Summary
Dette manuskript beskriver en detaljeret protokol for brug af højfrekvent ultralydsscanning til måling af luminal diameter, pulsformeringshastighed, distensibility og radial belastning på en musemodel af abdominal aorta aneurisme.
Abstract
En abdominal aorta aneurisme (AAA) er defineret som en lokaliseret dilatation af abdominal aorta, der overstiger den maksimale intraluminale diameter (MILD) med 1,5 gange af sin oprindelige størrelse. Kliniske og eksperimentelle undersøgelser har vist, at små aneurismer kan briste, mens en delpopulation af store aneurismer kan forblive stabil. Ud over målingen af aortaens intraluminale diameter kan kendskabet til fartøjets vægs strukturelle træk således give vigtige oplysninger til vurdering af AAA's stabilitet. Aorta afstivning har for nylig vist sig som et pålideligt værktøj til at bestemme tidlige ændringer i den vaskulære væg. Pulse formering hastighed (PPV) sammen med distensibility og radial stamme er meget nyttige ultralyd-baserede metoder, der er relevante for vurdering af aorta stivhed. Det primære formål med denne protokol er at give en omfattende teknik til brug af ultralydimaging system til at erhverve billeder og analysere de strukturelle og funktionelle egenskaber af aorta som bestemt af MILD, PPV, distensibility og radial stamme.
Introduction
En abdominal aorta aneurisme (AAA) repræsenterer en betydelig hjerte-kar-sygdom karakteriseret ved en permanent lokaliseret dilatation af aorta overstiger den oprindelige beholder diameter med 1,5 gange1. AAA rangerer blandt de 13 hyppigste årsager til dødelighed i USA2. Udviklingen af AAA tilskrives degeneration af aortavæggen og elastin fragmentering, i sidste ende fører til aorta brud. Disse ændringer i aortavæggen kan forekomme uden en signifikant stigning i den maksimale intraluminale diameter (MILD), hvilket tyder på, at MILD alene ikke er tilstrækkelig til at forudsige sygdommens sværhedsgrad3. Derfor skal der identificeres yderligere faktorer for at påvise indledende ændringer i aortavæggen, hvilket kan være retningsgivende for tidlige behandlingsmuligheder. Det overordnede mål med denne protokol er at give en praktisk vejledning til vurdering af aorta funktionelle egenskaber ved hjælp af ultralydsscanning som karakteriseret ved målinger af pulsformeringshastighed (PPV), distensibility og radial stamme.
En velkarakteriseret eksperimentel model til at studere AAA, først beskrevet af Daugherty og kolleger, indebærer subkutan infusion af angiotensin II (AngII) via osmotiske pumper i Apoe-/- mus4. Præcis måling af MILD ved hjælp af ultralydsscanning har været medvirkende til at karakterisere AAA i denne musemodel5. Selv om histologiske ændringer under udviklingen af AAA er blevet grundigt undersøgt, ændringer i de funktionelle egenskaber af fartøjet væggen såsom aorta stivhed har ikke været godt karakteriseret. Denne protokol understreger brugen af højfrekvent ultralyd i kombination med de avancerede analyser som effektive værktøjer til at studere den tidsmæssige progression af AAA. Konkret giver disse tilgange os mulighed for at vurdere beholdervæggens funktionelle egenskaber målt ved PPV, distensibility og radial belastning.
Nylige kliniske undersøgelser hos forsøgspersoner med AAA, samt i murine elastase-induceret AAA model, tyder på en positiv sammenhæng mellem aorta stivhed og aorta diameter6,7. PPV, en indikator for aortastivhed, accepteres som en fremragende måling til kvantificering af ændringer i stivhed i beholderens væg6,8. PPV beregnes ved at måle impulsbølgeformens transittid på to steder langs vaskulaturen, hvilket giver en regional vurdering af aortastivhed. Vi har for nylig vist, at øget aortastivhed målt ved PPV, og på celleniveau som bestemt ved hjælp af atomkraft mikroskopi, positivt korrelerer med aneurisme udvikling9. Endvidere tyder litteraturen på, at aortastivhed kan gå forud for aneurisk dilatation og dermed kan give nyttige oplysninger om fartøjets vægs regionale iboende egenskaber under udviklingen af AAA10. Tilsvarende, distensibility og stamme målinger er kvantificering værktøjer til at måle tidligere ændringer af arteriel fitness. Sunde arterier er fleksible og elastiske, mens med øget stivhed og mindre elasticitet, distensibility og stamme er faldet. Her giver vi en praktisk vejledning og trin for trin protokol til brug af et højfrekvent ultralydssystem til at måle MILD, PPV, distensibility og radial stamme i mus. Protokollen indeholder tekniske tilgange, der bør anvendes i forbindelse med de grundlæggende oplysninger fra manualer til specifikke ultralydsbilledinstrumenter og den medfølgende videotutorial. Det er vigtigt, at den beskrevne billedprotokol i vores hænder giver reproducerbare og nøjagtige data, der forekommer værdifulde i studiet af udviklingen og udviklingen af eksperimentelle AAA.
For yderligere at demonstrere nytten af ultralydsscanning, giver vi eksempel billeder og målinger taget fra vores egne undersøgelser med henblik på at bruge farmakologiske tilgange til forebyggelse af eksperimentelle AAA11. Specifikt, hak signalering er blevet foreslået at være involveret i flere aspekter af vaskulær udvikling og betændelse12. Ved hjælp af genhaploinsufficiens og farmakologiske tilgange, har vi tidligere vist, at Notch hæmning reducerer udviklingen af AAA i mus ved at forhindre infiltration af makrofager på det sted, vaskulær skade13,14,15. For den aktuelle artikel, ved hjælp af farmakologiske tilgang til Notch hæmning vi fokusere på forholdet mellem aorta stivhed og faktorer i forbindelse med AAA. Disse undersøgelser viser, at Notch hæmning reducerer aorta stivhed, som er et mål for AAA progression11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen for håndtering af mus og ultralydsscanning blev godkendt af University of Missouri Institutional Animal Care and Use Committee (dyreprotokol nummer 8799) og blev udført i henhold til AAALAC International.
1. Udstyr opsætning og forberedelse af mus
- Opsætning af udstyr
- Tænd ultralydinstrumentet, ultralydsgelvarmeren og varmepuden.
- Åbn ultralydsprogrammet, og indtast undersøgelsesnavnet og descriptive oplysninger for hver mus.
- Vælg programmet som Generel billedbehandling.
- Vælg den relevante transducer til abdominal billeddannelse (Figur 1B,C). I dette eksperiment anvendes MS400 transducer.
- Sørg for anæstesi isofluran og iltniveauer er tilstrækkelige til hver eksperimentel session.
- Rengør ultralydsplatformen til dyrebilleder.
- Forberedelse af mus
- Placer museburet oven på en varmepude (36,5 til 38,5 °C).
- Hold forsigtigt musen ved sin halebase og læg dem i det iltfyldte isoflurankammer.
- Direkte isofluran og ilt flow til induktion kammer.
- Tænd for isofluran fordamper og sæt isofluran niveau til 1-2% vol/ vol. Tænd for ilttank tryk til 1-2 L/min.
- Efter ~ 2 min, bekræfte den passende dybde af anæstesi ved fraværet af tilbagetrækning reflekser ved klemning fodpuden af musen.
- Derefter skal du slukke induktionkammer levering filial og tænde filial rettet til anæstesi næse kegle.
- Overfør musen fra induktionskammeret til ultralydimagingscenen, og placer anæstesikeglen over dyrets næse.
- Vip dyrebilledplatformen ca. 10° til nederste højre hjørne for optimal scanning (Figur 1B).
- Sæt en dråbe steril oftalmologisk opløsning i begge øjne af mus for at forhindre tørring under anæstesi.
- Placer musen i supine position med næsen indsat i anæstesi kegle.
- Påfør elektrode gel til alle fire poter ved hjælp af en vatpind og tape poterne til kobber fører på dyret imaging platform for elektrokardiogram aflæsninger (Figur 1C).
- Brug klippere til at barbere hår på billedbehandlingsstedet og derefter anvende hårfjerningscreme til at fjerne resterende pels. Lad i mindre end 1 min.
- Tør forsigtigt fløde og hår af med et fugtigt køkkenrulle.
- Overvåg vejrtrækningen, og sørg for, at pulsen opretholdes mellem 450-550 slag/min. Hvis under dette niveau, reducere isofluran flow og vente, indtil pulsen genopretter.
- Påfør forvarmet ultralydsgel (37 °C) på det forberedte hudsted, og transduceren fastgøres til holderen, og sænk ned, indtil den rører gelen (figur 1C).
2. Ultralydsscanning af abdominal aorta
- Placer transduceren vandret (dvs. vinkelret på musens midterlinje).
- Glat ultralyd gel og fjerne bobler ved hjælp af træpind af en vatpind.
- Sænk transduceren og placer 0,5 - 1 cm under mellemgulvet efter berøring af gelen. Nu begynder at observere billederne.
- Visualiser abdominal aorta i den korte akse visning (Figur 1C).
BEMÆRK: B-tilstand er standard og mest effektiv tilstand til anatomisk lokalisere aorta og placere transduceren. Den abdominale aorta er identificeret ved tilstedeværelsen af pulsatile flow ved hjælp af farve Doppler og magt Doppler tilstande i den korte akse (dvs. den circumferential tværsnit af aorta). Juster mikromanipulatorerne på dyrets scene og transduceren for at bringe tværsnittet af aortaen til midten af billedet. - Drej forsigtigt transduceren 90° med uret, og juster langsomt x-aksemikromanipulatorknappen for at visualisere aortaen i lang aksevisning (langsgående del af aortaen).
BEMÆRK: I mange tilfælde kan mave-tarmgasser forstyrre billedet, eller aortaen er muligvis ikke i den optimale vinkel, så der er en klar lang aksevisning. Juster transducerens vinkel langsomt og vandret, indtil der opnås en acceptabel lang aksevisning. Hvis der stadig er problemer, skal du løfte transduceren, kontrollere for luftbobler under transduceren, justere dyrets hældningsvinkel en smule, genanvende geler og gentage alle trinene igen. - Angiv fokuszonen og dybden i aorta-området ved hjælp af skiften fokuszone og fokusdybde. Juster tidsforøgelsesskyderen manuelt for at gøre aortaens lumen mørkere for at opnå en optimal kontrast af aortavæggen.
- Juster y-aksen manipulator at visualisere forgreningpunkter af den overlegne mesenteriske og de rigtige nyrearterier. Brug den rigtige nyrearterie som et vartegn for at tage billede af den suprarenal aorta (Figur 2A).
- Optag mindst 100 billeder af B-tilstand på den suprarenal aorta.
- Tryk på cinestore for at gemme B-mode-billederne.
- Tryk på M-mode-knappen på instrumenttastaturet for at aktivere Optagelse i M-tilstand. Rul markøren bolden til at bringe den gule indikator linje til en normal aorta sektioner med klar beholder væg billede, eller til de sektioner, hvor maksimal diameter af aneurisme er observeret.
- Tryk på SV/gate-knappen, og juster markørens kugle for at sikre, at fartøjets vægge er inkluderet i målebeslaget. Tryk på opdatering for at registrere M-tilstand målinger og tryk cinestore at fange (Figur 2A,B).
BEMÆRK: Aneurismens maksimale diameter må ikke være i samme billedbehandlingsplan som aortaens optimale lange akseudsyn. Juster x-akse manipulatorknappen en smule for hver M-tilstand måling for at sikre, at MILD i hver sektion er fanget. - Hvis du vil hente EKG-gated Kilohertz Visualization (EKV) billeder, skal du trykke på B-mode-knappen for at gå tilbage til B-tilstandoptagelse.
BEMÆRK: Hvis billederne ikke er skarpe, skal du justere x-aksemanipulatoren for at opnå det skarpeste billede af lumens øverste væg over en sektionslængde (dvs. > 6 mm). - Tryk på knappen Indstillinger for Fysio på tastaturet, og vælg Respiration Gating. Juster gatingdelay og vindue manuelt for kun at registrere dataene under de fladere dele af respirationsbølgen. Optagelsessektionerne vises som farvede blokke på sporingen af respirationsbølgen.
BEMÆRK: Uden justering af respirationsgatningen vil EKV-billederne blive sløret på grund af dyrets normale bevægelse under vejrtrækningen. - Tryk på EKV-knappen for at aktivere EKV-tilstanden. Vælg Standardopløsning og billedhastighed 3000 eller højerei den relevante menu . Vælg fortsæt for at optage EKV-billeder. Tryk på cinestore for at gemme billederne. Brug EKV mode billede til at opnå målinger af puls formeringshastighed (PPV), distensibility og radial stamme.
BEMÆRK: EKV-registreringen kan mislykkes, hvis der er unormale udsving i respiration, dyret sønsker for hurtigt, eller rammehastigheder indstillinger er for høje. I dette tilfælde skal du indstille billedhastigheden lavere og vente på, at dyrenes respiration stabiliseres. Indstilling af billedhastigheden på 3000 er normalt hensigtsmæssigt for både mus og rotter.
3. Trin efter billedbehandling
- Tør forsigtigt ultralydsgelen af musens maveområde med et køkkenrulle fugtet med varmt vand.
- Placer musen tilbage i sit hjem bur på en varmepude.
- Sluk for isofluranmaskinen, rengør dyrebilledplatformen og transduceren med fugtige klude.
- Overfør de billeddata, der indsamles under ultralydsscanningen, til harddisken.
- Sluk for ultralydsinstrumentet.
- Når musen kommer sig efter anæstesi og er opmærksom, skal du fjerne varmepuden og returnere buret til dyrestalden.
4. Analyse af abdominale aorta billeder
- Analyse af M-mode billeder til at måle MILD
- Åbn ultralydsprogrammet, og indtast undersøgelsesnavnet og descriptive oplysninger for hver mus.
- Åbn ultralydsdataene i analysesoftwaren, og åbn M-tilstandsbilledet, og sæt hjerteslaget på pause.
- Klik på Målinger.
- Vælg den vaskulære pakke fra rullemenuen. Klik på dybde og tegne en linje over aorta lumen strækker sig fra indre væg til væg(Figur 2C,D).
BEMÆRK: For konsistens en skal målingerne foretages i den systoliske fase af hjertecyklussen, når aortaen er maksimalt udvidet. Tegn tre linjer på tværs af tre forskellige hjerteslag for at opnå nøjagtige og gennemsnitlige målinger af MILD. I AAA foretages målingerne ved aortaens maksimal dilatation. Det er også tilrådeligt at faste dyrene 4-6 timer før indsamling af billeder for at undgå interferens fra tarmmotilitet og sikre billedklarhed.
- Analyse for impulsformeringshastighed (PPV)
- Åbn EKV-billedet, og sæt hjerteslaget på pause.
- Åbn et nyt vindue på analysesoftwaren (f.eks. Vevo Vac) ved at klikke på navneikonet.
- Klik på PPV-indstillingen (pil en i figur 3D). Der vises yderligere et lille vindue med billedet af aortaen.
- Tegn en rektangulær kasse ved at klikke på den øverste beholdervæg og trække markøren i ca. 4 mm, der dækker begge væggene i den suprarenala.
BEMÆRK: Hold længden af boksen ensartet (~ 4 mm) for alle billederne. Brugeren kan justere den rektangulære boks ved at rotere for at justere kassen og vælge linjen og derefter trække til en ny position på fartøjet analyseres for at opnå den mest hensigtsmæssige og klare bøjning af pulsbølgen. De lodrette datalinjer fra rektanglet vises og identificeres som venstre (øverste billede) og højre (nederste billede) på investeringsafkastet. For en bedre visualisering af bøjningen af pulsbølgen er det nogle gange kun nyttigt at tegne boksen på den øverste væg som vist i figur 3. Softwaren beregner automatisk PPV (m/s). Men det er altid bedre manuelt at justere de lilla linjer for at indstille den nøjagtige bøjning punkt på pulsbølger og PPV vil ændre sig i overensstemmelse hermed. - Endelig skal du vælge kommandoen Accepter for at gemme PPV-værdierne. Eksporter tallene og dataene til datalagringsdrevet.
- Analyse for distensibility og radial stamme
- Åbn EKV-billedet, og sæt hjerteslaget på pause.
- Klik på softwareikonet. Softwaren vil åbne et nyt vindue.
- Klik på spor nye ROI og tegne en rektangulær boks på begge vægge af fartøjet. Softwaren vil automatisk spore de øverste og nedre vægge af fartøjet. Brugeren kan justere sporingen, så det justeres på væggen, ved at klikke på grønne punkter(figur 4A,B).
- Accepter nu sporingen. Softwaren beregner distensibility (1/Mpa) i det valgte investeringsafkast.
- For radial stamme måling, skal du vælge den relevante stamme mulighed fra menulinjerne øverst til venstre. Billederne for radial stamme og tangential stamme vil åbne.
- Opnå værdien for radial stamme (%) ved at flytte markøren på toppen af kurven. Eksportér dataene som billeder eller i videoformat (Figur 4A,B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative M-mode billeder af den normale og aneurysmal abdominal aorta fra mus er vist i figur 2A og figur 2B, henholdsvis. Den suprarenal abdominal aorta er identificeret ved sin placering ved siden af højre nyrearterie og den overlegne mesenteriske arterie (Figur 2A). Repræsentative billeder, der anvendes til beregning af MILD, på tre forskellige hjerteslag af den systoliske hjertecyklus, i normal og aneurisk aorta er vist i figur 2C,D hhv. I en situation, hvor der er udviklet en aortaaneurisme, bestemmes luminaldiameteren ved at tegne en vinkelret gul linje mellem lumens to indvendige kanter i det område, hvor maksimal dilatationen (figur 2B) er . Tre uafhængige målinger er typisk gennemsnit til at bestemme en nøjagtig intraluminal diameter.
Repræsentative EKV-billeder af abdominal aorta , der anvendes til analyse af PPV , er vist i figur 3. PPV beregnes ved at tegne en rektangulær boks på luminalvæggen i suprarenal aorta (figur 3E) og justering af de lilla lodrette linjer af data, der er opnået fra den rektangulære boks (figur 3F). De lilla linjer skal justeres for at indstille pulsbølgernes bøjningspunkt. Repræsentative EKV-billeder af abdominalaorta , der er egnede til analyse af distensibility og radiale stammer , er vist i figur 4. Distensibility og radial stamme beregnes ved at spore luminale vægge i den suprarenal aorta som vist i figur 4E. Værdien for distensibility (1/MPa) opnås ved at vælge indstillingen distensibility/elasticitet fra rullemenuen i boksen (rød pil, figur 4F). Den radiale stamme (%) opnås ved at vælge den radiale stammemulighed (Figur 4G) og flytte markøren til toppen af den radiale stammegraf (figur 4H).
Vi har valideret betydningen af PPV i AngII-induceret musemodel af AAA og yderligere undersøgt det terapeutiske potentiale af en Notch hæmmer (N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-(S)-phenylglycin t-butyl ester; DAPT) om progression og stabilitet af præetablerede AAA. Konkret blev alle disse aneurisme undersøgelser udført på 8-10 uger gamle Apoe- /- hanmus efter infusion af AngII ved offentliggjorte protokol4,13. Ved dag 28 i Infusion af AngII blev mus tilfældigt opdelt i to grupper og blev administreret køretøj eller DAPT (10 mg/kg), indtil de blev ofret på dag 5613. Transabdominal ultralydsscanning viste en progressiv stigning i MILD, PPV, og et fald i distensibility og radial stamme som reaktion på AngII på dag 28(Figur 5A-E). AngII infusion steg marginalt MILD fra dag 28 til 56, og DAPT ændrede ikke MILD væsentligt i forhold til AngII alene (figur 5A og figur 5B). PPV steg imidlertid gradvist med Infusion af AngII fra dag 28 til dag 56, og DAPT faldt yderligere yderligere stigninger i PPV på dag 56 (figur 5C). Distensibility og radiale stammer, parametre til vurdering af eelasticiteten af fartøjetvæggen blev nedsat med AngII infusion, mens DAPT viste ingen signifikant effekt(figur 5D og 5E). Det er vigtigt at forstå, at PWV korreleret stærkt med MILD på dag 28 (R2=0,51, figur 5F),mens korrelationen på dag 56 var forholdsvis svag (R2=0,22) (Figur 5G). Aorta stivhed i AAA er primært forbundet med ændringer i aorta væg arkitektur. Histologisk, AngII infusion øget kollagen nedbrydning og proteolytisk aktivitet i det mediale lag af aorta (Figur 5H, øverste række). DAPT-behandling minimerede sådanne ændringer i ECM-nedbrydningen (Figur 5H, nederste række).
Figur 1: Opsætning af instrumentet. (A) Samlet udsyn af ultralydsmaskinen sammen med induktionskammer til anæstesi og gelvarmer. (B) Nærbillede af billedplatformen og transducersystemet. C) Udsigten til transducerplaceringen, mens du opfanger kort aksebillede af abdominalaortaen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Analyse af M-mode billeder for at opnå maksimal intraluminal diameter (MILD). M-mode billeder af normal aorta (A) og aorta med abdominal aorta aneurisme (B) fra mus er vist. C) og(D), MILD trukket ved systolisk fase af hjertecyklussen i den suprarenalaorta af normale mus (C) og mus med AAA (D). Målinger på tre forskellige hjerteslag tages som vist, og gennemsnitsværdien beregnes. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Analyse af EKV-billeder til opnåelse af impulsformeringshastighed (PPV). EKV billeder indsamlet fra normal mus aorta. Analysen sker ved at klikke på målinger (A) og softwareikonet (B). Der vises et nyt vindue med ikonerne i højre side, som vist i C. Nu skal du klikke på PPV(D) og igen, et lille vindue vises(E). Tegn en rektangulær boks på lumens øverste væg som vist i E, og klik på Accepter. PPV-værdien opnås som vist i F (pil). De lilla linjer justeres for at indstille pulsbølgernes bøjningspunkt (G). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Måling af distensibility og radial belastning. EKV billeder indsamlet fra normal mus aorta. Analysen sker ved at klikke på målinger (A) og softwareikonet (B). Der vises et nyt vindue med ikonerne i højre side, som vist i C. Nu skal du klikke på spor nye ROI (D),et nyt vindue vises med spor på den øverste og den nederste væg af lumen som vist i E og klik acceptere. Værdien for distensibility opnås i tabellen som vist i F. For belastning, skal du klikke på belastning (G). Vinduet viser den radiale stammeværdi (%, grøn fremhævet boks), da markøren placeres på toppen af den radiale stammegraf (H). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: PPV korrelerer med strukturelle træk af aorta i den etablerede AAA. (A) Repræsentative transabdominale ultralydsbilleder, der viser MILD ved dag 0, 28, 42 og 56 af angivne eksperimentelle grupper i Apoe-/- mus. DAPT blev startet på dag 28. Stiplede gule linjer skitserer lumen. B) Kvantificering af MILD i de angivne grupper (lilla og grøn farve viser AngII + køretøj og AngII + DAPT behandlede mus henholdsvis (n=16-18). (C, D og E) PPV, distensibility og radial stamme på forskellige dage af AngII og DAPT behandlinger (n = 8). (F og G), Grafer, der viser Pearsons sammenhæng mellem PPV og MILD på dag 28 (F) og dag 56 (G). (H) Repræsentative histologiske billeder til kollagenfarvning (plettet med trichrome og betragtes som blå farvning) og proteolytisk aktivitet ved in situ zymography med eller uden DAPT behandling på dag 56. Tukey flere sammenligninger test blev brugt til dataanalyse. *P<0,05; ns = ikke-signifikant. Skala 50 μm i H. Dette tal er tilpasset fra Sharma et al. (2019), Scientifc Reports (SREP-19-16491B)11. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ultralydsscanning giver en kraftfuld teknik til bestemmelse af aortas funktionelle egenskaber gennem målinger af PPV, distensibility og radial stamme. Disse målinger er særligt lærerige for at studere musemodeller af AAA og in vivo tilgang giver mulighed for indsamling af langsgående data, der er potentielt vigtigt at forstå tidsmæssige udvikling af den aortiske patologi. Specifikt bestemmes målinger af in vivo aorta stivhed lokalt i abdominal aorta af PPV, distensibility og radial stamme ved at analysere EKV-data og betragtes som en uafhængig risikofaktor for AAA ustabilitet16. De teknikker, der er beskrevet i disse protokoller er relativt ligetil og tager kun 8-10 min at opnå billedsæt fra en mus. Alle billeder skal helst indsamles af en enkelt operatør ved hjælp af veldefinerede og ensartede landemærker til at generere reproducerbare og præcise data.
Der er potentielle faktorer, der kræver teknisk ekspertise til anvendelse af disse værktøjer. For eksempel kan PPV for det første ikke kun afspejle graden af AAA udvikling i den lokale arteriel væg, fordi det er et indirekte mål for regional arteriel stivhed. For det andet kan det være svært præcist at måle PPV, hvis den uvurderlige væg er beskadiget. For det tredje kan det være en udfordring at opnå skarpe opløsningsbilleder uden ekspertise i driften af instrumentet. Nogle af disse bekymringer er blevet behandlet i de seneste versioner af ultralydimagingsystemer, hvor speckle støj og artefakter reduceres, samtidig med at og forbedre dataindsamlingen for små dyreforsøg.
Fokus for teknikker, der anvendes i fortiden (Doppler, mikroangiografi, magnetisk resonans imaging) til at bestemme aorta stivhed var begrænset til to-dimensionelle billeder. PPV beregnet ud fra ultralydsscanningen er opstået som en pålidelig og reproducerbar metode til at bestemme aorta stivhed og synes at være uafhængig af arteriel tryk9,17. Det er vigtigt at bemærke, at den fremherskende definition af AAA ved hjælp af maksimal diameter som et standardindeks ikke altid pålideligt korrelerer med kliniske observationer. For eksempel kan små aneurismer briste, mens nogle store aneurismer tendens til at forblive stabil18,19,20. Aorta afstivning er en tidlig ændring generere aorta væg stress, der udløser aneurisk vækst, og remodeling10 og har været stærkt korreleret med Mmp2 og Mmp9 i musemodeller af AAA10. Ud over aortaens diameter kan funktionelle analyser således give vigtige oplysninger til vurdering af AAA's progression og stabilitet.
Ved hjælp af disse protokoller har vi undersøgt det terapeutiske potentiale af en potent farmakologisk Hak-hæmmer (2S-N-[(3,5-Difluorophenyl) acetyl]-L-alanyl-2-phenylglycin 1,1-dimethylethyllester; DAPT) om progression og stabilitet af præetablerede AAA ved hjælp af en AngII-induceret musemodel af AAA11. Transabdominal ultralydsscanning viste en progressiv stigning i MILD, PWV, og et fald i distensibility og radial stamme i Apoe-/- mus som reaktion på AngII end kontrol på dag 28. Der blev ikke observeret yderligere stigning i MILD efter dag 28 til dag 56 (figur 5). PPV steg imidlertid gradvist og var betydeligt højere på dag 56 sammenlignet med dag 28. Med hæmning af Notch signalering af DAPT, MILD mus var ikke væsentligt forskellig fra AngII alene på dag 56. Interessant, DAPT forhindret yderligere stigning i PPV sådan, at det var betydeligt lavere end AngII på dag 56(Figur 5C). DAPT-behandlingen påvirkede ikke i væsentlig grad distensibility eller radial stamme (figur 5D,E). Interessant, PPV korreleret stærkt med MILD på dag 28 (R2= 0,51), mens der på dag 56, korrelationen var relativt svag (R2= 0,22; Figur 5F). Disse ændringer i aortastivheden blev afspejlet i den øgede kollagennedbrydning og proteolytiske aktivitet med AngII og dæmpningen af DAPT (Figur 5H). Dette eksempel undersøgelse fremhæver den potentielle værdi af ultralyd-baserede aorta stivhed measurments i forståelsen af tid-kursus og forudsigelighed af både AAA progression og stabilitet.
Desuden forekommer ultralydsbaseret tilgang værdifuld i vurderingen af den potentielle rolle for farmakologiske indgreb, især i faser, der sandsynligvis vil være uafhængige af ændringer i intraluminal diameter (dvs. ud over forventningen til de faktiske regression). Sammenfattende vil detaljeret forståelse og brug af en sådan teknologi drage fordel af at evaluere prognosen for AAA på et tidligt stadium af sygdommen for effektive terapeutiske indgreb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af R01HL124155 (CPH) og finansiering fra Forskningsinstituttet ved University of Missouri til CPH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II | Sigma | A9525 | |
| Apoe-/- mice | The Jackon lab |  |
|
| Clippers | WAHL | 1854 | |
| Cotton swab | Q-tips | ||
| DAPT | Sigma | D5942 | |
| Depilatory cream | Nair | LL9038 | |
| Electrode cream | Sigma | 17-05 | |
| Gel warmer | Thermasonic (Parker) | 82-03 (LED) | |
| Heating pad | Stryker | T/pump professional | |
| Isoflurane | VetOne | Fluriso TM | |
| Isoflurane vaporizer | Visualsonics | VS4244 | |
| Lubricating ophthalmic ointment | Lacri-lube | ||
| Osmotic pumps | Alzet | Model 2004 | |
| Oxygen tank | Air gas | ||
| Tranducer | Visualsonics | MS-400 or MS550D | |
| Ultrasonic gel | Parker | Aquasonic clear | |
| Ultrasound Imaging System | Visualsonics | Vevo 2100 | |
| Vevo Vasc Software | Visualsonics |
References
- Wanhainen, A. How to Define an Abdominal Aortic Aneurysm — Influence on Epidemiology and Clinical Practice. Scandinavian Journal of Surgery. 97, 105-109 (2008).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics—2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137, 67 (2018).
- Xu, J., Shi, G. -P. Vascular wall extracellular matrix proteins and vascular diseases. Biochimica et biophysica acta. 1842, 2106-2119 (2014).
- Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 105, 1605-1612 (2000).
- Au - Sawada, H., et al. Ultrasound Imaging of the Thoracic and Abdominal Aorta in Mice to Determine Aneurysm Dimensions. Journal of Visualized Experiments. , 59013 (2019).
- Raaz, U., et al. Segmental Aortic Stiffening Contributes to Experimental Abdominal Aortic Aneurysm Development. Circulation. 131, 1783-1795 (2015).
- van Disseldorp, E. M. J., et al. Influence of limited field-of-view on wall stress analysis in abdominal aortic aneurysms. Journal of Biomechanics. 49, 2405-2412 (2016).
- Miyatani, M., et al. Pulse wave velocity for assessment of arterial stiffness among people with spinal cord injury: a pilot study. Journal of Spinal Cord Medicine. 32, 72-78 (2009).
- Sharma, N., et al. Deficiency of IL12p40 (Interleukin 12 p40) Promotes Ang II (Angiotensin II)-Induced Abdominal Aortic Aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39, 212-223 (2019).
- Raaz, U., et al. Segmental Aortic Stiffening Contributes to Experimental Abdominal Aortic Aneurysm Development. Circulation. 131, 1783-1795 (2015).
- Sharma, N., et al. Pharmacological inhibition of Notch signaling regresses pre-established abdominal aortic aneurysm. Scientific Reports. , (2019).
- Bray, S. J. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
- Hans, C. P., et al. Inhibition of Notch1 signaling reduces abdominal aortic aneurysm in mice by attenuating macrophage-mediated inflammation. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 32, 3012-3023 (2012).
- Cheng, J., Koenig, S. N., Kuivaniemi, H. S., Garg, V., Hans, C. P. Pharmacological inhibitor of notch signaling stabilizes the progression of small abdominal aortic aneurysm in a mouse model. Journal of American Heart Association. 3, 001064 (2014).
- Hans, C. P., et al. Transcriptomics analysis reveals new insights into the roles of Notch1 signaling on macrophage polarization. The Journal of Immunology. 200, (2018).
- Paraskevas, K. I., et al. Evaluation of aortic stiffness (aortic pulse-wave velocity) before and after elective abdominal aortic aneurysm repair procedures: a pilot study. Open Cardiovascular Medicine Journal. 3, 173-175 (2009).
- Fortier, C., Desjardins, M. P., Agharazii, M. Aortic-Brachial Pulse Wave Velocity Ratio: A Measure of Arterial Stiffness Gradient Not Affected by Mean Arterial Pressure. Pulse. 5, 117-124 (2017).
- Golledge, J. Abdominal aortic aneurysm: update on pathogenesis and medical treatments. Nature Reviews Cardiology. 16 (4), 225-242 (2019).
- Choksy, S. A., Wilmink, A. B., Quick, C. R. Ruptured abdominal aortic aneurysm in the Huntingdon district: a 10-year experience. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 81, 27-31 (1999).
- Luo, F., Zhou, X. -L., Li, J. -J., Hui, R. -T. Inflammatory response is associated with aortic dissection. Ageing Research Reviews. 8, 31-35 (2009).
