相关强烈,而在第56天,相关性相对较弱(R2=0.22;图 5F.主动脉刚度的这些变化反映在胶原蛋白降解和蛋白解作用增加与AngII和衰减由DAPT(图5H)。本示例研究强调了基于超声波主动脉刚度测量在了解 AAA 进展和稳定性的时间过程和可预测性方面的潜在价值。
此外,基于超声波的方法在评估药理干预的潜在作用方面似乎很有价值,特别是在可能独立于光内直径变化的阶段(即超出实际预期)回归)。总之,对此类技术的详细理解和使用将有助于评估AAA在疾病早期阶段的预后,以便采取有效的治疗干预措施。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了R01HL124155(CPH)的支持,以及密苏里大学研究所对CPH的资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Angiotensin II | Sigma | A9525 | |
Apoe-/- mice | The Jackon lab | ||
Clippers | WAHL | 1854 | |
Cotton swab | Q-tips | ||
DAPT | Sigma | D5942 | |
Depilatory cream | Nair | LL9038 | |
Electrode cream | Sigma | 17-05 | |
Gel warmer | Thermasonic (Parker) | 82-03 (LED) | |
Heating pad | Stryker | T/pump professional | |
Isoflurane | VetOne | Fluriso TM | |
Isoflurane vaporizer | Visualsonics | VS4244 | |
Lubricating ophthalmic ointment | Lacri-lube | ||
Osmotic pumps | Alzet | Model 2004 | |
Oxygen tank | Air gas | ||
Tranducer | Visualsonics | MS-400 or MS550D | |
Ultrasonic gel | Parker | Aquasonic clear | |
Ultrasound Imaging System | Visualsonics | Vevo 2100 | |
Vevo Vasc Software | Visualsonics |
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