Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Undersøgelse af kort peptid adsorption på opløsning spredte uorganiske nanopartikler ved hjælp af udtynding metode

Published: April 11, 2020 doi: 10.3791/60526

Summary

Det første skridt i at forstå biomolekyle-uorganisk fast fase interaktion afslører grundlæggende fysisk-kemiske konstanter, der kan evalueres ved at etablere adsorption isotermer. Adsorption fra væskefasen begrænses af kinetik, overfladekapacitet, pH og konkurrencedygtig adsorption, som alle bør overvejes med forsigtighed, før der angives et adsorptionseksperiment.

Abstract

Grundlæggende elementer i uorganisk-organiske interaktioner er af afgørende betydning for opdagelsen og udviklingen af nye biogrænseflader, der kan udnyttes i bioteknologi og medicin. Nylige undersøgelser tyder på, at proteiner interagerer med overflader gennem begrænsede adsorptionssteder. Proteinfragmenter som aminosyrer og peptider kan bruges til interaktionsmodellering mellem komplekse biologiske makromolekyler og uorganiske overflader. I løbet af de sidste tre årtier er der udviklet mange gyldige og følsomme metoder til at måle de grundlæggende fysiske kemiforhold i disse interaktioner: isotermisk titreringskatotri (ITC), overfladeplasmonresonans (SPR), kvartskrystalmikrobalance (QCM), total intern refleksionsfluorescens (TIRF) og svækket total reflektorspektroskopi (ATR).

Den enkleste og mest overkommelige teknik til måling af adsorption er udtyndingsmetoden, hvor ændringen i sorbatkoncentrationen (udtynding) efter kontakt med opløsningsdispergeret sorbent beregnes og antages at være adsorberet. Adsorptionsisotermer baseret på udtyndingsdata giver alle grundlæggende fysisk-kemiske data. Adsorption fra opløsninger kræver dog længere ligevægtstider på grund af kinetiske begrænsninger og sorbenter med et højt specifikt overfladeareal, hvilket gør det næsten uanvendeligt på makroskopiske faste planoverflader. Desuden bør faktorer såsom ustabilitet af sol, nanopartikel aggregater, sorbent krystallinitet, nanopartikel størrelse sfordeling, pH af opløsningen, og konkurrence om adsorption, bør overvejes, mens de studerer adsorbing peptider. Udtømning data isotherm konstruktion giver omfattende fysisk kemi data for bogstaveligt talt hver opløselig sorbat endnu forbliver den mest tilgængelige metode, da det ikke kræver dyre opsætninger. Denne artikel beskriver en grundlæggende protokol for den eksperimentelle undersøgelse af peptid adsorption på uorganisk oxid og dækker alle kritiske punkter, der påvirker processen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I de sidste 50 år har samspillet mellem uorganiske overflader og peptider tiltrukket en masse opmærksomhed på grund af dens store betydning inden for materialevidenskab og medicin. Biomedicinsk forskning er fokuseret på kompatibilitet og stabilitet af bioinorganiske overflader, som har direkte konsekvenser for regenerativ medicin, vævsteknik1,2,3og implantation4,5,6,7. Moderne bioresponsive anordninger, såsom sensorer og aktuatorer, er baseret på funktionelle proteiner, der er immobiliseret på oxidhalvledende overflader8,9,10,11,12,13. Moderne rensningspraksis for proteinproduktion er ofte afhængig af biomolekyleinteraktionsegenskaber i downstream-rensning og separation14.

Blandt flere uorganiske oxider er titandioxid den mest anvendte i kombination med biologisk relevante substrater15,16. Forskning inden for TiO2-baseredebiogrænseflader har koncentreret sig om at etablere en stærk og specifik binding af proteiner og peptider uden at ændre deres biologiske og strukturelle egenskaber. I sidste ende er det vigtigste mål et lag af biomolekyler med høj overfladetæthed med høj stabilitet og øget funktionalitet, som vil fremme oprettelsen af titaniumbaserede bioteknologiske og medicinske anvendelser17.

Titanium og dets legeringer har været anvendt i udstrakt grad som et kirurgisk implantat materiale i mindst seks årtier, fordi en overflade TiO2 lag med en tykkelse på et par nanometer er korrosionsbestandig og udviser en høj grad af biokompatibilitet i mange in vivo applikationer18,19,20. Titandioxid betragtes også bredt som et uorganisk substrat produceret i biomineralisering, hvor nukleation og uorganisk fasevækst ledsaget af proteiner og peptider kan give materialer med lovende katalytiske og optiske egenskaber21,22,23,24.

I betragtning af den høje relevans af samspillet mellem uorganiske materialer og biomolekyler i almindelighed og protein-TiO2 interaktioner i særdeleshed, har der været en masse forskning for at løse manipulation og kontrol af adsorption af proteiner på TiO2. På grund af disse undersøgelser, nogle grundlæggende egenskaber af denne interaktion er blevet afsløret, såsom adsorption kinetik, overfladedækning, og biomolekyle kropsbygning, hvilket giver betydelig støtte til yderligere fremskridt i biogrænseflader5,13.

Men protein kompleksitet tilføjer betydelige begrænsninger på fuld bestemmelse og forståelse af et proteins molekylære niveau interaktion med uorganiske overflader. Antages det, at biomolekyler ne interagerer med de uorganiske overflader gennem begrænsede steder, er nogle proteiner med kendte strukturer og aminosyresekvenser blevet reduceret til deres komponenter-peptider og aminosyrer, som undersøges separat. Nogle af disse peptider har vist betydelig aktivitet, hvilket gør dem til et unikt emne for adsorptionsundersøgelser uden behov for tidligere proteinseparation25,26,27,28,29,30.

Kvantitativ karakterisering af peptidadsorption på TiO2 eller andre uorganiske overflader kan opnås ved hjælp af fysiske metoder, der er blevet tilpasset specielt til biomolekyler i de sidste par årtier. Disse metoder omfatter isothermal titrering kalorimetri (ITC), overflade plasmon resonans (SPR), kvarts krystal mikrobalance (QCM), total intern refleksion fluorescens (TIRF), og svækket total reflektansspektroskopi (ATR), som alle giver mulighed for påvisning af adsorptionsstyrken ved at give centrale termodynamiske data: Den bindende konstant Gibbs, fri energi, enthalpy, og entropi31.

Adsorptionen af biomolekyler til det uorganiske materiale kan opnås på to måder: 1) ITC samt udtømningsmetoden bruger partikler, der er spredt i en opløsning, der binder sig til faste makroskopiske overflader; 2) SPR, QCM, TIRF, og ATR bruge makroskopiske overflader modificeret med uorganisk materiale, såsom guld-belagt glas eller metal chips, kvarts krystaller, zink sulfid krystaller, og PMMA chips, hhv.

Isotermisk titreringskatotri (ITC) er en etiketfri fysisk metode, der måler den varme, der produceres eller forbruges ved titrering af opløsninger eller heterogene blandinger. Følsomme kalorimetriske celler registrerer varmeeffekter så små som 100 nanojoule, hvilket gør måling af adsorptionsvarme på nanopartikeloverflader mulig. Termisk adfærd af sorbat under kontinuerlig tilsætning- titrering, giver en fuld termodynamisk profil af samspillet afslører enthalpi, bindende konstant, og entropi ved en given temperatur32,33,34,35,36.

Spektroskopi (Surface plasmon resonance) er en overfladefølsom optisk teknik baseret på måling af mediets brydningsindeks i nærheden af den undersøgte overflade. Det er en real-time og label-fri metode til overvågning reversible adsorption og adsorberet lagtykkelse. Bindingskonstanten kan beregnes ud fra tilknytnings- og dissociationsraten. Adsorptionsforsøg udført ved forskellige temperaturer kan give oplysninger om aktiveringsenergiens temperaturafhængighed og sekventialt andre termodynamiske parametre37,38,39.

Kvarts krystal mikrobalance (QCM) metode måler ændringen i oscillerende frekvens af piezoelektriske krystaller under adsorption og desorption processer. Bindingskonstanten kan evalueres ud fra forholdet mellem adsorptions- og desorptionshastighedskonstanterne. QCM anvendes til relative massemålinger og behøver derfor ingen kalibrering25,27,40. QCM anvendes til adsorption fra både gas og væske. Den flydende teknik gør det muligt at bruge QCM som analyseværktøj til at beskrive aflejring på forskelligt modificerede overflader41.

Total intern refleksion fluorescens (TIRF) er en følsom optisk interfacial teknik baseret på måling af fluorescens af adsorbere fluorophores ophidset med internt reflekterede evanescent bølger. Metoden gør det muligt at påvise fluorescerende molekyler, der dækker overfladen med tykkelser i størrelsesordenen snesevis af nanometer, hvilket er grunden til det anvendes i studiet af makromolekylær adsorption på forskellige overflader42,43. In situ-overvågning af fluorescensdynamikken ved adsorption og desorption giver adsorptionskinetik og dermed termodynamiske data42,43.

Svækket total reflektans (ATR) blev brugt af Roddick-Lanzilotta til at etablere lysin adsorption saothermer baseret på lysin spektralbands på 1.600 og 1.525 cm-1. Det er første gang, at bindingskonstanten for et peptid på TiO2 bestemmes ved hjælp af en in situ infrarød metode44. Denne teknik var effektiv til at etablere adsorptionsisotermer for polylysinpeptider45 og sure aminosyrer46.

I modsætning til ovennævnte metoder, hvor adsorptionsparameteren måles in situ, måles mængden af adsorberede biomolekyler i et konventionelt eksperiment ved koncentrationsændringen, efter at overfladen har kontaktet opløsningen. Da koncentrationen af en sorbat henfalder i langt de fleste adsorptionstilfælde, kaldes denne metode udtømningsmetoden. Koncentrationsmålinger kræver en valideret analyseanalyse, som kan være baseret på en iboende analytisk egenskab af sorbaten eller baseret på mærkningen47,,48,49,,50 eller derivatisering51,52.

Adsorptionsforsøg ved hjælp af QCM, SPR, TIRF eller ATR kræver særlig overfladeforberedelse af de chips og sensorer, der anvendes til adsorptionsundersøgelser. Forberedte overflader bør anvendes én gang og kræver ændringer ved skift af adsorbat, på grund af den uundgåelige hydrering af oxidoverfladen eller mulig chemisorption af en sorbat. Kun én prøve ad gangen kan køres ved hjælp af ITC, QCM, SPR, TIRF eller ATR, mens man i udtyndingsmetoden kan køre snesevis af prøver, for hvilke mængden kun er begrænset af termostatkapaciteten og den sorbente tilgængelighed. Dette er især vigtigt ved behandling af store prøvepartier eller biblioteker af bioaktive molekyler. Det er vigtigt, at udtømningsmetoden ikke kræver dyrt udstyr, men udelukkende en termostat.

Men på trods af dens åbenlyse fordele kræver udtyndingsmetoden komplekse proceduremæssige træk, der kan synes besværlige. Denne artikel præsenterer, hvordan man udfører en omfattende fysisk-kemisk undersøgelse af dipeptid adsorption på TiO2 ved hjælp af udtynding metode og løser spørgsmål, som forskerne kan stå over for, når de udfører relevante eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Fremstilling af dipeptidsstamopløsninger og fortyndinger

  1. Fremstilling af 16 mM dipeptidopløsning
    1. 0,183 g af et dipeptid (Ile-His) (se Materialetabel) anbringesi et sterilt polymert reagensglas, fortyndes til 35 ml med dobbeltdestilleret vand (DDW) og opløses ved stuetemperatur (RT) under kraftig omrøring.
      BEMÆRK: Hvis dipeptidet ikke opløses i DDW under omrøring, skal dipeptidopløsningen anbringes i et ultralydsbad og sonikere i et par minutter.
    2. Der fremstilles en 50 mM opløsning af 2-(N-morpholino)ethanesulfonsyre (MES) buffer ved at opløse 0,533 g tør 2-(N-morpholino)ethanesulfonsyre i 50 ml DDW i det sterile reagensglas. Der fremstilles en 50 mM natriumhydroxidopløsning ved at opløse 200 mg natriumhydroxid i 100 ml DDW.
    3. PH-værdien af den præopløsede dipeptidopløsning til 7.4 justeres ved forsigtigt at tilsætte (mikrolitertitrering) 50 mM MES eller 50 mM natriumhydroxid til 16 mM dipeptidopløsningen under omrøring ved RT og overvågning af pH-værdien med en pH-måler. Efter justering af pH,hæld opløsningen i en målecylinder, reagensglasset skylles og måleglasset fyldes med DDW til 40 ml for at lave en endelig koncentration på 16 mM.
  2. Fremstilling af dipeptidfortyndinger fra 16 mM stamopløsning
    1. Peptidfortyndinger fremstilles med koncentrationer mellem 0,4 og 12,0 mM ved at fortynde 16 mM dipeptidopløsningen med DDW. For eksempel, for at forberede en 8 mM dipeptid opløsning, tilsættes 7 ml DDW til 10 ml af 16 mM dipeptid opløsning. Efter fortynding justeres pH-værdien til 7,4 ved tilsætning af 50 mM MES eller 50 mM NaOH dråbe for dråbe til dipeptidopløsningen (se trin 1.1.3). Efter justering af pH,hæld opløsningen i en målecylinder, reagensglasset skylles og fyldes op til 20 ml med DDW for at gøre dipeptidkoncentrationen 8 mM.
      BEMÆRK: Andre fortyndinger af 16 mM dipeptidstamstamopløsning med koncentrationer på 0,4, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0, 3,0, 4,0, 8,0 og 12,0 mM fremstilles i overensstemmelse med figur 1. Justeringen af hver dipeptidopløsning pH til 7.4 er beskrevet i trin 1.1.3.

2. Forberedelse af titania sol

  1. Forbered en 10 mM løsning af MES buffer ved at opløse 1.066 g MES i 500 ml DDW. pH-værdien justeres til 7,4 med tør natriumhydroxid ved omrøring og overvågning af pH-værdien med pH-måleren.
  2. Grind 200 mg nanokrystallinsk TiO2 i en mørtel i mindst 5 min (se Materialetabel).
  3. 40 mg af jorden titandioxid nanopartikler i et laboratorium kolbe. Kolben anbringes i sonikeringsbadet (se Materialebordet) ved hjælp af laboratoriestativet.
  4. Der tilsættes 20 ml 10 mM MES buffer i kolben med TiO2 og sonikere i et ultralydsbad (5 L, 40 kHz, 120 W) i 20 min.

3. Blanding og termohærdning

  1. Termostaten (se Materialetabel ) indstillestil de ønskede temperaturer (dvs. 0,00, 10.00, 20.00, 30.00 eller 40.00 °C).
  2. 1 ml af den sonikerede sol af TiO2 til de markerede adsorptionshætteglas. Anbring de markerede adsorptionshætteglas mod tilsvarende dipeptidfortynding i en interimistisk flotationsanordning fremstillet af ekstruderet polystyrenskum. Flotationsanordningen anbringes sammen med de afmærkede hætteglas og tilsvarende dipeptidfortyndinger i termostaten i mindst 5 min.
  3. Der tilsættes 1 ml af hver dipeptidfortynding til det tilsvarende mærkede adsorptionsglas, og sørg for, at alle blandingsopløsninger har samme temperatur. Rækken af opnåede adsorptionsprøver opbevares på termostaten klokken 0,00, 10.00, 20.00, 30.00 eller 40.00 °C i 24 timer for at opnå adsorptionsligevægten.
    BEMÆRK: Ryst forsigtigt alle prøver af opnåede dispersioner, før de lægges i termostaten.
  4. Bland af og til2 TiO 2-spredningen ved manuelt at ryste dem under termohærdende.

4. Filtrering af de termotalte prøver

  1. For at undgå temperaturinduceret reequilibration udtage en prøve ad gangen fra termostaten til filtrering.
  2. Der udtages en prøve af peptidopløsningen fra hvert glasglas med en sprøjte gennem en sprøjtenål. Fjern kanylen fra sprøjten og tag sprøjtefilteret på (se Materialebord) for at filtrere peptidopløsningen i glashætteglasset. Gentag filtreringen med de andre prøver.
  3. Analysér filtratet i overensstemmelse med afsnit 5.
    BEMÆRK: Prøverne må ikke centrifugeres, da det tager et par minutter og kan medføre en ændring i koncentrationsligevægten.

5. Afledningsisering og HPLC-analyse

  1. Lav en 50 ml opløsning af trifluoreddikesyre (TFA) i acetonitril. Der tilsættes 0,34 ml TFA i måleglasset, og opløsningens volumen justeres til 50 ml med acetonitril på RT.
    FORSIGTIG: Arbejd med TFA under en røghætte med udsugning, fordi trifluoreddikesyre er skadelig ved indånding, forårsager alvorlige forbrændinger af huden og er giftigt for vandorganismer selv ved lave koncentrationer53.
  2. Derivatiseringsopløsningen (dvs. Edman reagens54) fremstilles ved at anbringe 299 μL phenylisothiocyanat og 347 μL triethylamin i en gradueret cylinder og justere opløsningsvolumen til 50 ml med acetonitril på RT.
  3. Forud for hplc-analysen (high-performance liquid chromatography) skal prøverne afsendes med Edmans reagens i kromatografihætteglas. 400 μL af prøven blandes med 400 μL Edmans reagens. Prøven opvarmes ved 60 °C i 15 min. Efter opvarmning neutraliseres prøven med 225 μL TFA-opløsning og vente i et par minutter på at afkøle prøven til RT.
  4. Brug HPLC-analyse (se Materialetabel) til at bestemme koncentrationen af dipeptidopløsningen før og efter adsorption. Placer kromatografihætteglaserne med de analyserede opløsninger i HPLC-autosampleren, og begynd at analysere prøverne med de nødvendige betingelser, som er indstillet af softwaren (se Materialetabel).
    BEMÆRK: Den mobile fase består af 0,1% TFA i deioniseret vand og ren acetonitril, med acetonitrilgradienter fra 20-90% ved 286 nm i 13 min. Analysér hver prøve i tre eksemplar. Koncentrationen af dipeptidopløsning måles ved hjælp af den tidligere etablerede kalibreringskurve (figur 2). For kromatografispecifikationer se Shchelokov et al.55.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Adsorption af et dipeptid på nanokrystallinsk titandioxid blev undersøgt ved de biokompatible forhold i et temperaturområde på 0-40 °C. Eksperimentel dipeptidadsorption (A, mmol/g) på overfladen af en titandioxid blev vurderet som

Hvor C0 og Ce er dipeptidernes start- og ligevægtskoncentrationer i henholdsvis millimol V er mængden af en dipeptidopløsning i liter; og m er vægten af sorbent i gram.

Målingerne af dipeptidadsorptionen blev behandlet ved hjælp af Henry-modellen. Denne isotermismemodel antager adsorption ved relativt lave koncentrationer med sorbatmolekylerne isoleret fra hinanden på en sorbent overflade og er egnet til at beskrive forsøgsdataene (figur 3). Bemærk dog, at denne model kun kan anvendes i tilfælde af reversibel adsorption, som også bør bekræftes. IR-spektroskopi af det materiale, der skylles flere gange, er egnet til dette formål. De opnåede ligevægtspeptidmængder på TiO2 og opløsningen er relateret i overensstemmelse med den lineære ligning:

hvor KH er Henrys adsorptionskonstant.

Den ligevægtsbindende konstant KH blev opnået fra hældningen af afhængigheden af dipeptidadsorption (A) på dipeptidligevægtskoncentrationen (Ce). Standarden Gibbs gratis energi (ΔG, kJ / mol) for hver temperatur T blev bestemt gennem Van't Hoff ligning:

hvor R er den ideelle gaskonstant i J/mol*K, og T er temperaturen i adsorptionsprocessen i Kelvin.

Dipeptid Gibbs frie energier bestemt ved hver temperatur (Figur 4) afsløret enthalpi (ΔH) som en aflytning af den lineære regression med aksen. Regressionsvariablen, processens entropi (ΔS), stammer fra den grundlæggende ligning:

De beregnede værdier for ligevægtsbindingskonstanten (KH), standard Gibbs-energien (ΔG), enthalpi (ΔH) og entropi (ΔS) for Ile-His er vist i tabel 1.

Figure 1
Figur 1: Fortynding af 16 mM dipeptidstamstamopløsningen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Kalibreringskurve ved forskellige dipeptidkoncentrationer. Dipeptidkoncentrationerne var mellem 0,4-16,0 mM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Dipeptidadsorptionsisotermer beregnet af Henry-modellen for hver temperatur. Dipeptidadsorptionsisotermer ved henholdsvis (A) 0 °C (B) 10°C( C ) 20 °C (D) 30 °C oge)40 °C. De beregnede korrelationskoefficienter (R2) faldt i et 0,96−0,99-interval for alle opnåede Henry-modelisotermer. Fejllinjer repræsenterer konfidensintervallet på 95 % for hver prøvekoncentration målt i tre eksemplarer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Afhængighed af standarden Gibbs gratis energi af dipeptid adsorption på temperatur. Fejllinjer repræsenterer 95% konfidensinterval for Gibbs gratis energi som indirekte måling baseret på Henry Model. Klik her for at se en større version af dette tal.

T, K KH ΔG0, kJ/mol ΔH0, kJ/mol ΔS0, kJ/mol K
273.15 0,32 ± 0,01 2,6 ± 0,0 - 41 ± 9 - 0,16 ± 0,03
283.15 0,25 ± 0,01 3,2 ± 0,1
293.15 0,17 ± 0,06 4,3 ± 0,9
303.15 0,050 ± 0,002 7,6 ± 0,1
313.15 0,037 ± 0,002 8,3 ± 0,1

Tabel 1: Termodynamiske parametre for dipeptidadsorption.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Adsorption fra løsninger til isotermerkonstruktion kræver længere tid til ekvilibrering på grund af kinetiske restriktioner og sorbenter med et højt specifikt overfladeareal. Desuden bør ustabilitet af sol, nanopartikel aggregater, krystallinitet, nanopartikel størrelse sfordeling, pH af opløsningen, og konkurrence om adsorption overvejes, mens adsorbing aminosyrer. Men adsorption isotherm konstruktion ved hjælp af udtynding metode forbliver den mest tilgængelige metode, fordi det ikke kræver dyre opsætninger, og alligevel giver udtømmende fysisk kemi data for bogstaveligt talt hver opløselig sorbat.

Der skal skelnes mellem adsorptionstilstande (dvs. opløsningsdiperdiserede partikler eller på en fast overflade), når et krystallinsk materiale anvendes som sorbent. Man bør forvente en væsentlig forskel i fordelingen af krystallinske ansigter på makroskopisk flade overflader og på partikler. Resulterende termodynamiske parametre, der bestemmes ud fra adsorption af peptider på nanopartikler, svarer muligvis ikke til de termodynamiske parametre for peptidadsorption til makroskopisk flade overflader.

Den gennemsnitlige mængde peptider adsorberet på de uorganiske overflader er ekstremt lav. Ved stuetemperatur, er denne værdi omkring flere hundrede mikrogram per kvadratmeter28. Denne lille mængde adsorbat kræver nøjagtige målemetoder og faste stoffer med veludviklede overflader. Derfor bør små partikelstoffer med en stor specifik overflade (hundredvis af kvadratmeter) anvendes til adsorptionsforsøg43,56,57,58,59,60.

Peptider er, ligesom proteiner, ustabile, og bevarer deres funktionalitet på et snævert udvalg af betingelser. Adsorptionsforsøg blev udført på nanokrystallinsk titandioxid ved biokompatible temperaturer på 0 °C-40 °C (273,15 K-313,15 K), som svarer til en normal, fungerende, levende organisme. Adsorption ved højere eller lavere temperaturer er irrelevante og bør ikke tages i betragtning til eksperimentet.

Multifunktionelle biologisk aktive forbindelser udviser også høj følsomhed over for mediets pH, da det påvirker overfladeladningen og derfor Coulomb interaktioner mellem ladede funktionelle grupper61,62,63. Den sorbentladning af oxidmaterialer er også pH-afhængig på grund af aktiv protonudveksling på den hydrerede overflade64. For at etablere pH stabile betingelser for adsorption ligevægt brug af en buffer er påkrævet. I denne undersøgelse, MES buffer bruges til sin ikke-koordinerende ejendom65,så det ville ikke konkurrere med peptid for adsorption på metaloxid overflade, i modsætning til fosfat buffere66.

Denne seneste test af aminosyre adsorption viser, at den største bindende sted på nanopartikel er overfladen defekt55. Defektfordeling på overfladen er et af de mindst kontrollerbare træk ved nanokrystallinske substrater, og derfor bør man bruge sorbent fra samme parti for at opretholde konsistensen i adsorptionsundersøgelser.

QCM, plasmon resonans, og ITC er ægte metoder med subtil følsomhed, der i en kombination af spektroskopiske metoder afslører strukturelle særegenheder af adsorbat under samspil med overfladen. Men de ikke overvinde kinetiske restriktioner og stadig kræver lang tid at opnå adsorption ligevægt. Desuden kan der kun behandles én prøve ad gangen, hvilket gør batchstikprøveanalyse udfordrende. På den anden side er den præsenterede udtyndingsmetode enkel og begrænset kun til termostatkapaciteten, hvilket gør det muligt at behandle et stort antal prøver.

De termotalte prøver filtreres, så snart de fjernes fra termostaten for at undgå temperaturinduceret reequilibration. Selv om ækvilibrering ved en ny temperatur kan tage op til et par timer, bør det minimeres at holde adsorptionsprøverne ved en anden temperatur. Centrifugering af prøverne til supernatantseparation anbefales heller ikke, da det tager op til et par minutter og kan medføre en ændring i koncentrationsligevægten. Valget af filtermateriale afhænger af sorbatens natur og bør reducere eventuel filterbinding for maksimal genvinding. Det er bedst at følge leverandørinstruktioner og anbefalinger, når du vælger bestemte filtre.

Derudover skal man huske på, at koncentrationsændringer i adsorptionsundersøgelserne bør overvåges ved hjælp af valideret kvantificeringsmetode ved hjælp af massespektrometri, radiospektroskopi eller UV-synlig spektroskopi. Analysen er let, hvis adsorbat er spektroskopisk aktiv, ellers yderligere mærkning eller afledning af adsorbat er påkrævet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet økonomisk af den russiske fond for grundforskning (Grant No. 15-03-07834-a).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid TCI Chemicals 4432-31-9 MES, >98%
Acetonitrile Panreac AppliChem HPLC grade
Chromatography vials glass
Dipeptide Ile-His Bachem 4000894
Double-distilled water DDW was obtained on spot
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD" J.P. Selecta 3000865 5 L, 40 kHz, 120 Watts
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detector Shimadzu, LC-20 Prominence HPLC
Isopropanol Sigma-Aldrich (Merck) 67-63-0 99.70%
LabSolutions Lite Shimadzu 223-60410 Software for high-performance liquid chromatography system
Nanocrystalline TiO2 Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details.
Phenyl isothiocyanate Acros Organics 103-72-0 PITC, 98%
Reversed-phase Zorbax column ZORBAX LC 150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm
Syringe filter Vladfilter 25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate
Test sterile polymeric tube polypropylene
Thermostat TC-502 Brookfield Refrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization
Triethylamine Sigma-Aldrich (Merck) 121-44-8 TEA; 99%
Trifluoroacetic acid Panreac AppliChem 163317 TFA, 99%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garcia, A. J. Interfaces to Control Cell-Biomaterial Adhesive Interactions. Polymers for Regenerative Medicine. 203, Chapter 71 171-190 (2006).
  2. Mahmood, T. A., et al. Modulation of chondrocyte phenotype for tissue engineering by designing the biologic-polymer carrier interface. Biomacromolecules. 7, (11), 3012-3018 (2006).
  3. Gandavarapu, N. R., Mariner, P. D., Schwartz, M. P., Anseth, K. S. Extracellular matrix protein adsorption to phosphate-functionalized gels from serum promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 9, (1), 4525-4534 (2013).
  4. Horbett, T. Biological Activity of Adsorbed Proteins. Surfactant Science Series. 110, 393-413 (2010).
  5. Ratner, B. D., Hoffman, A. S., Schoen, F. J., Lemons, J. E. Biomaterials Science: An Introduction to Materials in Medicine. Elsevier Academic Press/Academic Press. San Diego. (2004).
  6. Jahangir, A. R., et al. Fluorinated surface-modifying macromolecules: Modulating adhesive protein and platelet interactions on a polyether-urethane. Journal of Biomedical Materials Research. 60, (1), 135-147 (2002).
  7. Shen, M., et al. PEO-like plasma polymerized tetraglyme surface interactions with leukocytes and proteins: In vitro and in vivo studies. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 13, (4), 367-390 (2002).
  8. Wisniewski, N., Moussy, F., Reichert, W. M. Characterization of implantable biosensor membrane biofouling. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry. 366, (6-7), 611-621 (2000).
  9. Geelhood, S. J., et al. Passivating Protein Coatings for Implantable Glucose Sensors: Evaluation of Protein Retention. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81, 251-260 (2007).
  10. Knowles, J. R. Enzyme catalysis: not different, just better. Nature. 350, (6314), 121-124 (1991).
  11. Blankschien, M. D., et al. Light-triggered biocatalysis using thermophilic enzyme - Gold nanoparticle complexes. ACS Nano. 7, (1), 654-663 (2013).
  12. Wu, H., et al. Catechol modification and covalent immobilization of catalase on titania submicrospheres. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 92, 44-50 (2013).
  13. Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Current Opinion in Structural Biology. 14, (1), 110-115 (2004).
  14. Hlady, V., Buijs, J. Protein adsorption on solid surfaces. Current Opinion in Biotechnology. 7, (1), 72-77 (1996).
  15. Kulkarni, M., et al. Titanium nanostructures for biomedical applications. Nanotechnology. 26, (6), 062002 (2015).
  16. Yin, F. Z., Wu, L., Gui Yang, H., Su, H. Y. Recent progress in biomedical applications of titanium dioxide. Physical Chemistry Chemical Physics. 15, (14), 4844-4858 (2013).
  17. Rezania, A., Johnson, R., Lefkow, A. R., Healy, K. E. Bioactivation of metal oxide surfaces. 1. Surface characterization and cell response. Langmuir. 15, (20), 6931-6939 (1999).
  18. Schenk, R. The Corrosion Properties of Titanium and Titanium Alloys. Titanium in Medicine. Brunette, D. M., et al. Springer-Verlag. Berlin, Germany. 145-170 (2001).
  19. Bozzini, B., et al. An electrochemical impedance investigation of the behaviour of anodically oxidised titanium in human plasma and cognate fluids, relevant to dental applications. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, (11), 3443-3453 (2008).
  20. Popa, M. V., et al. Long-term assessment of the implant titanium material - Artificial saliva interface. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, (1), 1-9 (2008).
  21. Kim, J. K., et al. Lysozyme-mediated biomineralization of titanium-tungsten oxide hybrid nanoparticles with high photocatalytic activity. Chemical Communications. 50, 12392-12395 (2014).
  22. Suriyaraj, S. P., Selvakumar, R. Room temperature biosynthesis of crystalline TiO2 nanoparticles using Bacillus licheniformis and studies on the effect of calcination on phase structure and optical properties. RSC Advances. 4, 39619-39624 (2014).
  23. Inoue, I., et al. Thermo-stable carbon nanotube-TiO2 nanocompsite as electron highways in dye-sensitized solar cell produced by bio-nano-process. Nanotechnology. 26, (28), 285601 (2015).
  24. Gardères, J., et al. Self-assembly and photocatalytic activity of branched silicatein/silintaphin filaments decorated with silicatein-synthesized TiO2 nanoparticles. Bioprocess and Biosystems Engineering. 39, (9), 1477-1486 (2016).
  25. Chen, H., Su, X., Neoh, K. G., Choe, W. S. QCM-D analysis of binding mechanism of phage particles displaying a constrained heptapeptide with specific affinity to SiO2 and TiO2. Analytical Chemistry. 78, (14), 4872-4879 (2006).
  26. Iucci, G., et al. Peptides adsorption on TiO2 and Au: Molecular organization investigated by NEXAFS, XPS and IR. Surface Science. 601, (18), 3843-3849 (2007).
  27. Gronewold, T. M. A., Baumgartner, A., Weckmann, A., Knekties, J., Egler, C. Selection process generating peptide aptamers and analysis of their binding to the TiO2 surface of a surface acoustic wave sensor. Acta Biomaterialia. 5, (2), 794-800 (2009).
  28. Gitelman, A., Rapaport, H. Bifunctional designed peptides induce mineralization and binding to TiO2. Langmuir. 30, (16), 4716-4724 (2014).
  29. Tada, S., Timucin, E., Kitajima, T., Sezerman, O. U., Ito, Y. Direct in vitro selection of titanium-binding epidermal growth factor. Biomaterials. 35, (11), 3497-3503 (2014).
  30. Micksch, T., Liebelt, N., Scharnweber, D., Schwenzer, B. Investigation of the peptide adsorption on ZrO2, TiZr, and TiO2 surfaces as a method for surface modification. ACS Applied Materials and Interfaces. 6, (10), 7408-7416 (2014).
  31. Limo, M. J., Perry, C. C., Thyparambil, A. A., Wei, Y., Latour, R. A. Experimental Characterization of Peptide-Surface Interactions. Bio-Inspired Nanotechnology: From Surface Analysis to Applications. 37-94 (2013).
  32. Draczkowski, P., Matosiuk, D., Jozwiak, K. Isothermal titration calorimetry in membrane protein research. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 87, 313-325 (2014).
  33. Omanovic-Miklicanin, E., Manfield, I., Wilkins, T. Application of isothermal titration calorimetry in evaluation of protein-nanoparticle interactions. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 127, 605-613 (2017).
  34. Jing, X., et al. Interaction of peptidomimetics with bilayer membranes: Biophysical characterization and cellular uptake. Langmuir. 28, (11), 5167-5175 (2012).
  35. Mizuguchi, C., et al. Effect of phosphatidylserine and cholesterol on membrane-mediated fibril formation by the N-terminal amyloidogenic fragment of apolipoprotein A-I. Scientific Reports. 8, (1), 5497 (2018).
  36. Bisker, G., et al. Insulin Detection Using a Corona Phase Molecular Recognition Site on Single-Walled Carbon Nanotubes. ACS Sensors. 3, (2), 367-377 (2018).
  37. Singh, N., Husson, S. M. Adsorption thermodynamics of short-chain peptides on charged and uncharged nanothin polymer films. Langmuir. 22, (20), 8443-8451 (2006).
  38. Seker, U. O. S., et al. Thermodynamics of engineered gold binding peptides: Establishing the structure-activity relationships. Biomacromolecules. 15, (7), 2369-2377 (2014).
  39. Beutner, R., Michael, J., Schwenzer, B., Scharnweber, D. Biological nano-functionalization of titanium-based biomaterial surfaces: A flexible toolbox. Journal of the Royal Society Interface. 7, (Suppl 1), S93-S105 (2010).
  40. Sultan, A. M., et al. Aqueous Peptide-TiO2 Interfaces: Isoenergetic Binding via Either Entropically or Enthalpically Driven Mechanisms. ACS Applied Materials and Interfaces. 8, (28), 18620-18630 (2016).
  41. Teichroeb, J. H., Forrest, J. A., Jones, L. W., Chan, J., Dalton, K. Quartz crystal microbalance study of protein adsorption kinetics on poly(2-hydroxyethyl methacrylate). Journal of Colloid and Interface Science. 325, (1), 157-164 (2008).
  42. Lok, B. K., Cheng, Y. L., Robertson, C. R. Protein adsorption on crosslinked polydimethylsiloxane using total internal reflection fluorescence. Journal of Colloid And Interface Science. 91, (1), 104-116 (1983).
  43. Nakanishi, K., Sakiyama, T., Imamura, K. On the Adsorption of Proteins on Solid Surfaces, a Common but Very Complicated Phenomenon. Journal of Bioscience and Bioengineering. 91, (3), 233-244 (2001).
  44. Roddick-Lanzilotta, A. D., Connor, P. A., McQuillan, A. J. An In Situ Infrared Spectroscopic Study of the Adsorption of Lysine to TiO2 from an Aqueous Solution. Langmuir. 14, 6479-6484 (1998).
  45. Roddick-Lanzilotta, A. D., McQuillan, A. J. An in situ infrared spectroscopic investigation of lysine peptide and polylysine adsorption to TiO2 from aqueous solutions. Journal of Colloid and Interface Science. 217, (1), 194-202 (1999).
  46. Roddick-Lanzilotta, A., McQuillan, A. An in situ infrared spectroscopic study of glutamic acid and of aspartic acid adsorbed on TiO2: implications for the biocompatibility of titanium. Journal of Colloid and Interface Science. 227, (1), 48-54 (2000).
  47. Chan, B. M. C., Brash, J. L. Adsorption of fibrinogen on glass: reversibility aspects. Journal of Colloid And Interface Science. 82, (1), 217-225 (1981).
  48. van Enckevort, H. J., Dass, D. V., Langdon, A. G. The adsorption of bovine serum albumin at the stainless-steel/aqueous solution interface. Journal of Colloid And Interface Science. 98, (1), 138-143 (1984).
  49. Arnebrant, T., Nylander, T. Sequential and competitive adsorption of β-lactoglobulin and κ-casein on metal surfaces. Journal of Colloid And Interface Science. 111, (2), 529-533 (1986).
  50. Van Dulm, P., Norde, W. The adsorption of human plasma albumin on solid surfaces, with special attention to the kinetic aspects. Journal of Colloid And Interface Science. 91, (1), 248-255 (1983).
  51. Gonçalves, T. Fluorescent labeling of biomolecules with organic probes. Chemical Reviews. 109, (1), 190-212 (2009).
  52. Roth, K. D. W., Huang, Z. H., Sadagopan, N., Watson, J. T. Charge derivatization of peptides for analysis by mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 17, (4), 255-274 (1998).
  53. AppliChem, P. Safety Data Sheet According to Regulation (EU) 830/2015 3317 Trifluoroacetic Acid. http://pub.panreac.com/msds/ing/3317.htm 112 (2018).
  54. Heinrikson, R. L., Meredith, S. C. Amino acid analysis by reverse-phase high-performance liquid chromatography: Precolumn derivatization with phenylisothiocyanate. Analytical Biochemistry. 136, (1), 65-74 (1984).
  55. Shchelokov, A., et al. Adsorption of Native Amino Acids on Nanocrystalline TiO2: Physical Chemistry, QSPR, and Theoretical Modeling. Langmuir. 35, (2), 538-550 (2019).
  56. Fair, B. D., Jamieson, A. M. Studies of Protein Adsorption on Polystyrene Latex Surfaces. Journal of Colloid and Interface Science. 77, (2), 525-534 (1980).
  57. Kim, J. C., Lund, D. B. Adsorption behavior of p-lactoglobulin onto stainless steel surfaces. Journal of Food Processing and Preservation. 21, (607), 303-317 (1997).
  58. Kondo, A., Oku, S., Murakami, F., Higashitani, K. Conformational changes in protein molecules upon adsorption on ultrafine particles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 1, 197-201 (1993).
  59. Itoh, H., Nagai, T., Saeki, T., Sakiyama, T., Nakanishi, K. Adsorption of Protein onto Stainless Steel Particle Surface and its Desorption Behavior. Developments in Food Engineering. 811-813 (1994).
  60. Itoh, H., Nagata, A., Toyomasu, T., Sakiyama, T., Nagai, T. Adsorption of β-Lactoglobulin onto the Surface of Stainless Steel Particles. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 59, (9), 1648-1651 (1995).
  61. Mudunkotuwa, I. A., Grassian, V. H. Histidine adsorption on TiO2 nanoparticles: An integrated spectroscopic, thermodynamic, and molecular-based approach toward understanding nano-bio interactions. Langmuir. 30, 8751-8760 (2014).
  62. Pászti, Z., Guczi, L. Amino acid adsorption on hydrophilic TiO2: A sum frequency generation vibrational spectroscopy study. Vibrational Spectroscopy. 50, (1), 48-56 (2009).
  63. Costa, D., Savio, L., Pradier, C. M. Adsorption of Amino Acids and Peptides on Metal and Oxide Surfaces in Water Environment: A Synthetic and Prospective Review. Journal of Physical Chemistry B. 120, (29), 7039-7052 (2016).
  64. Kosmulski, M. The significance of the difference in the point of zero charge between rutile and anatase. Advances in Colloid and Interface Science. 99, (3), 255-264 (2002).
  65. Kandegedara, A., Rorabacher, D. B. Noncomplexing tertiary amines as "better" buffers covering the range of pH 3-11. Temperature dependence of their acid dissociation constants. Analytical Chemistry. 71, (15), 3140-3144 (1999).
  66. Susumu, O., Teruaki, A., Koichi, T. The Adsorption of Basic a-Amino Acids in an Aqeous Solution by Titanium(IV) Oxide. Bulletin of the Chemical Society of Japan. 54, 1595-1599 (1981).
Undersøgelse af kort peptid adsorption på opløsning spredte uorganiske nanopartikler ved hjælp af udtynding metode
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Korina, E., Naifert, S., Morozov, R., Potemkin, V., Bol'shakov, O. Study of Short Peptide Adsorption on Solution Dispersed Inorganic Nanoparticles Using Depletion Method. J. Vis. Exp. (158), e60526, doi:10.3791/60526 (2020).More

Korina, E., Naifert, S., Morozov, R., Potemkin, V., Bol'shakov, O. Study of Short Peptide Adsorption on Solution Dispersed Inorganic Nanoparticles Using Depletion Method. J. Vis. Exp. (158), e60526, doi:10.3791/60526 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter