Summary
Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per l'utilizzo dell'imaging a ultrasuoni ad alta frequenza per misurare il diametro luminale, la velocità di propagazione degli impulsi, la distensibilità e la tensione radiale su un modello murino di aneurisma aortico addominale.
Abstract
Un aneurisma aortico addominale (AAA) è definito come una dilatazione localizzata dell'aorta addominale che supera il diametro intraluminale massimo (MILD) di 1,5 volte della sua dimensione originale. Studi clinici e sperimentali hanno dimostrato che piccoli aneurismi possono rompersi, mentre una sottopopolazione di grandi aneurismi può rimanere stabile. Così, oltre alla misurazione del diametro intraluminale dell'aorta, la conoscenza dei tratti strutturali della parete del vaso può fornire informazioni importanti per valutare la stabilità dell'AAA. L'irrigidimento aortico è recentemente emerso come uno strumento affidabile per determinare i primi cambiamenti nella parete vascolare. La velocità di propagazione dell'impulso (PPV) insieme alla distensibilità e al ceppo radiale sono metodi a base di ultrasuoni altamente utili rilevanti per valutare la rigidità aortica. Lo scopo principale di questo protocollo è quello di fornire una tecnica completa per l'uso del sistema di imaging a ultrasuoni per acquisire immagini e analizzare le proprietà strutturali e funzionali dell'aorta come determinato da MILD, PPV, distensibilità e deformazione radiale.
Introduction
Un aneurisma aortico addominale (AAA) rappresenta una significativa malattia cardiovascolare caratterizzata da una dilatazione localizzata permanente dell'aorta che supera il diametro originale del vaso di 1,5 volte1. AAA è tra le prime 13 cause di mortalità negli Stati Uniti2. La progressione dell'AAA è attribuita alla degenerazione della parete aortica e della frammentazione dell'elastina, portando infine alla rottura aortica. Questi cambiamenti nella parete aortica possono verificarsi senza un aumento significativo del diametro intraluminale massimo (MILD), suggerendo così che MILD da solo non è sufficiente per prevedere la gravità della malattia3. Pertanto, è necessario identificare ulteriori fattori per rilevare i cambiamenti iniziali nella parete aortica, che possono guidare le opzioni di trattamento precoce. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire una guida pratica per valutare le proprietà funzionali aortiche utilizzando l'imaging aultraora come caratterizzato da misurazioni della velocità di propagazione degli impulsi (PPV), distendibilità e deformazione radiale.
Un modello sperimentale ben caratterizzato per studiare AAA, descritto per la prima volta da Daugherty e colleghi, comporta infusione sottocutanea di angiotensina II (AngII) tramite pompe osmotiche in Apoe-/- topi4. La misurazione precisa di MILD mediante imaging a ultrasuoni è stata determinante nella caratterizzazione dell'AAA in questo modello murino5. Anche se i cambiamenti istologici durante lo sviluppo di AAA sono stati ampiamente studiati, i cambiamenti nelle proprietà funzionali della parete del vaso come la rigidità aortica non sono stati ben caratterizzati. Questo protocollo enfatizza l'uso degli ultrasuoni ad alta frequenza in combinazione con le sofisticate analisi come potenti strumenti per studiare la progressione temporale dell'AAA. In particolare, questi approcci ci permettono di valutare le proprietà funzionali della parete del vaso misurate da PPV, distensibilità e deformazione radiale.
Recenti studi clinici su soggetti umani con AAA, così come nel modello AAA indotta da murasi elastasi, suggeriscono una correlazione positiva tra rigidità aortica e diametro aortico6,7. PPV, un indicatore di rigidità aortica, è accettato come un'ottima misura per quantificare i cambiamenti di rigidità nella parete del vaso6,8. Il PPV viene calcolato misurando il tempo di transito della forma d'onda dell'impulso in due siti lungo la vascolatura, fornendo così una valutazione regionale della rigidità aortica. Recentemente abbiamo dimostrato che una maggiore rigidità aortica misurata dal PPV, e a livello cellulare come determinato utilizzando la microscopia a forza atomica, è positivamente correlata allo sviluppo dell'aneurisma9. Inoltre, la letteratura suggerisce che la rigidità aortica può precedere la dilatazione aneurismica e quindi può fornire informazioni utili sulle proprietà intrinseche regionali della parete del vaso durante lo sviluppo di AAA10. Allo stesso modo, le misure di distensibilità e deformazione sono gli strumenti di quantificazione per misurare i precedenti cambiamenti della forma fisica arteriosa. Le arterie sane sono flessibili ed elastiche, mentre con una maggiore rigidità e meno elasticità, la distensibilità e lo sforzo diminuiscono. Qui, forniamo una guida pratica e un protocollo passo dopo passo per l'uso di un sistema ad ultrasuoni ad alta frequenza per misurare MILD, PPV, distensibilità e deformazione radiale nei topi. Il protocollo fornisce approcci tecnici che dovrebbero essere utilizzati in combinazione con le informazioni di base fornite dai manuali per specifici strumenti di imaging ad ultrasuoni e il video tutorial di accompagnamento. È importante sottolineare che nelle nostre mani il protocollo di imaging descritto fornisce dati riproducibili e accurati che appaiono preziosi nello studio dello sviluppo e della progressione dell'AAA sperimentale.
Per dimostrare ulteriormente l'utilità dell'imaging a ultrasuoni, forniamo immagini di esempio e misurazioni prese dai nostri studi volti a utilizzare approcci farmacologici per prevenire l'AAA11sperimentale. In particolare, la segnalazione della tacca è stata proposta per essere coinvolta in molteplici aspetti dello sviluppo vascolare e dell'infiammazione12. Utilizzando aploinsufficienza genica e approcci farmacologici, abbiamo dimostrato in precedenza che l'inibizione di Notch riduce lo sviluppo di AAA nei topi prevenendo l'infiltrazione dei macrofagi nel sito della lesione vascolare13,14,15. Per l'articolo corrente, utilizzando l'approccio farmacologico per l'inibizione di Notch ci concentriamo sulla relazione tra rigidità aortica e fattori relativi all'AAA. Questi studi dimostrano che l'inibizione di Notch riduce la rigidità aortica, che è una misura della progressione AAA11.
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Protocol
Il protocollo per la manipolazione dei topi e l'imaging ad ultrasuoni è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università del Missouri (numero 8799) ed è stato condotto secondo AAALAC International.
1. Impostazione e preparazione dell'attrezzatura dei topi
- Configurazione dell'attrezzatura
- Accendere lo strumento ad ultrasuoni, il riscaldatore ad ultrasuoni e il pad di riscaldamento.
- Aprire il programma di ultrasuoni e inserire il nome dello studio e le informazioni descrittive per ogni mouse.
- Selezionare l'applicazione come Imaging generale.
- Scegliere il trasduttore appropriato per l'imaging addominale (Figura 1B,C). In questo esperimento viene utilizzato il trasduttore MS400.
- Assicurarsi che i livelli di anestesia isoflurane e ossigeno siano adeguati per ogni sessione sperimentale.
- Pulire la piattaforma di imaging degli animali ad ultrasuoni.
- Preparazione del mouse
- Posizionare la gabbia del topo sopra una piastra di riscaldamento (da 36,5 a 38,5 gradi centigradi).
- Tenere delicatamente il topo per la sua base di coda e posizionare nella camera di isoflurane riempita di ossigeno.
- Dirigere il flusso di isoflurane e ossigeno alla camera di induzione.
- Accendere il vaporizzatore isoflurano e impostare il livello di isoflurane a 1-2% vol/vol.
- Dopo 2 min, confermare l'adeguata profondità di anestesia per l'assenza di riflessi di ritiro dopo aver pizzicando il piede pad del mouse.
- Successivamente, spegnere il ramo di alimentazione camera di induzione e accendere il ramo diretto al cono naso anestesia.
- Trasferire il mouse dalla camera di induzione allo stadio di imaging ad ultrasuoni e posizionare il cono di anestesia sul naso dell'animale.
- Inclinare la piattaforma di imaging degli animali di circa 10 gradi nell'angolo in basso a destra per una scansione ottimale (Figura 1B).
- Mettere una goccia di soluzione oftalmica sterile in entrambi gli occhi dei topi per evitare l'essiccazione in anestesia.
- Posizionare il mouse in posizione supina con il naso inserito nel cono di anestesia.
- Applicare il gel elettrodo su tutte e quattro le zampe utilizzando un tampone di cotone e nastro adesivo le zampe ai cavi di rame sulla piattaforma di imaging animale per letture di elettrocardiogramma (Figura 1C).
- Utilizzare i clipper per radere i capelli nel sito di imaging e quindi applicare la crema depilatoria per rimuovere la pelliccia rimanente. Lasciare agire per meno di 1 min.
- Asciugare delicatamente la panna e i capelli con un tovagliolo di carta umido.
- Monitorare la respirazione e assicurarsi che la frequenza cardiaca sia mantenuta tra 450-550 battiti/min. Se al di sotto di questo livello, ridurre il flusso di isoflurane e attendere fino a quando la frequenza cardiaca recupera.
- Applicare il gel ultrasonico preriscaldato (37 gradi centigradi) al sito della pelle preparato e attaccare il trasduttore al suo supporto e abbassare fino a toccare il gel (Figura 1C).
2. Immagini ad ultrasuoni dell'aorta addominale
- Posizionare il trasduttore orizzontalmente (cioè perpendicolare alla linea mediana del mouse).
- Ammorbidire il gel ad ultrasuoni e rimuovere le bolle utilizzando il bastoncino di legno di un tampone di cotone.
- Abbassare il trasduttore e posizionare 0,5 - 1 cm sotto il diaframma dopo aver toccato il gel. Ora inizia a osservare le immagini.
- Visualizzare l'aorta addominale nella vista dell'asse corto (Figura 1C).
NOTA: La modalità B è la modalità predefinita ed efficace per individuare anatomicamente l'aorta e posizionare il trasduttore. L'aorta addominale è identificata dalla presenza di flusso pulsatile utilizzando colore Doppler e modalità Doppler di potenza nell'asse corto (cioè, la sezione circumferenziale dell'aorta). Regolare i micromanipolatori sullo stadio animale e il trasduttore per portare la sezione trasversale dell'aorta al centro dell'immagine. - Ruotare delicatamente il trasduttore di 90 gradi in senso orario e regolare lentamente la manopola del micromanipolatore dell'asse x per visualizzare l'aorta in vista dell'asse lungo (sezione longitudinale dell'aorta).
NOTA: In molti casi, i gas gastro-intestinali possono interferire con l'immagine o l'aorta potrebbe non essere all'angolo ottimale per consentire una chiara vista dell'asse lungo. Regolare l'angolo del trasduttore lentamente e orizzontalmente fino a ottenere una vista accettabile dell'asse lungo. Se i problemi persistono, elevare il trasduttore, verificare la presenza di bolle d'aria sotto il trasduttore, regolare leggermente l'angolo di inclinazione dello stadio animale, riapplicare i gel e ripetere tutti i passaggi. - Impostare la zona di messa a fuoco e la profondità nell'area dell'aorta utilizzando rispettivamente l'opzione Area di messa a fuoco e Profondità messa a fuoco. Regolare manualmente il cursore di compensazione guadagno di tempo per scurire il lume dell'aorta per ottenere un contrasto ottimale della parete dell'aorta.
- Regolare il manipolatore dell'asse y per visualizzare i punti di ramificazione del mesenterico superiore e le arterie renali giuste. Utilizzare l'arteria renale giusta come punto di riferimento per catturare l'immagine dell'aorta suprarenale (Figura 2A).
- Registra almeno 100 fotogrammi di immagini in modalità B sull'aorta suprarenale.
- Premere cinestore per salvare le immagini in modalità B.
- Premere il tasto M-mode sulla tastiera dello strumento per abilitare la registrazione in modalità M. Rotolare la sfera cursore per portare la linea dell'indicatore giallo a una normale sezione aorta con immagine chiara della parete del vaso, o nelle sezioni in cui si osserva il diametro massimo dell'aneurisma.
- Premere l'interruttore SV/gate e regolare la sfera del cursore per assicurarsi che le pareti della nave siano incluse nella staffa di misurazione. Premere update per registrare le misure in modalità M e premere cinestore per acquisire (Figura 2A,B).
NOTA: il diametro massimo dell'aneurisma potrebbe non trovarsi nello stesso piano di imaging della vista ottimale dell'asse lungo dell'aorta. Regolare leggermente la manopola del manipolatore dell'asse x per ogni misurazione in modalità M per assicurarsi che il MILD di ogni sezione venga catturato. - Per ottenere immagini ECG-gated Kilohertz Visualization (EKV), premere il pulsante B-mode per tornare alla registrazione in modalità B.
NOTA: se le immagini non sono nitide, regolare il manipolatore dell'asse x per ottenere l'immagine più nitida della parete superiore del lume su una lunghezza di sezione (ad esempio, > 6 mm). - Premere il pulsante Physio Settings sulla tastiera e selezionare Respiration Gating. Regolare manualmente il ritardo di gating e la finestra per registrare i dati solo durante le parti più piatte dell'onda respiratoria. Le sezioni di registrazione saranno mostrate come blocchi colorati sul tracciamento dell'onda respiratoria.
NOTA: Senza la regolazione della respirazione gating, le immagini EKV saranno sfocate a causa del normale movimento dell'animale durante la respirazione. - Premere il pulsante EKV per attivare la modalità EKV. Nel menu appropriato, selezionate Risoluzione standard e frequenza fotogrammi 3000 o superiore. Selezionare Procedi per registrare le immagini EKV. Premere cinestore per salvare le immagini. Utilizzare l'immagine in modalità EKV per ottenere misurazioni della velocità di propagazione dell'impulso (PPV), della distensibilità e della deformazione radiale.
NOTA: la registrazione EKV potrebbe non riuscire se ci sono fluttuazioni anomale nella respirazione, gli animali stanno rispiondo troppo rapidamente o le impostazioni della frequenza fotogrammi sono troppo alte. In questi casi, impostare la frequenza fotogrammi più bassa e attendere che la respirazione animale si stabilizzi. L'impostazione della frequenza fotogrammi a 3000 è di solito appropriata sia per i topi che per i ratti.
3. Passaggi post-imaging
- Pulire delicatamente il gel ultrasonico dalla zona addominale del mouse con un asciugamano di carta inumidito con acqua tiepida.
- Posizionare nuovamente il mouse nella sua gabbia di casa su una piastra di riscaldamento.
- Spegnere la macchina isoflurane, pulire la piattaforma di imaging animale e trasduttore con salviette umide.
- Trasferire i dati dell'immagine raccolti durante la scansione a ultrasuoni sul disco rigido.
- Spegnere lo strumento ad ultrasuoni.
- Dopo che il mouse si riprende dall'anestesia ed è vigile, rimuovere il pad di riscaldamento e riportare la gabbia al rack di alloggiamento degli animali.
4. Analisi delle immagini aortiche addominali
- Analisi delle immagini in modalità M per misurare MILD
- Aprire il programma di ultrasuoni e inserire il nome dello studio e le informazioni descrittive per ogni mouse.
- Aprire i dati a ultrasuoni nel software di analisi e aprire l'immagine in modalità M e mettere in pausa il battito cardiaco.
- Fare clic su Misure.
- Selezionare il pacchetto vascolare dalle opzioni a discesa. Fare clic su Profondità e tracciare una linea attraverso il lume aortico che si estende da parete interna a parete (Figura 2C,D).
NOTA: Per coerenza, le misurazioni devono essere effettuate nella fase sistolica del ciclo cardiaco quando l'aorta viene ampliata al massimo. Disegna tre linee su tre diversi battiti cardiaci per ottenere misurazioni accurate e medie di MILD. In AAA, le misurazioni vengono effettuate al massimo dilatazione dell'aorta. Si consiglia inoltre di accelerare gli animali 4-6 h prima di raccogliere le immagini per evitare interferenze dalla motilità intestinale e garantire la chiarezza dell'immagine.
- Analisi della velocità di propagazione degli impulsi (PPV)
- Aprire l'immagine EKV e mettere in pausa l'heartbeat.
- Aprire una nuova finestra sul software di analisi (ad esempio, Vevo Vac) facendo clic sull'icona del nome.
- Fare clic sull'opzione PPV (freccia in Figura 3D). Apparirà inoltre una piccola finestra con l'immagine dell'aorta.
- Disegnare un riquadro rettangolare facendo clic sulla parete superiore del recipiente e trascinando il puntatore per circa 4 mm coprendo entrambe le pareti dell'aorta suprarenal.
NOTA: mantenere costante la lunghezza della scatola (4 mm) per tutte le immagini. L'utente può regolare il riquadro rettangolare ruotando per allineare la scatola e selezionando la linea e trascinando in una nuova posizione sul vaso analizzato per ottenere l'inflessione più appropriata e chiara dell'onda di impulso. Le linee verticali di dati del rettangolo verranno visualizzate e identificate come Sinistra (immagine in alto) e Destra (immagine in basso) sul ROI. Per una migliore visualizzazione dell'inflessione dell'onda d'impulso, a volte è utile per la casella di disegno solo sulla parete superiore, come illustrato nella Figura 3. Il software calcolerà automaticamente il PPV (m/s). Tuttavia, è sempre meglio regolare manualmente le linee viola per impostare il punto di inflessione esatto sulle onde d'impulso e PPV cambierà di conseguenza. - Infine, selezionare il comando Accetta per salvare i valori PPV. Esportare le cifre e i dati nell'unità di archiviazione dati.
- Analisi per la distensibilità e la deformazione radiale
- Aprire l'immagine EKV e mettere in pausa l'heartbeat.
- Fare clic sull'icona del software. Il software aprirà una nuova finestra.
- Fare clic sulla traccia nuovo ROI e disegnare un riquadro rettangolare sulle entrambe le pareti della nave. Il software traccia automaticamente le pareti superiore e inferiore della nave. L'utente può regolare la traccia per allinearla al muro facendo clic sui punti verdi (Figura 4A,B).
- Ora accetta la traccia. Il software calcolerà la distensibilità (1/Mpa) nel ROI selezionato.
- Per la misurazione della deformazione radiale, selezionare l'opzione di deformazione appropriata dalle barre dei menu in alto a sinistra. Si apriranno le immagini per la deformazione radiale e la deformazione tangenziale.
- Ottenere il valore per la deformazione radiale (%) spostando il cursore sul picco della curva. Esportare i dati come immagini o in formato video (Figura 4A,B).
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Representative Results
Le immagini rappresentative in modalità M dell'aorta addominale normale e aneurisma dei topi sono mostrate rispettivamente nella Figura 2A e nella Figura 2B. L'aorta addominale suprarenale è identificata dalla sua posizione accanto all'arteria renale destra e dall'arteria mesenterica superiore (Figura 2A). Le immagini rappresentative utilizzate per il calcolo del MILD, a tre diversi battiti cardiaci del ciclo cardiaco sistolico, nell'aorta normale e aneurisma sono mostrate rispettivamente nella Figura 2C,D. Nella situazione in cui si è sviluppato un aneurisma aortico, il diametro luminale è determinato disegnando una linea gialla perpendicolare tra i due bordi interni del lume nell'area di dilatazione massima (Figura 2B). In genere vengono medrate tre misurazioni indipendenti per determinare un diametro intraluminale accurato.
Le immagini EKV rappresentative dell'aorta addominale utilizzate nell'analisi del PPV sono mostrate nella Figura 3. PPV viene calcolato disegnando un riquadro rettangolare sulla parete luminale di aorta suprarenal (Figura 3E) e la regolazione delle linee verticali viola dei dati ottenuti dalla casella rettangolare (Figura 3F). Le linee viola devono essere regolate per impostare il punto di inflessione delle onde d'impulso. Le immagini EKV rappresentative dell'aorta addominale adatta per l'analisi della distensibilità e dei ceppi radiali sono mostrate nella Figura 4. La distensibilità e la deformazione radiale vengono calcolate tracciando le pareti luminali dell'aorta suprarenal, come illustrato nella figura 4E. Il valore per la distensibilità (1/MPa) si ottiene scegliendo l'opzione di distensibilità/elasticità dal menu a discesa della casella (freccia rossa, Figura 4F). La deformazione radiale (%) è ottenuto scegliendo l'opzione di deformazione radiale (Figura 4G) e spostando il cursore sul picco del grafico di deformazione radiale (Figura 4H).
Abbiamo convalidato il significato del PPV nel modello murino indotto dall'AAA e abbiamo esaminato ulteriormente il potenziale terapeutico di un inibitore di Notch (N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-(S)-fenilglycine t-butyl ester; DAPT) sulla progressione e la stabilità dell'AAA prestabilita. In particolare, tutti questi studi di aneurisma sono stati eseguiti su 8-10 settimane apoe-/- topi maschi dopo l'infusione di AngII dai protocolli pubblicati4,13. Al giorno 28 di infusione AngII, i topi sono stati suddivisi casualmente in due gruppi e sono stati somministrati veicolo o DAPT (10 mg/kg) fino al sacrificio al giorno 5613. L'imaging ecografico transabdominale ha mostrato un aumento progressivo del MILD, PPV, e una diminuzione della distensiabilità e della deformazione radiale in risposta ad AngII al giorno 28(Figura 5A-E). L'infusione di angII ha aumentato marginalmente MILD dal giorno 28 al giorno 56 e DAPT non ha cambiato in modo significativo MILD rispetto al solo AngII(Figura 5A e Figura 5B). Tuttavia, PPV è aumentato progressivamente con l'infusione di AngII dal giorno 28 al giorno 56 e DAPT significativamente diminuito ulteriori aumenti di PPV al giorno 56 (Figura 5C). Distensibilità e ceppi radiali, i parametri per valutare l'elasticità della parete del vaso sono stati diminuiti con l'infusione di AngII, mentre DAPT non ha mostrato alcun effetto significativo (Figura 5D e 5E). È importante sottolineare che il PWV era fortemente correlato con MILD al giorno28(R 2 -0,51, figura 5F), mentre al giorno 56, la correlazione era relativamente debole (R2x 0,22) (Figura 5G). La rigidità aortica in AAA è principalmente associata ai cambiamenti nell'architettura aortica delle pareti. Istologicamente, l'infusione di AngII ha aumentato la degradazione del collagene e l'attività proteolitica nello strato mediale dell'aorta (Figura 5H, riga superiore). Il trattamento DAPT ha ridotto al minimo tali cambiamenti nella degradazione dell'ECM (Figura 5H, riga inferiore).
Figura 1: Configurazione dello strumento. (A) Vista generale della macchina ad ultrasuoni insieme alla camera di induzione per anestesia e gel warmer. (B) Vista ravvicinata della piattaforma di imaging e del sistema di trasduttore. (C) La vista del posizionamento del trasduttore durante l'acquisizione di breve immagine dell'asse dell'aorta addominale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi delle immagini in modalità M per ottenere il massimo diametro intraluminale (MILD). Vengono mostrate le immagini in modalità M di aorta normale (A) e aorta con aneurisma aortico addominale (B) dei topi. (C) e (D), MILD disegnati alla fase sistolica del ciclo cardiaco nell'aorta suprarenale di topi normali (C) e topi con AAA (D). Le misurazioni a tre diversi battiti cardiaci vengono eseguite come illustrato e viene calcolato il valore medio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi delle immagini EKV per ottenere la velocità di propagazione dell'impulso (PPV). Immagini EKV raccolte dalla normale aorta del mouse. L'analisi viene eseguita facendo clic sulle misure (A) e sull'icona del software (B). Apparirà una nuova finestra con le icone sul lato destro, come mostrato in C. Ora, fare clic su PPV (D) e di nuovo, apparirà una piccola finestra (E). Disegnare un riquadro rettangolare sulla parete superiore del lume come mostrato in E e fare clic su Accetta. Il valore PPV sarà ottenuto come mostrato in F (freccia). Le linee viola vengono regolate per impostare il punto di flesso delle onde d'impulso (G). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Misurazione della distendibilità e della deformazione radiale. Immagini EKV raccolte dalla normale aorta del mouse. L'analisi viene eseguita facendo clic sulle misure (A) e sull'icona del software (B). Apparirà una nuova finestra con le icone sul lato destro, come mostrato in C. Ora, fare clic su traccia nuovo ROI (D), apparirà una nuova finestra con tracce sulla parete superiore e inferiore del lume come mostrato in E e fare clic su accetta. Il valore per la distensibilità sarà ottenuto nella tabella come mostrato nella f. Per la deformazione, fare clic sul ceppo (G). La finestra mostrerà il valore di deformazione radiale (%, casella evidenziata in verde), poiché il cursore è posizionato sul picco del grafico di deformazione radiale (H). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: PPV è correlato ai tratti strutturali dell'aorta nella aAA stabilita. (A) Immagini ecografiche transabdominali rappresentative che mostrano il MILD al giorno 0, 28, 42 e 56 dei gruppi sperimentali indicati nei topi Apoe-/- . DAPT è stato iniziato il giorno 28. Linee gialle punteggiate delineano il lume. (B) Quantificazione del MILD nei gruppi indicati (il colore viola e verde mostra rispettivamente AngII , veicolo e AngII , mouse trattati DAPT (n. 16-18). (C, D ed E) PPV, dissitenbilità e deformazione radiale in vari giorni di trattamenti AngII e DAPT (n. 8). (F e G), Grafici che mostrano la correlazione di Pearson tra PPV e MILD al giorno 28 (F) e giorno 56 (G). (H) Rappresentazione di immagini istologiche per la colorazione del collagene (macchiata di tricromo e vista come colorazione blu) e attività proteolitica da zimography in situ con o senza DAPT al giorno 56. È stato utilizzato il test di confronto multiplo Per l'analisi dei dati. P<0,05; ns - non significativo. Scala 50 m in H. Questa cifra è adattata da Sharma et al. (2019), Scientifc Reports (SREP-19-16491B)11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'imaging ad ultrasuoni fornisce una potente tecnica per determinare le proprietà funzionali dell'aorta attraverso misurazioni di PPV, distensibilità e deformazione radiale. Queste misurazioni sono particolarmente istruttive per lo studio dei modelli murini di AAA e l'approccio in vivo consente la raccolta di dati longitudinali potenzialmente importanti per comprendere lo sviluppo temporale della patologia aortica. In particolare, le misurazioni della rigidità aortica in vivo sono determinate localmente nell'aorta addominale da PPV, distensibilità e deformazione radiale analizzando i dati EKV e sono considerate come un fattore di rischio indipendente per l'instabilità AAA16. Le tecniche descritte in questi protocolli sono relativamente semplici e richiedono solo 8-10 min per ottenere set di immagini da un solo mouse. Tutte le immagini dovrebbero preferibilmente essere raccolte da un singolo operatore utilizzando punti di riferimento ben definiti e coerenti per generare dati riproducibili e precisi.
Ci sono potenziali fattori che richiedono competenze tecniche per le applicazioni di questi strumenti. Ad esempio, in primo luogo, ppV non può riflettere solo il grado di sviluppo di AAA nella parete arteriosa locale perché è una misura indiretta della rigidità arteriosa regionale. In secondo luogo, può essere difficile misurare con precisione PPV se la parete intima è danneggiata. In terzo luogo, può essere difficile ottenere immagini a risoluzione nitida senza esperienza nel funzionamento dello strumento. Alcune di queste preoccupazioni sono state affrontate nelle versioni recenti dei sistemi di imaging ad ultrasuoni in cui il rumore delle macchie e gli artefatti sono ridotti, preservando e migliorando l'acquisizione dei dati per piccoli studi sugli animali.
Il focus delle tecniche utilizzate in passato (Doppler, microangiografia, risonanza magnetica) per determinare la rigidità aortica era limitato a immagini bidimensionali. PPV calcolato dall'imaging ad ultrasuoni sta emergendo come un metodo affidabile e riproducibile per determinare la rigidità aortica e sembra essere indipendente dalla pressione arteriosa9,17. È importante notare che la definizione prevalente di AAA utilizzando il diametro massimo come indice standard non sempre correla in modo affidabile con le osservazioni cliniche. Per esempio, piccoli aneurismi possono rompersi mentre alcuni grandi aneurismi tendono a rimanere stabili18,19,20. L'irrigidimento aortico è un cambiamento precoce che genera stress aortico della parete che innesca la crescita aneurismatica, e rimodellando10 ed è stato fortemente correlato con Mmp2 e Mmp9 nei modelli murini di AAA10. Pertanto, oltre al diametro dell'aorta, le analisi funzionali possono fornire importanti informazioni per valutare la progressione e la stabilità dell'AAA.
Utilizzando questi protocolli, abbiamo esaminato il potenziale terapeutico di un potente inibitore farmacologico di Notch (2S-N-[(3,5-Difluorophenyl) acetil]-L-alanyl-2-phenilglicine 1,1-dimethylethyl ester; DAPT) sulla progressione e la stabilità dell'AAA prestabilita utilizzando un modello murino indotto da AngII di AAA11. L'imaging ecografico transabdominale ha mostrato un aumento progressivo del MILD, del PWV e una diminuzione della distensiabilità e della deformazione radiale nei topi Apoe-/- in risposta all'AngII rispetto ai controlli del giorno 28. Nessun ulteriore aumento di MILD è stato osservato oltre il giorno 28 fino al giorno 56 (Figura 5). Tuttavia, PPV è aumentato progressivamente ed è stato significativamente più alto al giorno 56 rispetto al giorno 28. Con l'inibizione della segnalazione di Notch da parte di DAPT, i topi MILD non erano significativamente diversi da AngII da soli al giorno 56. È interessante notare che DAPT ha impedito un ulteriore aumento del PPV in modo che fosse significativamente inferiore a AngII al giorno 56 (Figura 5C). Il trattamento DAPT non ha influito in modo significativo sulla distensibilità o sulla deformazione radiale(Figura 5D,E). È interessante notare che il PPV è fortemente correlato con MILD al giorno28(R 2 x 0,51), mentre al giorno 56 la correlazione era relativamente debole (R20,22; Figura 5F). Questi cambiamenti nella rigidità aortica si sono riflessi nell'aumento della degradazione del collagene e dell'attività proteolitica con AngII e nell'attenuazione da DAPT (Figura 5H). Questo studio di esempio evidenzia il valore potenziale delle misurazioni della rigidità aortica basata sugli ultrasuoni per comprendere il percorso temporale e la prevedibilità sia della progressione e della stabilità dell'AAA.
Inoltre, l'approccio basato sugli ultrasuoni appare prezioso nella valutazione del potenziale ruolo degli interventi farmacologici, in particolare nelle fasi che potrebbero essere indipendenti dai cambiamenti del diametro intraluminale (cioè, al di là delle aspettative di effetti regressione). In sintesi, la comprensione dettagliata e l'uso di tale tecnologia beneficeranno nella valutazione della prognosi dell'AAA in una fase iniziale della malattia per interventi terapeutici efficaci.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da R01HL124155 (CPH) e finanziamenti dal Research Institute presso l'Università del Missouri alla CPH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II | Sigma | A9525 | |
| Apoe-/- mice | The Jackon lab |  |
|
| Clippers | WAHL | 1854 | |
| Cotton swab | Q-tips | ||
| DAPT | Sigma | D5942 | |
| Depilatory cream | Nair | LL9038 | |
| Electrode cream | Sigma | 17-05 | |
| Gel warmer | Thermasonic (Parker) | 82-03 (LED) | |
| Heating pad | Stryker | T/pump professional | |
| Isoflurane | VetOne | Fluriso TM | |
| Isoflurane vaporizer | Visualsonics | VS4244 | |
| Lubricating ophthalmic ointment | Lacri-lube | ||
| Osmotic pumps | Alzet | Model 2004 | |
| Oxygen tank | Air gas | ||
| Tranducer | Visualsonics | MS-400 or MS550D | |
| Ultrasonic gel | Parker | Aquasonic clear | |
| Ultrasound Imaging System | Visualsonics | Vevo 2100 | |
| Vevo Vasc Software | Visualsonics |
References
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