Summary
تصف هذه المخطوطة بروتوكولًا مفصلًا لاستخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية عالي التردد لقياس القطر اللموي وسرعة انتشار النبض ووضوح القابلية والضغط الشعاعي على نموذج الماوس من تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني.
Abstract
يُعرَّف تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني (AAA) بأنه تمدد موضعي للأبهر البطني يتجاوز القطر اللاالفيللي الأقصى (MILD) بمقدار 1.5 مرة من حجمه الأصلي. وقد أظهرت الدراسات السريرية والتجريبية أن تمدد الأوعية الدموية الصغيرة قد تمزق, في حين أن السكان الفرعية من تمدد الأوعية الدموية الكبيرة قد تبقى مستقرة. وهكذا، بالإضافة إلى قياس قطر الأورمنالمنتال من الأورطان، معرفة الصفات الهيكلية للجدار السفينة قد توفر معلومات هامة لتقييم استقرار AAA. وقد برز مؤخرا تصلب الأبهر كأداة موثوق بها لتحديد التغيرات المبكرة في جدار الأوعية الدموية. سرعة انتشار النبض (PPV) جنبا إلى جنب مع عدم القابلية وسلالة شعاعي هي طرق مفيدة للغاية الموجات فوق الصوتية القائمة على ذات الصلة لتقييم تصلب الأبهر. الغرض الأساسي من هذا البروتوكول هو توفير تقنية شاملة لاستخدام نظام التصوير بالموجات فوق الصوتية للحصول على الصور وتحليل الخصائص الهيكلية والوظيفية للأورطام على النحو الذي يحدده MILD ، PPV ، عدم القابلية للإجهاد والإجهاد الشعاعي.
Introduction
يمثل تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني (AAA) مرضًا كبيرًا في القلب والأوعية الدموية يتميز بتمدد موضعي دائم للأبهر يتجاوز قطر الوعاء الأصلي بمقدار 1.5 مرة1. AAA تحتل المرتبة بين أعلى 13 أسباب الوفيات في الولايات المتحدة2. ويعزى تطور AAA إلى انحطاط الجدار الأبهري وتجزئة الإيلاستين، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى تمزق الأبهر. قد تحدث هذه التغييرات في الجدار الأبهري دون زيادة كبيرة في القطر اللامنشهر الحدالأقصى (معتدل)، مما يشير إلى أن خفيفة وحدها ليست كافية للتنبؤ شدة المرض3. لذلك ، يجب تحديد عوامل إضافية للكشف عن التغيرات الأولية في الجدار الأبهري ، والتي قد توجه خيارات العلاج المبكر. الهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير دليل عملي لتقييم الخصائص الوظيفية الأبهرية باستخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية كما تتميز قياسات سرعة انتشار النبض (PPV) ، وعدم القابلية للإجهاد والسلالة الشعاعية.
نموذج تجريبي يتميز بشكل جيد لدراسة AAA ، الذي وصفه لأول مرة Daugherty وزملاؤه ، ينطوي على ضخ تحت الجلد من الأنجيوتنسين الثاني (AngII) عبر مضخات تناوليكية في Apoe-/- الفئران4. وكان القياس الدقيق للخفيفة باستخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية مفيدة في توصيف AAA في هذا النموذج الماوس5. على الرغم من أن التغيرات النسيجية أثناء تطوير AAA قد درست على نطاق واسع، والتغيرات في الخصائص الوظيفية للجدار السفينة مثل تصلب الأبهر لم يتم توصيفها بشكل جيد. يؤكد هذا البروتوكول على استخدام الموجات فوق الصوتية عالية التردد في تركيبة مع التحليلات المتطورة كأدوات قوية لدراسة التقدم الزمني لـ AAA. على وجه التحديد، هذه النهج تسمح لنا لتقييم الخصائص الوظيفية للجدار السفينة كما تقاس PPV، عدم قابلية التحمل وسلالة شعاعي.
الدراسات السريرية الحديثة في البشر مع AAA, وكذلك في نموذج AAA اليورين الناجم عن الإيلاسا, تشير إلى وجود علاقة إيجابية بين تصلب الأبهر والأبهر يقطر6,7. PPV، وهو مؤشر على صلابة الأبهر، يتم قبوله كقياس ممتاز لقياس التغيرات في تصلب في جدار السفينة6،8. يتم حساب PPV عن طريق قياس وقت عبور شكل الموجة النبضية في موقعين على طول الأوعية الدموية ، وبالتالي توفير تقييم إقليمي للتصلب الأبهري. لقد أثبتنا مؤخرا أن زيادة صلابة الأبهر كما تقاس PPV، وعلى المستوى الخلوي على النحو المحدد باستخدام المجهر القوة الذرية، ويرتبط بشكل إيجابي مع تطوير تمدد الأوعية الدموية9. علاوة على ذلك ، تشير الأدبيات إلى أن تصلب الأبهر قد يسبق تمدد الأوعية الدموية ، وبالتالي قد يوفر معلومات مفيدة حول الخصائص الجوهرية الإقليمية لجدار السفينة أثناء تطوير AAA10. وبالمثل، فإن قياسات عدم القابلية للإجهاد والسلالة هي أدوات القياس الكمي لقياس التغيرات السابقة في اللياقة الشريانية. الشرايين الصحية مرنة ومرنة ، في حين أنه مع زيادة صلابة ومرونة أقل ، يتم تقليل عدم القابلية للإجهاد والإجهاد. هنا ، نقدم دليلًا عمليًا وبروتوكولًا تدريجيًا لاستخدام نظام الموجات فوق الصوتية عالي التردد لقياس MILD و PPV وعدم القابلية للإجهاد والإجهاد الشعاعي في الفئران. ويوفر البروتوكول النُهج التقنية التي ينبغي استخدامها بالاقتران مع المعلومات الأساسية التي توفرها الأدلة الخاصة بأدوات التصوير بالموجات فوق الصوتية المحددة والبرنامج التعليمي المصاحب للفيديو. الأهم من ذلك ، في أيدينا بروتوكول التصوير الموصوف يوفر بيانات قابلة للاستنساخ ودقيقة التي تبدو قيمة في دراسة تطور وتطور AAA التجريبية.
لمزيد من إظهار فائدة التصوير بالموجات فوق الصوتية ، نقدم مثالًا على الصور والقياسات المأخوذة من دراساتنا الخاصة التي تهدف إلى استخدام النهج الدوائية لمنع AAAالتجريبية 11. على وجه التحديد ، وقد اقترح إشارة الشق للمشاركة في جوانب متعددة من تطور الأوعية الدموية والتهاب12. باستخدام الجين haploinly ونهج الدوائية، وقد أثبتنا سابقا أن تثبيط نوتش يقلل من تطور AAA في الفئران عن طريق منع تسلل الضامة في موقع إصابة الأوعية الدموية13،14،15. للمادة الحالية، وذلك باستخدام النهج الدوائي ة لتثبيط نوتش نركز على العلاقة بين تصلب الأبهر والعوامل المتعلقة AAA. توضح هذه الدراسات أن تثبيط نوتش يقلل من تصلب الأبهر ، وهو مقياس للتقدم AAA11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على بروتوكول التعامل مع الفئران والتصوير بالموجات فوق الصوتية من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية في جامعة ميسوري واستخدامها (البروتوكول الحيواني رقم 8799) وأجريت وفقًا لـ AALac International.
1. إعداد المعدات وإعداد الفئران
- إعداد المعدات
- بدوره على أداة الموجات فوق الصوتية، هلام الموجات فوق الصوتية أكثر دفئا ووسادة التدفئة.
- افتح برنامج الموجات فوق الصوتية وأدخل اسم الدراسة والمعلومات الوصفية لكل فأر.
- حدد التطبيق كتصوير عام.
- اختيار محول المناسبة لتصوير البطن(الشكل 1B، C). في هذه التجربة، يتم استخدام محول MS400.
- تأكد من أن الإيولوفلوران التخدير ومستويات الأكسجين كافية لكل جلسة تجريبية.
- تنظيف منصة التصوير الحيواني بالموجات فوق الصوتية.
- إعداد الماوس
- ضع قفص الماوس فوق وسادة التدفئة (36.5 إلى 38.5 درجة مئوية).
- عقد بلطف الماوس من قاعدة الذيل ووضع في غرفة isoflurane مليئة بالأكسجين.
- توجيه isoflurane وتدفق الأكسجين إلى غرفة التعريفي.
- بدوره على المبخر isoflurane وتعيين مستوى الإيفولران إلى 1-2٪ فول / فول. بدوره على ضغط خزان الأكسجين إلى 1-2 لتر / دقيقة.
- بعد ~ 2 دقيقة، تأكد من عمق كاف من التخدير من خلال عدم وجود ردود الفعل الانسحاب على قرص وسادة القدم من الماوس.
- بعد ذلك، قم بإيقاف تشغيل فرع إمداد غرفة التعريف وشغّل الفرع الموجه إلى مخروط الأنف التخديري.
- نقل الفأر من غرفة التعريفي إلى مرحلة التصوير بالموجات فوق الصوتية ووضع مخروط التخدير على أنف الحيوان.
- إمالة منصة التصوير الحيواني حول 10 درجة إلى الزاوية اليمنى السفلى للمسح الأمثل(الشكل 1B).
- وضع قطرة واحدة من محلول العيون المعقم في كلتا العينين من الفئران لمنع التجفيف تحت التخدير.
- وضع الماوس في موقف supine مع أنفه إدراجها في مخروط التخدير.
- تطبيق جل القطب على جميع الكفوف الأربعة باستخدام مسحة القطن والشريط الكفوف إلى يؤدي النحاس على منصة التصوير الحيواني لقراءات تخطيط القلب(الشكل 1C).
- استخدام المقصات لحلاقة الشعر في موقع التصوير ومن ثم تطبيق كريم إزالة الشعر لإزالة الفراء المتبقية. يترك لمدة أقل من 1 دقيقة.
- مسح بلطف قبالة كريم والشعر مع منشفة ورقية رطبة.
- مراقبة التنفس وضمان الحفاظ على معدل ضربات القلب بين 450-550 نبضة / دقيقة. إذا كان أقل من هذا المستوى، والحد من تدفق الإيلوفلوران والانتظار حتى يتعافى معدل ضربات القلب.
- تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية المُدفئة (37 درجة مئوية) على موقع البشرة المعدة وإرفاق محول إلى حاملها وأسفل إلى أسفل حتى يلامس الجل(الشكل 1C).
2. التصوير بالموجات فوق الصوتية للأورطا البطني
- ضع المحول أفقيًا (أي عمودي على خط الوسط للفأرة).
- على نحو سلس هلام الموجات فوق الصوتية وإزالة فقاعات باستخدام عصا الخشب من مسحة القطن.
- خفض محول ووضع 0.5 - 1 سم تحت الحجاب الحاجز بعد لمس الجل. الآن البدء في مراقبة الصور.
- تصور الأورطا البطني في عرض المحور القصير(الشكل 1C).
ملاحظة: B-mode هو الوضع الافتراضي والأكثر فعالية لتحديد موقع الأورطا تشريحياً ووضع المحول. يتم تحديد الأبهر البطني من خلال وجود تدفق النابض باستخدام اللون دوبلر والسلطة دوبلر وسائط في المحور القصير (أي، المقطع العرضي محيطي من الأبهر). ضبط micromanipulators على مرحلة الحيوان ومحول لجلب المقطع العرضي من الأبهر إلى وسط الصورة. - تدوير بلطف محول 90 درجة في اتجاه عقارب الساعة، وضبط ببطء مقبض micromanipulator محور س لتصور الأبهر في عرض محور طويل (المقطع الطولي من الأبهر).
ملاحظة: في كثير من الحالات، قد تتداخل الغازات المعدية المعوية مع الصورة، أو قد لا يكون الأورطان في الزاوية المثلى للسماح بعرض محور طويل واضح. ضبط زاوية المحول ببطء وأفقيا حتى يتم الحصول على عرض محور طويل مقبول. إذا استمرت المشاكل، ورفع محول، والتحقق من فقاعات الهواء تحت محول، وضبط طفيف زاوية إمالة من مرحلة الحيوان، وإعادة تطبيق المواد الهلامية، وتكرار جميع الخطوات مرة أخرى. - تعيين منطقة التركيز والعمق في منطقة الأورطان باستخدام منطقة التركيز وتبديل عمق التركيز، على التوالي. ضبط المنزلق تعويض كسب الوقت يدويا ً لتعتيم تجويف الأورطان لتحقيق التباين الأمثل من جدار الأورتا.
- ضبط المتلاعب ص محور لتصور النقاط المتفرعة من الارسالية متفوقة والشرايين الكلوية اليمنى. استخدام الشريان الكلوي الأيمن كمعلم لالتقاط صورة من الشريان الأورطا فوق الكلى(الشكل 2A).
- سجل ما لا يقل عن 100 إطار من الصور B-mode على الشريان الأورطا فوق الكلى.
- اضغط cinestore لحفظ الصور B-الوضع.
- اضغط على زر وضع M على لوحة مفاتيح الجهاز لتمكين تسجيل وضع M. لفة الكرة المؤشر لتحقيق خط المؤشر الأصفر إلى أقسام الأبهر العادي مع صورة واضحة جدار السفينة، أو إلى المقاطع حيث لوحظ القطر الأقصى من تمدد الأوعية الدموية.
- اضغط على تبديل SV/gate وضبط كرة المؤشر لضمان تضمين جدران السفينة في قوس القياس. اضغط على التحديث لتسجيل قياسات وضع M واضغط cinestore لالتقاط(الشكل 2A, B).
ملاحظة: قد لا يكون القطر الأقصى لتمدد الأوعية الدموية في نفس مستوى التصوير كعرض المحور الطويل الأمثل للأورطام. ضبط مقبض المتلاعب x محور قليلاً لكل قياس M-وضع لضمان أن يتم التقاط خفيفة من كل قسم. - للحصول على صور تصور كيلوهيرتز (EKV) ببوابة ECG، اضغط على زر وضع B للعودة إلى تسجيل وضع B.
ملاحظة: إذا لم تكن الصور حادة، قم بضبط مناور المحور x لتحقيق الصورة الأكثر حدة للجدار العلوي للتجويف على طول مقطع (أي أكثر من 6 مم). - اضغط على زر إعدادات Physio على لوحة المفاتيح وحدد التنفس جاتينغ. ضبط تأخير ونافذة الجاتينغ يدويا لتسجيل البيانات فقط خلال أجزاء تملق من موجة التنفس. سيتم عرض أقسام التسجيل ككتل ملونة على تتبع موجة التنفس.
ملاحظة: بدون تعديل التكبير التنفس، سيتم طمس صور EKV بسبب الحركة الطبيعية للللحيوانات أثناء التنفس. - اضغط على زر EKV لتمكين وضع EKV. في القائمة المناسبة، حدد الدقة القياسية ومعدل الإطار 3000 أو أعلى. حدد المتابعة لتسجيل صور EKV. اضغط cinestore لحفظ الصور. استخدم صورة وضع EKV للحصول على قياسات لسرعة انتشار النبض (PPV) وقابلية التشتت والسلالة الشعاعية.
ملاحظة: قد يفشل تسجيل EKV إذا كانت هناك تقلبات غير طبيعية في التنفس، أو أن الحيوان يطمح بسرعة كبيرة، أو أن إعدادات معدلات الإطارات مرتفعة للغاية. في هذه الحالة، تعيين معدل الإطار أقل وانتظر التنفس الحيواني لتحقيق الاستقرار. عادة ما يكون تحديد معدل الإطار عند 3000 مناسبًا لكل من الفئران والجرذان.
3. خطوات ما بعد التصوير
- مسح بلطف هلام الموجات فوق الصوتية من منطقة البطن من الماوس مع منشفة ورقية مبللة بالماء الدافئ.
- وضع الماوس مرة أخرى في قفص المنزل على وسادة التدفئة.
- إيقاف تشغيل آلة isoflurane، وتنظيف منصة التصوير الحيواني ومحول مع مناديل رطبة.
- نقل بيانات الصورة التي تم جمعها أثناء الفحص بالموجات فوق الصوتية إلى القرص الصلب.
- إيقاف تشغيل أداة الموجات فوق الصوتية.
- بعد أن يتعافى الفأر من التخدير ويكون في حالة تأهب، وإزالة وسادة التدفئة والعودة القفص إلى رف الإسكان الحيوان.
4. تحليل الصور الأبهرالبطني
- تحليل صور وضع M لقياس MILD
- افتح برنامج الموجات فوق الصوتية وأدخل اسم الدراسة والمعلومات الوصفية لكل فأر.
- افتح بيانات الموجات فوق الصوتية في برنامج التحليل وافتح صورة M-mode وأوقف نبضات القلب مؤقتًا.
- انقر على القياسات.
- حدد حزمة الأوعية الدموية من الخيارات المنسدلة. انقر على العمق ورسم خط عبر تجويف الأبهر تمتد من الجدار الداخلي إلى الجدار(الشكل 2C، D).
ملاحظة: من أجل الاتساق، يجب أن تؤخذ القياسات في المرحلة الانقباضي من دورة القلب عندما يتم توسيع الأورطا إلى أقصى حد. رسم ثلاثة خطوط عبر ثلاث دقات قلب مختلفة للحصول على قياسات دقيقة ومتوسط من MILD. في AAA ، يتم أخذ القياسات في التوسع الأقصى للأورطام. من المستحسن أيضًا صيام الحيوانات 4-6 ساعة قبل جمع الصور لتجنب التداخل من حركية الأمعاء وضمان وضوح الصورة.
- تحليل سرعة انتشار النبض (PPV)
- افتح صورة EKV وأوقف نبضات القلب مؤقتًا.
- افتح نافذة جديدة على برنامج التحليل (على سبيل المثال، Vevo Vac) بالنقر على رمز الاسم.
- انقر على خيار PPV (السهم في الشكل 3D). ستظهر نافذة صغيرة مع صورة الأورطا.
- رسم مربع مستطيلة عن طريق النقر على جدار السفينة العلوي وسحب المؤشر لحوالي 4 ملم تغطي جدران الشريان الأورطاني فوق الكلى.
ملاحظة: حافظ على طول المربع متناسقًا (~4 مم) لجميع الصور. يمكن للمستخدم ضبط مربع مستطيلة عن طريق تدوير لمحاذاة مربع واختيار الخط ثم سحب إلى موقف جديد على السفينة التي يجري تحليلها للحصول على تصريف أنسب وواضحة من موجة النبض. سيتم عرض الخطوط الرأسية للبيانات من المستطيل وتحديدها على أنها اليسار (الصورة العلوية) واليمين (الصورة السفلية) على عائد الاستثمار. للحصول على تصور أفضل لتصريف موجة النبض ، من المفيد أحيانًا مربع الرسم فقط على الجدار العلوي كما هو موضح في الشكل 3. سيقوم البرنامج تلقائيا بحساب PPV (م / س). ومع ذلك ، فمن الأفضل دائمًا ضبط الخطوط الأرجوانية يدويًا لتعيين نقطة الانقلاب الدقيقة على موجات النبض وستتغير PPV وفقًا لذلك. - وأخيراً، حدد الأمر قبول لحفظ قيم PPV. تصدير الأرقام والبيانات إلى محرك تخزين البيانات.
- تحليل للتعصّب والسلالة الشعاعية
- افتح صورة EKV وأوقف نبضات القلب مؤقتًا.
- انقر على أيقونة البرنامج. البرنامج سيفتح نافذة جديدة.
- انقر على تتبع العائد على الاستثمار الجديد ورسم مربع مستطيلة على كل من جدران السفينة. سيقوم البرنامج بتتبع الجدران العلوية والسفلية للسفينة تلقائيًا. يمكن للمستخدم ضبط التتبع لمحاذاة على الجدار عن طريق النقر على النقاط الخضراء(الشكل 4A، B).
- الآن قبول التتبع. سيقوم البرنامج بحساب عدم القابلية (1/Mpa) في عائد الاستثمار المحدد.
- لقياس السلالة الشعاعية، حدد خيار السلالة المناسب من أشرطة القائمة في أعلى اليسار. سيتم فتح الصور للسلالة الشعاعية والإجهاد العرضي.
- الحصول على قيمة السلالة الشعاعية (٪ ) عن طريق تحريك المؤشر على ذروة المنحنى. تصدير البيانات كصور أو في شكل فيديو(الشكل 4A, B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تظهر صور M-mode التمثيلية لأورطا البطني العادي وتمدد الأوعية الدموية من الفئران في الشكل 2A والشكل 2B، على التوالي. يتم تحديد الشريان الأورطيا البطني فوق الكلى من خلال موقعه بجوار الشريان الكلوي الأيمن والشريان الميسنتيك المتفوق(الشكل 2A). تظهر الصور التمثيلية المستخدمة لحساب MILD ، في ثلاثة دقات قلب مختلفة من دورة القلب الانقباضي ، في الأورطان العادي وتمدد الأوعية الدموية في الشكل 2C، D على التوالي. في الحالة التي تطور فيها تمدد الأوعية الدموية الأبهري ، يتم تحديد القطر اللموي عن طريق رسم خط أصفر عمودي بين الحواف الداخلية للتجويف في منطقة التمدد الأقصى(الشكل 2B). عادة ما يتم متوسط ثلاثة قياسات مستقلة لتحديد قطر intraluminal دقيقة.
تظهر صور EKV التمثيلية للأورطا البطني المستخدمفي تحليل PPV في الشكل 3. يتم حساب PPV عن طريق رسم مربع مستطيل على الجدار اللمع من الشريان الأورطيا فوق الكلى(الشكل 3E)وتعديل الخطوط العمودية الأرجوانية للبيانات التي تم الحصول عليها من مربع مستطيل(الشكل 3F). يجب تعديل الخطوط الأرجوانية لتعيين نقطة انقلاب موجات النبض. تظهر صور EKV التمثيلية للأورطا البطني المناسبة لتحليل التشتت والسلالات الشعاعية في الشكل 4. يتم حساب التشتت والسلالة الشعاعية عن طريق تتبع الجدران المضيئة للأورطا فوق الكلى كما هو موضح في الشكل 4E. يتم الحصول على قيمة عدم القابلية (1/MPa) عن طريق اختيار خيار عدم القابلية / المرونة من القائمة المنسدلة من المربع (السهم الأحمر ، الشكل 4F). السلالة الشعاعية (٪ ) يتم الحصول عليها عن طريق اختيار خيار السلالة الشعاعية(الشكل 4G)ونقل المؤشر إلى ذروة الرسم البياني للسلالة الشعاعية(الشكل 4H).
لقد تحققنا من أهمية PPV في نموذج الماوس الناجم عن AngII من AAA ودرسنا كذلك الإمكانات العلاجية لمثبط نوتش (N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-(S)-phenylglycine t-butyl ester; DAPT) على التقدم والاستقرار من AAA المنشأة مسبقا. على وجه التحديد، تم إجراء جميع هذه الدراسات تمدد الأوعية الدموية على 8-10 أسابيع القديمة Apoe-/- الفئران الذكور بعد ضخ AngII من البروتوكولات المنشورة4،13. في اليوم 28 من ضخ AngII ، تم تقسيم الفئران بشكل عشوائي إلى مجموعتين وكانت تدار مركبة أو DAPT (10 ملغ / كجم) حتى التضحية في اليوم 5613. أظهر التصوير بالموجات فوق الصوتية عبر البطن زيادة تدريجية في خفيفة, PPV, وانخفاض في التشتت وسلالة شعاعي استجابة لAngII في اليوم 28(الشكل 5A-E). AngII ضخ زيادة هامشية خفيفة من اليوم 28 إلى 56 وDAPT لم تتغير بشكل كبير معتدل بالمقارنة مع AngII وحدها(الشكل 5A والشكل 5B). ومع ذلك ، زادت PPV تدريجيا مع ضخ AngII في الفترة من اليوم 28 إلى اليوم 56 وDAPT انخفضت بشكل كبير المزيد من الزيادات في PPV في اليوم 56(الشكل 5C). تم تقليل التشتت والسلالات الشعاعية ، والمعلمات لتقييم مرونة جدار السفينة مع ضخ AngII في حين لم تظهر DAPT أي تأثير كبير(الشكل 5D و 5E). من المهم أن نقدر أن PWV يرتبط بقوة مع MILD في اليوم 28 (R2= 0.51 ، الشكل 5F) ، في حين أنه في اليوم 56 ، كان الارتباط ضعيفًا نسبيًا (R2= 0.22)(الشكل 5G). يرتبط التصلب الأبهري في AAA في المقام الأول مع التغيرات في بنية الجدار الأبهري. الناحية الهيولوجية ، زاد ضخ AngII من تدهور الكولاجين والنشاط البروتيني في الطبقة المتوسطة من الأبهر(الشكل 5H ، الصف العلوي). خفض علاج DAPT هذه التغييرات في تدهور ECM(الشكل 5H ، الصف السفلي).
الشكل 1: إعداد الصك. (أ)عرض شامل للآلة الموجات فوق الصوتية جنبا إلى جنب مع غرفة التعريفي للتخدير وهلام أكثر دفئا. (ب)عرض عن قرب لمنصة التصوير ونظام المحول. (ج)عرض موضع المحول أثناء التقاط صورة محور قصير للأورطا البطني. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل الصور M-وضع للحصول على أقصى قطر intraluminal (معتدل). يتم عرض الصور M-وضع الأبهر العادي(A)وأورتا مع تمدد الأوعية الدموية الأبهري البطني(B)من الفئران. (C)و (D) ، معتدل رسمها في المرحلة الانقباضي من دورة القلب في الشريان الأورطا فوق الكلى من الفئران العادية(C)والفئران مع AAA(D). يتم أخذ القياسات في ثلاث ضربات قلب مختلفة كما هو موضح ويتم حساب متوسط القيمة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل صور EKV للحصول على سرعة انتشار النبض (PPV). EKV الصور التي تم جمعها من الأورطام الماوس العادي. ويتم التحليل عن طريق النقر على القياسات(A)ورمز البرنامج(B). ستظهر نافذة جديدة مع الرموز على الجانب الأيمن، كما هو موضح في C. الآن، انقر على PPV(D) ومرة أخرى، سوف تظهر نافذة صغيرة(E). رسم مربع مستطيلة على الجدار العلوي من التجويف كما هو مبين في E وانقر فوق قبول. سيتم الحصول على قيمة PPV كما هو موضح في F (السهم). يتم ضبط الخطوط الأرجوانية لتعيين نقطة انقلاب موجات النبض(G). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: قياس التشتت والسلالة الشعاعية. EKV الصور التي تم جمعها من الأورطام الماوس العادي. ويتم التحليل عن طريق النقر على القياسات(A)ورمز البرنامج(B). ستظهر نافذة جديدة مع الرموز على الجانب الأيمن، كما هو موضح في C. الآن، انقر على تتبع عائد الاستثمار الجديد(D)،وسوف تظهر نافذة جديدة مع آثار على الجدار العلوي والسفلي من تجويف كما هو مبين في E وانقر فوق قبول. سيتم الحصول على قيمة عدم القابلية للإزالة في الجدول كما هو واضح في F. للحصول على سلالة، انقر على سلالة(G). ستظهر النافذة قيمة السلالة الشعاعية (٪% مربع الضوء الأخضر)، كما يتم وضع المؤشر على ذروة الرسم البياني سلالة شعاعي(H). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: يرتبط PPV بالصفات الهيكلية للأورطام في AAA المنشأة. (أ)صور الموجات فوق الصوتية عبر البطن تظهر خفيفة في اليوم 0 و 28 و 42 و 56 من المجموعات التجريبية المشار لها في Apoe-/- الفئران. بدأت DAPT في اليوم 28. الخطوط الصفراء المنقطة الخطوط العريضة lumen. (ب)القياس الكمي للمعتدل في المجموعات المشار لها (اللون الأرجواني والأخضر يظهر AngII + السيارة وAngII + DAPT الفئران المعالجة على التوالي (ن = 16-18). (C, D و E) PPV، عدم القابلية للإجهاد وسلالة شعاعي في أيام مختلفة من العلاجات AngII و DAPT (ن = 8). (Fو G)، والرسوم البيانية التي تبين ارتباط بيرسون بين PPV وMILD في اليوم 28(واو)واليوم 56(G). (H)صور التأريخ التمثيلية لتلطيخ الكولاجين (ملطخة بثلاثي الكروم وينظر إليها على أنها تلطيخ الأزرق) والنشاط البروتيني من قبل في الموقع التصوير الشعاعي للزيمغراف مع أو بدون علاج DAPT في اليوم 56. تم استخدام اختبار مقارنات Tukey المتعددة لتحليل البيانات. *P< 0.05; ns = غير مهم. مقياس 50 ميكرون في H. هذا الرقم مقتبس من شارما وآخرون (2019) ، تقارير Scientifc (SREP-19-16491B)11. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التصوير بالموجات فوق الصوتية يوفر تقنية قوية لتحديد الخصائص الوظيفية للأورطام من خلال قياسات PPV، وقابلية التشتت والسلالة الشعاعية. هذه القياسات مفيدة بشكل خاص لدراسة نماذج الماوس من AAA ونهج في الجسم الحي يسمح لجمع البيانات الطولية التي يحتمل أن تكون مهمة لفهم التطور الزمني للأمراض الأبهري. على وجه التحديد ، يتم تحديد قياسات تصلب الأبهر في الجسم الحي محليًا في الأبهر البطني بواسطة PPV ، وإزالة القابلية للإجهاد والاضطراب الشعاعي من خلال تحليل بيانات EKV وتعتبر عامل خطر مستقل لعدم استقرار AAA16. التقنيات الموصوفة في هذه البروتوكولات هي على التوالي نسبيا إلى الأمام وتأخذ فقط 8-10 دقيقة للحصول على مجموعات الصور من فأرة واحدة. ويفضل أن يتم جمع جميع الصور من قبل مشغل واحد باستخدام معالم محددة جيدا ومتسقة لتوليد بيانات قابلة للاستنساخ ودقيقة.
وهناك عوامل محتملة تتطلب خبرة تقنية لتطبيقات هذه الأدوات. على سبيل المثال، أولاً، قد لا يعكس PPV فقط درجة تطور AAA في جدار الشرايين المحلي لأنه مقياس غير مباشر لتصلب الشرايين الإقليمية. ثانيا، يمكن أن يكون من الصعب قياس بدقة PPV إذا تلف الجدار الايتيمال. ثالثاً، قد يكون من الصعب الحصول على صور دقة حادة دون خبرة في تشغيل الجهاز. وقد تم تناول بعض هذه المخاوف في الإصدارات الأخيرة من أنظمة التصوير بالموجات فوق الصوتية حيث يتم تقليل الضوضاء والتحف ، مع الحفاظ على وتعزيز الحصول على البيانات للدراسات الحيوانية الصغيرة.
وكان تركيز التقنيات المستخدمة في الماضي (دوبلر، التصوير المجهري، التصوير بالرنين المغناطيسي) لتحديد تصلب الأبهر يقتصر على الصور ثنائية الأبعاد. PPV محسوبة من التصوير بالموجات فوق الصوتية وقد ظهرت كطريقة موثوق بها واستنساخها لتحديد تصلب الأبهر ويبدو أن تكون مستقلة عن الضغط الشرياني9،17. من المهم ملاحظة أن التعريف السائد لـ AAA باستخدام القطر الأقصى كمؤشر قياسي لا يرتبط دائمًا بشكل موثوق بالملاحظات السريرية. على سبيل المثال، قد تمزق تمدد الأوعية الدموية الصغيرة في حين أن بعض تمدد الأوعية الدموية الكبيرة تميل إلى البقاء مستقرة18،19،20. تصلب الأبهر يُحدث في وقت مبكر تغيير ًا ناتجًا عن إجهاد جدار الأبهر يُحدث نموًا في تمدد الأوعية الدموية ، وإعادة عرض10 وقد ارتبط بقوة مع Mmp2 و Mmp9 في نماذج الماوس من AAA10. وهكذا، بالإضافة إلى قطر الأورطا، قد توفر التحليلات الوظيفية معلومات هامة لتقييم تطور واستقرار AAA.
باستخدام هذه البروتوكولات, لقد درسنا الإمكانات العلاجية لمثبط نوتش الدوائية قوية (2S-N-(3,5-Difluorophenyl) أسيتيل]-L-alanyl-2-phenylglycine 1,1-dimethylethyl استر; DAPT) على التقدم والاستقرار من AAA المنشأة مسبقا باستخدام نموذج الماوس التي يسببها AngII من AAA11. أظهر التصوير بالموجات فوق الصوتية عبر البطن زيادة تدريجية في خفيفة، PWV، وانخفاض في التشتت وسلالة شعاعي في Apoe-/- الفئران استجابة لAngII من الضوابط في اليوم 28. لم تلاحظ أي زيادة أخرى في MILD بعد اليوم 28 حتى اليوم 56(الشكل 5). ومع ذلك، زادت الـ PPV تدريجياً وكانت أعلى بشكل ملحوظ في اليوم 56 مقارنة باليوم 28. مع تثبيط إشارات نوتش من قبل DAPT ، لم تكن الفئران الخفيفة مختلفة بشكل كبير عن AngII وحدها في اليوم 56. ومن المثير للاهتمام، DAPT منعت زيادة أخرى في PPV بحيث كان أقل بكثير من AngII في اليوم 56(الشكل 5C). لم يؤثر علاج DAPT بشكل كبير على عدم القابلية للإزالة أو السلالة الشعاعية(الشكل 5D, E). ومن المثير للاهتمام أن PPV ارتبط بقوة مع MILD في اليوم 28 (R2= 0.51) ، في حين أنه في اليوم 56 ، كان الارتباط ضعيفًا نسبيًا (R2= 0.22 ؛ الشكل 5واو). انعكست هذه التغيرات في تصلب الأبهر في زيادة تدهور الكولاجين والنشاط البروتيني مع AngII والتوهين من قبل DAPT(الشكل 5H). تسلط هذه الدراسة على سبيل المثال الضوء على القيمة المحتملة لقياسات تصلب الأبهر المستندة إلى الموجات فوق الصوتية في فهم المسار الزمني وإمكانية التنبؤ بكل من تقدم AAA والاستقرار.
وعلاوة على ذلك، يبدو النهج القائم على الموجات فوق الصوتية قيماً في تقييم الدور المحتمل للتدخلات الدوائية، لا سيما في المراحل التي من المرجح أن تكون مستقلة عن التغيرات في القطر داخل الإنارة (أي بما يتجاوز التوقع الفعلي الانحدار). باختصار، فإن الفهم التفصيلي لهذه التكنولوجيا واستخدامها سيفيد في تقييم تشخيص AAA في مرحلة مبكرة من المرض للتدخلات العلاجية الفعالة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل R01HL124155 (CPH) والتمويل من معهد البحوث في جامعة ميسوري إلى CPH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II | Sigma | A9525 | |
| Apoe-/- mice | The Jackon lab |  |
|
| Clippers | WAHL | 1854 | |
| Cotton swab | Q-tips | ||
| DAPT | Sigma | D5942 | |
| Depilatory cream | Nair | LL9038 | |
| Electrode cream | Sigma | 17-05 | |
| Gel warmer | Thermasonic (Parker) | 82-03 (LED) | |
| Heating pad | Stryker | T/pump professional | |
| Isoflurane | VetOne | Fluriso TM | |
| Isoflurane vaporizer | Visualsonics | VS4244 | |
| Lubricating ophthalmic ointment | Lacri-lube | ||
| Osmotic pumps | Alzet | Model 2004 | |
| Oxygen tank | Air gas | ||
| Tranducer | Visualsonics | MS-400 or MS550D | |
| Ultrasonic gel | Parker | Aquasonic clear | |
| Ultrasound Imaging System | Visualsonics | Vevo 2100 | |
| Vevo Vasc Software | Visualsonics |
References
- Wanhainen, A. How to Define an Abdominal Aortic Aneurysm — Influence on Epidemiology and Clinical Practice. Scandinavian Journal of Surgery. 97, 105-109 (2008).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics—2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137, 67 (2018).
- Xu, J., Shi, G. -P. Vascular wall extracellular matrix proteins and vascular diseases. Biochimica et biophysica acta. 1842, 2106-2119 (2014).
- Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 105, 1605-1612 (2000).
- Au - Sawada, H., et al. Ultrasound Imaging of the Thoracic and Abdominal Aorta in Mice to Determine Aneurysm Dimensions. Journal of Visualized Experiments. , 59013 (2019).
- Raaz, U., et al. Segmental Aortic Stiffening Contributes to Experimental Abdominal Aortic Aneurysm Development. Circulation. 131, 1783-1795 (2015).
- van Disseldorp, E. M. J., et al. Influence of limited field-of-view on wall stress analysis in abdominal aortic aneurysms. Journal of Biomechanics. 49, 2405-2412 (2016).
- Miyatani, M., et al. Pulse wave velocity for assessment of arterial stiffness among people with spinal cord injury: a pilot study. Journal of Spinal Cord Medicine. 32, 72-78 (2009).
- Sharma, N., et al. Deficiency of IL12p40 (Interleukin 12 p40) Promotes Ang II (Angiotensin II)-Induced Abdominal Aortic Aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39, 212-223 (2019).
- Raaz, U., et al. Segmental Aortic Stiffening Contributes to Experimental Abdominal Aortic Aneurysm Development. Circulation. 131, 1783-1795 (2015).
- Sharma, N., et al. Pharmacological inhibition of Notch signaling regresses pre-established abdominal aortic aneurysm. Scientific Reports. , (2019).
- Bray, S. J. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
- Hans, C. P., et al. Inhibition of Notch1 signaling reduces abdominal aortic aneurysm in mice by attenuating macrophage-mediated inflammation. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 32, 3012-3023 (2012).
- Cheng, J., Koenig, S. N., Kuivaniemi, H. S., Garg, V., Hans, C. P. Pharmacological inhibitor of notch signaling stabilizes the progression of small abdominal aortic aneurysm in a mouse model. Journal of American Heart Association. 3, 001064 (2014).
- Hans, C. P., et al. Transcriptomics analysis reveals new insights into the roles of Notch1 signaling on macrophage polarization. The Journal of Immunology. 200, (2018).
- Paraskevas, K. I., et al. Evaluation of aortic stiffness (aortic pulse-wave velocity) before and after elective abdominal aortic aneurysm repair procedures: a pilot study. Open Cardiovascular Medicine Journal. 3, 173-175 (2009).
- Fortier, C., Desjardins, M. P., Agharazii, M. Aortic-Brachial Pulse Wave Velocity Ratio: A Measure of Arterial Stiffness Gradient Not Affected by Mean Arterial Pressure. Pulse. 5, 117-124 (2017).
- Golledge, J. Abdominal aortic aneurysm: update on pathogenesis and medical treatments. Nature Reviews Cardiology. 16 (4), 225-242 (2019).
- Choksy, S. A., Wilmink, A. B., Quick, C. R. Ruptured abdominal aortic aneurysm in the Huntingdon district: a 10-year experience. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 81, 27-31 (1999).
- Luo, F., Zhou, X. -L., Li, J. -J., Hui, R. -T. Inflammatory response is associated with aortic dissection. Ageing Research Reviews. 8, 31-35 (2009).
