Summary
이 프로토콜의 목적은 생리적 및 병리학적 조건 모두에서 배아 제브라피시의 분절 심장 기능 평가를 위한 새로운 방법을 자세히 설명하는 것입니다.
Abstract
제브라피쉬는 심근병증과 재생을 위한 모델 유기체로 점점 더 많이 활용되고 있습니다. 심장 기능을 평가하는 현재의 방법은 세그먼트 역학을 안정적으로 감지하지 못하며 제브라피시에서는 쉽게 실현 가능하지 않습니다. 여기에서 우리는 4차원 (4D) 세그먼트 심장 기능의 정량적 평가를 위한 반자동, 오픈 소스 방법을 제시합니다: 심근 기계적 변형의 변위 분석 (DIAMOND). 형질전환 배아 제브라피쉬는 4D 심장 운동 동기화를 이용하여 광시트 형광 현미경 시스템을 사용하여 생체 내에서 영상을 생성했다. 획득한 3D 디지털 하트는 엔드 시스톨 및 엔드 디아스톨에서 재구성되었으며, 심실은 수동으로 이진 데이터 세트로 분할되었습니다. 그 후, 심장의 방향을 조정하고 진정한 짧은 축을 따라 이소열성 으로 재샘플링하고, 심실은 짧은 축을 따라 8 개의 부분 (I-VIII)으로 균등하게 분할되었다. 끝 수축기와 끝 확장기의 다른 리샘플링 평면과 행렬로 인해 리샘플링된 수축기 및 확장기 이미지 행렬 사이의 원래 공간 관계를 복원하기 위해 이미지 등록에 변환 행렬이 적용되었습니다. 이미지 등록 후, 각 세그먼트의 변위 벡터를 엔드 시스톨에서 엔드 디아스톨까지 3차원(3D)의 질량 중심의 변위를 기준으로 계산하였다. DIAMOND는 방실 운하에 인접한 기저 심근 세그먼트가 가장 높은 기계적 변형을 겪고 독소루비신에 의한 심장 손상에 가장 취약하다는 것을 보여줍니다. 전반적으로, DIAMOND는 생리적 및 병리학적 조건 모두에서 전통적인 배출 분획 (EF)을 넘어 제브라피시 배아의 분할 심장 역학에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.
Introduction
화학요법 유도된 심장 독성 및 계속되는 심부전은 화학요법 중단을 위한 주된 이유 의 한개입니다1. 따라서, 심장 기능 평가는 심장 독성의 식별에 중요한 역할을하고, 더 중요한 것은, 화학 요법 다음 초기 심장 부상의 예측에2. 그러나, 심장 기능 평가에 대한 현재의 접근법은 한계를 만난다. 좌심실 배출 분율(LVEF)과 같은 방법은 부상 후 전 세계적으로 종종 지연되는 심장역학만을제공합니다3,4. 조직 도플러 화상 진찰은 세그먼트 심근 변형 정보를 제공하지만 중요한 관찰자 및 관찰자 간 가변성으로 고통받고, 부분적으로 초음파 빔 각도 의존성 으로 인해5. 2차원(2D) 반점 추적은 이론적으로 각도 의존성을 제거하는 심초음파의 B 모드를 이용하지만, 그 정확도는 평면 외 모션6에의해 제한됩니다. 따라서, 세그먼트 심장 기능을 정량화하기위한 엄격한 접근은 연구 및 임상 설정 모두에서 부족하다.
이러한 맥락에서, 우리는 3D 공간에서 심근 질량 중심의 변위 벡터를 결정하기 위해 심근 기계적 변형 (DIAMOND)의 변위 분석을 명명 한 세그먼트 심장 기능 분석을위한 4D 정량화 방법을 개발했습니다. 제브라피쉬(Daniorerio)를동물 모델로 하여 심장 기능 및 독소루비신 유발 심장 독성의 생체내 평가를 위해 DIAMOND를 적용하였으며, 이들의 재생 심근 및 고도로 보존된 발달유전자7로인해 선택되었다. 우리는 더 나아가 분과 다이아몬드 변위와 글로벌 배출 분획(EF) 측정 및 독소루비신 처리 후 2D 균주를 비교했습니다. 다이아몬드 변위를 4D 광시트 형광 현미경 검사법(LSFM)과 통합하여 배아 제브라피시 하트의 렌더링을 획득한 DIAMOND는 방실 운하에 인접한 기저 심근 세그먼트가 가장 높은 기계적 변형을 겪고 급성 독소루비신 심장 손상에 가장 취약하다는 것을 보여준다8.
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Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 UCLA 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았으며, 실험은 UCLA 동물 연구국에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 사육 Tg (cmlc2:mCherry) 얼룩말 물고기와 배아의 수집
- 이전에 확립된 축산 및 사육 관행에 설명된 대로 주택, 사육 및 배아 수집 절차를 따르십시오. 자세한 내용은 메서슈미트 외9를참조하십시오.
- 수집된 배아를 0.003% 1-페닐-2-티오레아(PTU)로 치료하여 E3 배지 18시간 후 추론하여 LSFM 이미징을 위한 배아의 투명도를 유지한다.
2. 심장 손상을 유도하는 독소루비신 치료
- 3 일 후 풍부화 (dpf)에서 E3 어항 수질 배지에서 10 μM의 농도로 독소 루비신으로 배아를 치료하십시오. 4 dpf로 24 시간 처리 한 후, 독소 루비신 배지를 신선한 E3 배지로 대체하십시오.
주의: 독소루비신은 화학요법 약물입니다. 적절한 개인 보호 장비(PPE)가 필요하며 폐기물은 생물학적 위험 폐기물 용기에 폐기해야 합니다.
3. 노치 통로 변조
- 노치 통로 억제제 (2S)-N-[(3,5-디플루오로페닐)아세틸]-L-알라닐-2-페닐]글리신 1,1-디메틸레틸 에스테르(DAPT)를 E3 어류 물 배지에서 10 μM의 농도로 3-6 dpf로 처리합니다.
- 노치 다운스트림 이펙터 노치 세포내 도메인(NICD) 및 노이레굴린-1(Nrg-1) mRNA를 각각 1세포 단계 제브라피쉬 배아내로 10pg/nL및 5 pg/nL의 농도로주입한다.
참고 : 미세 분사는 주입 된 부피를 정확하게 제어하기 위해 에어 펌프의 지지로 현미경으로 수행됩니다. 세포로 mRNA 미세 주사는 기름지게 한 계란이 첫번째 세포 단계에 있을 때 행해지어집니다. mRNA의 준비 및 순서에 대한 자세한 내용은 첸 외8을참조하십시오. 주사 바늘의 미세 주입 및 준비에 대한 자세한 내용은 Rosen 외10을참조하십시오.
4. LSFM 이미징 및 포스트 이미징 동기화
- LSFM 이미징 기술 및 이미징 후 동기화 알고리즘의 경우 이전 간행물9,11의세부 정보를 참조하십시오.
참고 : 간단히, 우리의 시스템은 모든 형질 전환 제브라피시 라인을 이미지 조명 소스로 연속 파 레이저를 사용. 검출 모듈은 2개의 과학적인 보완 금속 산화물 반도체(sCMOS) 카메라와 듀얼 채널 이미징을 위한 두 세트의 필터로 구성됩니다. 검출 모듈은 조명 평면에 수직으로 설치됩니다. 각 LSFM 프레임은 20msec 노출 시간 내에 획득되는 반면, 단면의 분해력은 ~0.65 μm이고 연속 프레임 사이의 스텝 크기는 ~2 μm입니다. 589 nm 레이저는 mCherry 형광 신호를 자극하는 데 사용되었다.
5. 3D 수축기 및 확장기 심장의 재건
- 사후 동기화 알고리즘에 의해 생성된 폴더를 연 다음"출력"폴더를 엽니다. 하트의 중간 평면을 선택하고 전체 폴더를 ImageJ에 로드합니다. 첫 번째 확장기 및 수축기 단계를 찾아 프레임 번호를 기록합니다.
- "출력/상태별" 폴더를 열고 방금 기록한 프레임 번호와 동일한 숫자를 가진 폴더를 찾습니다. 폴더의 이미지를 3D TIFF(태그가 지정된 이미지 파일 형식) 파일로 변환하고 "diastole.tif" 및 "systole.tif"의 이름을 지정합니다.
6. 심실의 세분화
- 이미지 분석 소프트웨어를 엽니다(재료 표참조). 파일 | 클릭 데이터를 열고"diastole.tif" 및 "systole.tif"를 로드합니다. 이미징 설정에 따라 복셀 크기를 입력합니다.
참고: 사용되는 LSFM 시스템의 경우 일반적인 복셀 크기는 0.65 μm x 0.65 μm x 2 μm입니다. - "세분화"패널을 클릭하고 수동으로 심장의 심실 부분을 분할합니다. 특정 강도 이상의 모든 영역을 선택할 수 있는 기본 제공"임계값"도구는 이 프로세스를 용이하게 할 수 있습니다. 심실은 더 강한 형광을 가진 두꺼운 약실입니다.
참고 : 이것은 변위 분석에 영향을 미치기 때문에 분절 된 심실의 방실 운하와 유출 관을 제거해야합니다. - 세분화가 완료되면"프로젝트"패널을 클릭합니다. "디스톨"을 마우스 오른쪽 버튼으로클릭합니다. labels.tif" 및 "systole. 콘솔의 Labels.tif" 탭을 클릭하고"데이터 내보내기"를클릭하여 데이터를 3D TIFF 파일로 저장합니다.
7. 이미지 등록을 위한 직사각형 평행피페드 생성
- 프로그래밍 환경에서"prepImage_1"을실행합니다(재료 표참조). 폴더에 원본 및 분할된 TIFF 파일이 포함되도록 5줄의"prepImage_1.m" "를 열고 4번 줄의 "슬라이스"를 3D tif 파일의 슬라이스 수로 변경합니다.
- 코드를 실행한 후 5개의 새로운 3D TIFF 파일("test.tif", "diastole_200.tif", "systole_200.tif", "diaLabel.tif" 및 "sysLabel200.tif")과 두 개의 새 폴더("resample_dia"및 "resample_sys")를 생성합니다.
8. 짧은 축 평면을 따라 수축기 및 확장기 3D 하트 를 리샘플링합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어로 5개의 3D TIFF 파일을 모두 가져옵니다(재료 표참조).
참고: 복셀 크기는 변경되지 않습니다. - 멀티플라나 패널로 이동합니다. "diastole_200.tif"를 기본 데이터로 선택합니다. X축(XY 평면의 녹색 선)을 심실의 수직 긴 축과 정렬하고 Z축(YZ 평면의 빨간색 선)을 심실의 수평 긴 축과 정렬합니다.
참고: 수직 긴 축은 XY 평면에서 정점과 유출 지역을 연결하는 가장 긴 축을 찾아결정되며, 수평 긴 축은 YZ 평면에서 정점과 유출 관을 연결하는 가장 긴 축을 찾아 결정됩니다. 축의 끝에 커서를 배치하여 축을 회전합니다. - 비스듬한 YZ 평면(짧은 축 평면)에서 시계 반대 방향으로 세 개의 임의점을 선택하고 3D 위치 좌표를 기록합니다.
참고: 포인트가 시계 반대 방향으로 선택되었는지 확인합니다. - "systole_200.tif"에 대해 8.2 및 8.3 단계를 반복합니다.
- "프로젝트"패널을 클릭합니다. "diastole_200.tif"를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고"슬라이스"개체를 검색하여 "diastole_200.tif"에 대한"슬라이스"객체를 만듭니다. 왼쪽에서 방금 만든 슬라이스 오브젝트를 클릭하고 속성 패널에서 | 옵션,"평면 설정"및"평면 정의"에서세 점을 선택합니다. 7.3 단계에서 3점의 좌표를 입력합니다.
- "systole_200.tif"에 대해 8.5단계를 반복합니다.
참고: 생성된 슬라이스 개체에는"슬라이스 2"라는이름이 있어야 합니다. - "diastole_200.tif"를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고"변형 된 이미지 "를 다시 샘플링"을검색하고 객체를 만듭니다. 속성 패널에서"슬라이스""를"참조"로선택하고 적용을클릭합니다. 이렇게 하면"diastole_200.transformed"라는 개체가생성됩니다.
- 마우스 오른쪽 단추로 클릭"diastole_200.transformed" 및 검색 "Resample" 및 개체를 만듭니다. "복셀 크기 " 를"모드"로선택하고 속성 패널에서"복셀크기"를x = 1, y = 1 및 z = 1로 변경합니다.
- "적용"을클릭합니다. 이렇게 하면"diastole_200.resampled"라는 개체가생성됩니다. "diastole_200.resampled"를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 3D TIFF 파일로 저장합니다.
- "diaLabel.tif" 및 "test.tif"에 대해 동일한 단계를 반복합니다. "diaLabel.resampled" 및 "test.resampled"를 3D TIFF 파일로 저장합니다. "systole_200.tif", "sysLabel.tif" 및 "test.tif"에 대해"슬라이스 2" "참조로"를사용하고 "systole_200.resampled", "sysLable.resampled", "test2.resampled"를 3D TIFF 파일로 저장합니다.
참고: 이 단계에서 총 6개의 TIFF 파일이 저장되어 있는지 확인합니다.
9. 리샘플링 된 마음의 분열
- 8단계에서 다시 샘플링된 6개의 파일을 ImageJ로 가져옵니다. 방측 운하가 명확하게 시각화되는 "systole_200.resampled"의 조각을 선택합니다. 슬라이스 수를 기록합니다.
- "이미지사용 | 변환 | 방측 운하가 수직이 되도록 ImageJ의 "기능"을 회전시다. 모든 파일에 동일한 회전을 적용합니다. 모든 창을 닫고 모든 변경 내용을 저장합니다.
- "diastole_200.resampled", "diaLabel.resampled", "test.resampled"를 "resample_dia" 폴더로 이동하고 "systole_200.resampled", "sysLable.resampled", "test2.resampled"를 "resample_sys" 폴더로 이동합니다.
- "divider_2_8_pieces.m"을 엽니다. 5줄의"ImPath"및 395줄의ImPath" 을 이미지 디렉토리로 변경합니다. "systole_200.resampled"와 "diastole_200.resampled"에서 방측 운하가 명확하게 시각화되는 슬라이스 번호로 22 호와 줄 411의 변수"중간"변수를 변경합니다.
- 코드를 실행하고 프롬프트 창에서 심실의 중심에서 한 번 클릭하고 방실 운하의 중심에서 한 번 클릭합니다. 이 systole 및 확장기 이미지에 대 한 두 번 수행 해야 합니다.
10. 수축기 및 확장기 이미지 행렬의 등록
- "register_3"을 열고 4줄의"ImPath"를이미지 폴더 경로로 변경합니다. 시스템의 계산 성능에 따라 이 코드를 실행하는 데 5~20분이 걸릴 수 있습니다.
참고: 7단계에서 인위적으로 생성된 직사각형 평행피페페드는 3점과 3점으로 구독된 각도 사이의 거리를 유지하는 3D 강성 등록에 사용됩니다. 단막 디토스톨 직사각형 병렬 처리(빨간색)가 최종 식열 직사각형 병렬 처리(녹색)에 등록되면, 이어지는 불일치 3D 위치는 최종 디돌러 매트릭스에서 최종 시스톨 매트릭스로의 회전 및 변환으로 구성된 고유한 강성 변환 매트릭스의 유도를 허용합니다(그림1H). 이미지 처리 도구 상자를 사용하여 변환 후 매트릭스의 노이즈를 해제하기 위해 등록 및 정규화된 에너지 최소화를 수행합니다(재료 표참조). 자세한 수학적 설명은 첸 외8을참조하십시오.
11. 변위 벡터의 출력
- "displacement_4"를열고 4줄의ImPath" 를 이미지 폴더 경로로 변경합니다.
- "displacement_4"을실행하여 "벡터" 폴더에서 "vector8.txt" 파일을 생성합니다. "vector8.txt" 파일이 열리면 8 x 4 행렬이 됩니다. 행렬의 각 행에는 X 성분, Y 성분, Z 구성요소 및 심실의 특정 세그먼트의 변위 벡터의 SUM 크기인 4개의 숫자가 있습니다.
주: 변위 벡터는 3D 공간에서 각 세그먼트의 질량 중심의 변위를 계산하여 얻어진다. systole에서 디스톨까지의 세분화 데이터 세트에서 각
세그먼트(I-VI)의 3D 질량 중심(PS 및 PD)좌표(k가 각각 X, Y 또는 Z 좌표를 나타내는 위치)를계산합니다(그림 1J). 3D 공간에서 질량 중심을 다음과 같이 정의합니다.
여기서 Cx = X, Cy = Y 및 Cz = Z, Mi = 각 세그먼트의 질량 (I ≤ i ≤ VI), m = 각 세그먼트의 복셀 수, θ = 세그먼트 영역으로서의 밀도 함수는 1인 반면 나머지는 0입니다. X-, Y, 및 Z 축을 따라 하위 변위 벡터의 L2-규범과 합계 변위 벡터는 심장 주기 동안 계산됩니다. 행렬에는 총 8개의 행이 있습니다. 첫 번째 행과 여덟 번째 행은 방실 운하를 포함하고 따라서 우리의 분석에서 무시됩니다. 세그먼트 I에서 VI로의 세그먼트는 일곱 번째 행에 두 번째 행으로 표시됩니다.
세그먼트(I-VI)의 3D 질량 중심(PS 및 PD)좌표(k가 각각 X, Y 또는 Z 좌표를 나타내는 위치)를계산합니다(그림 1J). 3D 공간에서 질량 
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Representative Results
3D 분절 심장 기능을 평가하기 위해 DIAMOND가 개발된 프로세스는 그림 1에제시되어 있습니다. LSFM 이미지 획득 및 배아 제브라피시 심장의 3D로의재구성(그림 1A)에이어, 실제 단축 평면은 수직 및 수평 긴 축에 수직인 평면으로 결정하였으며, 둘 다 다중 평면 뷰어에서 결정된다(그림1B). 심장은 짧은 축 평면을 따라샘플링(도 1C)및 내측심실 공동의 중심을 내실 운하의 중심으로 연결하는 가상 분할 선(빨간색 점선)에 따라 균등한 각도로 구성된 8개의 동등한 세그먼트로 나누었다(그림1E). 식별된 세그먼트의 3D 묘사는 단면도(도 1F)와원시 데이터와 비교하여 도시된다(도2). 세그먼트 VII 및 VIII는 방실 운하를 포괄하고 따라서 다른 세그먼트에 비해 더 적은 심근을 포함하기 때문에 분석에서 제거되었습니다. 최종 수축기(HS)및 끝 확장기(HD)에대한 다른 리샘플링 평면은 원래공간 관계를 복원하기 위해 등록해야 하는 최종 수축기 및 끝 확장기 행렬에 대한 별개의 좌표계로 이어집니다(그림1G). 엔드 수축기 행렬의 좌표계가 일관성에 대한 참조로 선택되었습니다. 최종 확장기 행렬에서 최종 수축기 행렬로변환 행렬(Tm)을결정하기 위해 3D에서 비대칭이고 원래 이미지 행렬과 동일한 차원을 가지는 세 개의 평행피페드 행렬이 사실상 만들어졌습니다. 병렬 피한은 먼저 끝 -systole 행렬의 짧은 축 평면에서 두 번 샘플링 한 다음 끝 확장기 행렬의 짧은 축 평면에서 끝 실스톨 (녹색) 및 끝 디아스톨 (빨간색)에 대한 다른 변형 된 평행 피페드로 이어졌습니다(그림 1H).
녹색 및 적색 평행피페드를 강체 등록 알고리즘에 의해 함께 등록하고 Tm을 계산하고 좌표를 복원하기 위해 최종 디아톨 매트릭스에 적용하였다(도1I). 이 프로세스는 심장 주기 동안 심실의 임의의 세그먼트에서 질량 중심의 변위 벡터의 3D 공간에서 후속 추적을 허용합니다(그림 1J). 심실 세그먼트I-VI의 다이아몬드 변위는 심장 주기의 여러 시간 지점 동안 추적될 수있다(그림 1K),이는 정량 분석을 위해 종단-실로에서 말단 이스톨까지 의 두 개의 시점까지 단순화될 수 있다(그림1L). DIAMOND에서 생성된 세그먼트는 그림 2에서시각화할 수 있으며 각 색상은 하나의 심장 세그먼트를 나타냅니다.
다이아몬드를 통해, 우리는 제브라피시의 독소루비신 유발 심근 손상에 대한 심장 기능과 감수성의 세그먼트 이질성을 발견했습니다. 3-4 dpf에서 10 μM doxorubicin으로 24 시간 처리한 후(그림 3A)대조군과 화학 요법 처리 그룹 사이의 심실 세그먼트의 다이아몬드 변위를 비교했습니다(그림 3B)및 치료 후 48 시간(그림 3C). 모든 DIAMOND 수치는 짧은 축을 따라 리샘플링된 심실과 동일한 그래픽 패턴을 따릅니다(그림1E). 데이터는 변위 벡터의 L2-노름을 심장의 내부 둘레로 정규화하여 백분율로 표시되고 X(녹색), Y(파란색) 및 Z 구성요소(주황색)는 가중치 가중치 기여로 표시됩니다. 4 dpf에서, 대조물고기의 분절 변위 벡터의 평균 L2-규범은 정규화 후 6.6-11.3 μm, 또는 3.8-6.6%에서 구역 수색되었다. 우리의 결과는 통제 조건하에서, 기저 세그먼트 I 및 VI가 가장 큰 변위를 겪고 독소루비신 유도 된 심장 손상에 가장 취약한 것들임을 나타냅니다(그림 3B,29% 6.6-4.7 % 감소%, n = 10 대조군 및 n = 8 doxorubicin, p & lt; 0.01). 6 dpf에서, 대조물고기의 분절 변위 벡터의 평균 L2-규범은 정규화 후 6.8-14 μm, 또는 3.9-8%에서 원거리였다. 6 dpf에서, 기저 세그먼트 I 및 VI는 분할 재생을 제안, 제어 수준으로 다이아몬드 변위를 복구(그림 3C,n = 10 제어 및 n = 8 doxorubicin). 병행하여, 2D 기저 균주에서 -53 에서 -38%로 악화시키고, 독소루비신 처리 후 4 dpf에서 관찰되었고, 이어서 6 dpf에서 대조군 수준으로 복귀하고, 다이아몬드 변위 결과를 부식하였다(도3D, 3E). 6 dpf에서의 회수와 함께 4 dpf에서 의 독소루비신에 반응하여 글로벌 배출 분획의 병렬 감소도 관찰되었다(도3F, 3G).
다음으로 노치 억제제 DAPT를 이용한 독소루비신 처리 및 노치 통로 변조 시 다이아몬드를 도포하고 노치 다운스트림 이펙터 NICD 및 NRG1 mRNA를 이용한 구조(도4A). NICD 및 NRG1 mRNA 미세주사는 급성 화학요법 유도 손상 후 다이아몬드 변위 및 EF의 감소를 4 dpf(도4B, 4D)에서구출하였다. 독소루비신과 함께 노치 억제제 DAPT에 노출되면 기저 세그먼트 I 및 VI 이외에 다이아몬드 변위가 더욱 확산감소하였다(도4B). 더욱이, 화학유도된 상해 후 노치 통로의 억제는 6 dpf에서 기저 세그먼트 및 EF의 다이아몬드 변위의 회복을 더욱 방해한다. 억제는 노치 다운스트림 이펙터 NICD 및 NRG1(도 4C, 4E)에의해 구출되었다.
그림 1: 4D 다이아몬드 변위 개발. (A)Raw 이미지를 광시트 형광 현미경으로 촬영하였다. (B 및 C)재구성된 3D 하트는 실제 짧은 축 평면 뷰를 따라 샘플링되었습니다. (D)배아 제브라피쉬 하트의 개략적인 일러스트. (E 및 F)2D 및 3D 그림은 VII 및 VIII 세그먼트를 제외한 8개의 세그먼트로 심실의 분할이다. (G)리샘플링 후 엔드 시스톨 및 엔드 디아스톨의 다른 좌표계. (H)변환 행렬(Tm)의생성을 위해 직사각형 평행피페드 그룹이 생성되었습니다. (I)Tm을적용하여 종단 수축기 및 말단 확장기 좌표계를 등록했습니다. (J)최종 시스톨에서 끝 이스톨까지 의 세그먼트 질량 중심의 변위 벡터. (K)심실 세그먼트I-VI의 다이아몬드 변위는 심장 주기의 여러 시간 지점 동안 추적된다. (L)종단 실로에서 말단 이스톨까지 심실 세그먼트 I-VI의 다이아몬드 변위. 첸 등8에서이 그림은 임상 조사를 위한 미국 사회에서 허가와 함께 복제 (ASCI). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 3D로 원시 데이터와 비교하여 배아 제브라피시 심장의 다이아몬드 분할. 배아 제브라피시 심장은 다이아몬드 변위 계산을 위해 여기에 묘사된 6개의 세그먼트(부피)로 나뉘어졌다(왼쪽). DIAMOND에서 계산한 각 세그먼트의 변위 벡터는 세그먼트 심장 함수를 나타냅니다. 심방 및 유출 관은 세분화 중에 제거되었습니다. 배율 표시줄 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 다이아몬드는 심장 기능의 분절 이질성과 화학요법으로 인한 상해에 대한 감수성을 해명합니다. (A)독소루비신 치료의 실험 일정. (B 및 C)4 및 6 dpf에서 제어 및 독소루비신 처리 그룹 사이의 내부 심근 둘레에 정규화된 DIAMOND 변위 벡터의 세그먼트 비교(t 검정, **p< 0.01, n=8-10 그룹당). (D 및 E)다이아몬드 변위 벡터와 유사한 부상 및 재생 패턴을 묘사하는 심실 염기내의 균주의 평가(*p< 0.05, n=6-8 그룹당). (F 및 G)글로벌 심실 수준에서 분할 DIAMOND 변위와 유사한 패턴을 따르는 4 dpf에서 4 dpf에서 독소루비신에 반응하여 배출 분율이 감소합니다(t 테스트, **p< 0.01, 에러 바 SEM, n= 그룹당 6-10). 첸 등8에서이 그림은 ASCI의 허가와 함께 재현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 독소루비신에 의한 부상에 따른 노치 매개 심근 회복의 평가를 위한 다이아몬드 역학. (A)실험 일정. (B 및 C) NICD 및 NRG1 노치 다운스트림 이펙터는 4 dpf에서 세그먼트 I 및 VI에서 다이아몬드 변위의 감소를 구출하였다. 6 dpf에서, DAPT에 의한 노치 신호의 억제는 세그먼트 심장 기능의 복원을 손상시켰습니다 (ANOVA, **p < 0.01 Dox 대 대조군; †p < 0.05, ††p < 0.01, Dox + DAPT 대 대조군, n = 6-10 그룹당). (D 및 E)배출 분수는 전역 수준에서 다이아몬드 역학을 부식시다 (ANOVA, *p < 0.05, **p < 0.01, 오류 막대 SEM, n = 그룹당 5-11). 첸 등8에서이 그림은 ASCI의 허가와 함께 재현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
세그먼트 심근 기능의 정량화를 위한 엄격한 전략은 심근상해의무감각하고 지연된 표시기로 알려져 있는 전통적인 EF를 넘어 심장 역학을 평가하기 위하여 중요합니다1,4,12. 따라서, 초기 심근 변화의 마커에 대한 관심이 증가하고 있으며, 심실 기능 장애를 예측하는 초기 지표로서 심근 변형 매개 변수를 지원하는 문헌의증가체가 4,13. 좌심실(LV) 균주의 심초음파 측정은 심근 변형측정(13)의확립된 방법을 제공한다. 그러나, 조직 도플러 계 균주 영상은 각도 의존성 및 관찰자 내 및 관찰자 간가변성(14)으로인해 다수의 결점으로부터 고통받고 있다. 반점 추적 심초음파(STE)는 각도 독립적인 2D 및 3D 조직 변형을 해결할 수 있지만, 2D 반점 추적의 정확도는 스루 플레인 모션6에의해 영향을 받는 반면, 3D 반점 추적은 3D에서 양성 초음파 간섭 패턴(반점)을 해결하기 위해 우수한 공간 해상도와 프레임15사이의 반점 추적을 위한 높은 시간적 해상도를 필요로 합니다. 본 프로토콜에서, 우리는 제브라피시에서 4D 분절 심장 기능의 생체 내 정량화를 위한 새로운 심근 변형 파라미터로서 DIAMOND 변위를 설명한다. EF 및 2D 스트레인을 기준 표준으로 사용하는 것과 비교하여, DIAMOND는 스루 평면 모션의 영향을 받지 않고 추가적인 세그먼트 변형 정보를 제공합니다. 다이아몬드를 4D LSFM과 통합함으로써, 우리의 기술은 밀리미터 범위 해상도16을가진 가장 진보 된 3D STE 시스템에서도 현재 불가능한 폭 20-30 μm의 심장 세그먼트의 변위 벡터를 평가할 수 있습니다.
다이아몬드를 적용하려면 배아 제브라피시 심장의 해부학 적 구조를 포괄적으로 이해하는 것이 중요합니다. 이미지 세분화 동안, 사용자가 프로토콜에서 6 단계를 수행할 때 방실 운하와 유출 관을 올바르게 식별하고 심근의 나머지 부분에서 세분화하는 것이 필수적입니다. 또한, 심실의 수평 및 수직 긴 축은 8단계에서 이미지 리샘플링을 위한 진정한 단축 평면을 도출하기 위해 정확하게 결정되어야 한다.
DIAMOND를 적용하는 주요 속도 제한 요인은 심실의 수동 세분화이며, 이는 심장 주기 동안 여러 단계를 평가해야 할 때 시간이 많이 소요됩니다. 기계 학습 및 신경망의 발전과 함께 자동화 된 심장 세분화 방법17,18,19,20은 DIAMOND와 통합되어 전체 심장 주기에 걸쳐 세그먼트 심장 기능을 모니터링 할 수 있습니다. DIAMOND의 추가 응용분야는 또한 심장 손상 및 재생의 다스케일 평가를 위한 더 큰 동물 모델에 적합한 심초음파, 마이크로 CT, 또는 마이크로 MRI와의 통합을포함한다(21). 그러나, 상기 방법은 먼저 포유동물22,23에서비틀림을 포함하는 보다 복잡한 심장 변형으로 이어지는 심근 섬유의 존재에 적응을 요구할 것이다.
전반적으로, DIAMOND는 생리학적 및 병리학적 조건 하에서 배아 제브라피시의 세그먼트 심장 기능을 평가하는 새로운 방법을 제공하며, 연관된 경로의 생체 내 검사에서 높은 처리량을 위한 플랫폼으로 사용될 수 있다. 화학 요법 유도 심장 독성.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 존재하지 않는다고 선언했다.
Acknowledgments
본 작품은 미국 심장 협회 보조금 16SDG30910007 및 18CDA34110338, 그리고 건강의 국가 학회 보조금 HL083015, HL111437, HL118650 및 HL129727에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira6 | FEI | Image analyzing software | |
| DAPT | Millipore Sigma | D5942-5MG | |
| Doxorubicin hydrochloride | Millipore Sigma | D1515-10MG | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Millipore Sigma | E10521-10G | Tricaine |
| MATLAB | MathWorks | Programming environment | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MathWorks | Image processing toolbox |
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