Summary
Ziel dieses Protokolls ist es, eine neuartige Methode zur Beurteilung der segmentalen Herzfunktion bei embryonalen Zebrafischen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu beschreiben.
Abstract
Zebrafische werden zunehmend als Modellorganismus für Kardiomyopathien und Regeneration genutzt. Aktuelle Methoden zur Beurteilung der Herzfunktion erkennen die Segmentmechanik nicht zuverlässig und sind bei Zebrafischen nicht ohne weiteres durchführbar. Hier stellen wir eine halbautomatische Open-Source-Methode zur quantitativen Bewertung der vierdimensionalen (4D) segmentalen Herzfunktion vor: Verschiebungsanalyse der mechanischen Verformung myokardisch (DIAMOND). Transgene embryonale Zebrafische wurden in vivo mit einem Lichtbogenfluoreszenzmikroskopiesystem mit 4D-Herzbewegungssynchronisation abgebildet. Erworbene digitale 3D-Herzen wurden an End-Systole und End-Diastole rekonstruiert, und der Ventrikel wurde manuell in binäre Datensätze segmentiert. Dann wurde das Herz neu ausgerichtet und isotrop entlang der wahren kurzen Achse neu gesampelt, und der Ventrikel wurde gleichmäßig in acht Abschnitte (I–VIII) entlang der kurzen Achse unterteilt. Aufgrund der unterschiedlichen Resampling-Ebenen und Matrizen an End-Systole und End-Diastole wurde eine Transformationsmatrix für die Bildregistrierung angewendet, um die ursprüngliche räumliche Beziehung zwischen den resampled systolischen und diastolischen Bildmatrizen wiederherzustellen. Nach der Bildregistrierung wurde der Verschiebungsvektor jedes Segments von End-Systole zu End-Diastole basierend auf der Verschiebung von Massenzentroiden in drei Dimensionen (3D) berechnet. DIAMOND zeigt, dass basale Myokardsegmente neben dem atrioventrikulären Kanal die höchste mechanische Verformung erfahren und am anfälligsten für Doxorubicin-induzierte Herzverletzungen sind. Insgesamt liefert DIAMOND neue Einblicke in die segmentale Herzmechanik bei Zebrafischembryonen jenseits der traditionellen Auswurffraktion (EF) unter physiologischen und pathologischen Bedingungen.
Introduction
Chemotherapie-induzierte Herztoxizität und daraus resultierende Herzinsuffizienz sind einer der Hauptgründe für den Abbruch der Chemotherapie1. Daher spielt die kardiale funktionelle Beurteilung eine entscheidende Rolle bei der Identifizierung der Kardialtoxizität und, was noch wichtiger ist, bei der Vorhersage einer frühen Herzverletzung nach Chemotherapie2. Aktuelle Ansätze zur kardialen funktionellen Beurteilung stoßen jedoch auf Einschränkungen. Methoden wie die linksventrikuläre Auswurffraktion (LVEF) bieten nur globale und oft verzögerte Herzmechanik nach Verletzung3,4. Die Gewebe-Doppler-Bildgebung liefert segmentale Myokardverformungsinformationen, leidet jedoch unter einer signifikanten Intraobserver- und Interobserver-Variabilität, teilweise aufgrund der Ultraschallabstrahlwinkelabhängigkeit5. Das zweidimensionale (2D) Speckle-Tracking nutzt den B-Modus der Echokardiographie, der theoretisch die Winkelabhängigkeit eliminiert, aber seine Genauigkeit wird durch die Bewegung a-of-plane6begrenzt. Daher fehlt ein strenger Ansatz zur Quantifizierung der segmentalen Herzfunktion sowohl in der Forschung als auch in der klinischen Umgebung.
In diesem Zusammenhang entwickelten wir eine 4D-Quantifizierungsmethode zur Analyse der segmentalen Herzfunktion, die wir die Verschiebungsanalyse der myokardischen mechanischen Verformung (DIAMOND) nannten, um die Verschiebungsvektoren von Myokard-Massenzentroiden im 3D-Raum zu bestimmen. Wir haben DIAMOND für die in vivo Bewertung der Herzfunktion und Doxorubicin-induzierte Kartotoxizität mit Zebrafischen (Danio rerio) als Tiermodell eingesetzt, das aufgrund ihres regenerierenden Myokards und der hochkonservierten Entwicklungsgene ausgewählt wurde7. Wir verglichen die segmentale DIAMOND-Verschiebung weiter mit der Bestimmung der globalen Auswurffraktion (EF) und der 2D-Dehnung nach Doxorubicin-Behandlung. Durch die Integration der DIAMOND-Verschiebung mit der 4D-Lichtbogen-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM), die die Wiedergabe embryonaler Zebrafischherzen erworben hat, zeigt DIAMOND, dass die basalen Myokardsegmente neben dem atrioventrikulären Kanal die höchste mechanische Verformung erfahren und am anfälligsten für akute Doxorubicin-Herzverletzungen8sind.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom UCLA Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt, und die Versuche wurden in Übereinstimmung mit den vom UCLA Office of Animal Research genehmigten Protokollen durchgeführt.
1. Zucht Tg(cmlc2:mCherry) Zebrafische und Sammlung von Embryonen
- Befolgen Sie die Unterbringungs-, Zucht- und Embryonenentnahmeverfahren, wie sie in zuvor etablierten Haltungs- und Zuchtpraktiken beschrieben sind. Weitere Informationen finden Sie unter Messerschmidt et al.9.
- Behandeln Sie die gesammelten Embryonen mit 0,003% 1-Phenyl-2-Thiourea (PTU) in E3 medium 18 h Nachfertilisation, um die Transparenz der Embryonen für die LSFM-Bildgebung aufrechtzuerhalten.
2. Doxorubicin-Behandlung zur Induzieren von Herzerkrankungen
- Nach 3 Tagen nach der Fertilisation (dpf) behandeln Sie die Embryonen mit Doxorubicin in einer Konzentration von 10 m im E3-Fischwassermedium. Nach einer 24-stunden-Behandlung auf 4 dpf das Doxorubicin-Medium durch frisches E3-Medium ersetzen.
VORSICHT: Doxorubicin ist ein Chemotherapie-Medikament. Eine geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) ist erforderlich, und die Abfälle sollten in Bioabfallbehältern entsorgt werden.
3. Notch-Signalweg-Modulation
- Behandeln Sie Zebrafisch-Embryonen mit dem Notch-Pfad-Inhibitor (2S)-N-[(3,5-Difluorphenyl)acetyl]-L-alanyl-2-phenyl]glycine 1,1-dimethylethylester (DAPT) in einer Konzentration von 10 'M in E3-Fischwassermedium von 3–6 dpf.
- Mikroinjizieren Sie die Notch-Downstream-Effektoren Notch intrazelluläre Domäne (NICD) und Neuregulin-1 (Nrg-1) mRNA in Konzentrationen von 10 pg/nL bzw. 5 pg/nL in die 1-Zell-Stadium Zebrafischembryonen8,10.
HINWEIS: Die Mikroinjektion wird unter dem Mikroskop mit der Unterstützung einer Luftpumpe durchgeführt, um das injizierte Volumen genau zu steuern. Die mRNA-Mikroinjektion in die Zelle erfolgt, wenn sich die befruchtete Eizelle im ersten Zellstadium befindet. Einzelheiten zur Vorbereitung und Abfolge der mRNAs finden Sie unter Chen et al.8. Einzelheiten zur Mikroinjektion und Herstellung von Injektionsnadeln finden Sie unter Rosen et al.10.
4. LSFM-Bildgebung und Post-Imaging-Synchronisation
- Die LSFM-Bildgebungstechniken und den Synchronisationsalgorithmus nach der Abbildung finden Sie in den vorherigen Publikationen9,11.
HINWEIS: Kurz gesagt, unser System verwendet einen kontinuierlichen Wellenlaser als Beleuchtungsquelle, um alle transgenen Zebrafischlinien abzubilden. Das Detektionsmodul besteht aus zwei wissenschaftlich komplementären Metalloxid-Halbleiterkameras (sCMOS) und zwei Filtersätzen für die Dual-Channel-Bildgebung. Das Detektionsmodul ist senkrecht zur Beleuchtungsebene installiert. Jeder LSFM-Frame wird innerhalb einer Belichtungszeit von 20 merhält, während die Auflösungsleistung im Querschnitt 0,65 m beträgt und die Schrittgröße zwischen aufeinander folgenden Frames 2 m beträgt. Ein 589 nm Laser wurde verwendet, um mCherry fluoreszierende Signale zu erregen.
5. Rekonstruktion des 3D-Systolischen und diastolischen Herzens
- Öffnen Sie den Ordner, der vom Postsynchronisierungsalgorithmus erstellt wurde, und öffnen Sie dann den Ordner "Ausgabe". Wählen Sie die mittlere Ebene des Herzens aus, und laden Sie den gesamten Ordner in ImageJ. Suchen Sie die erste diastolische und systolische Phase und zeichnen Sie die Framenummer auf.
- Öffnen Sie den Ordner "Output/By State", und suchen Sie die Ordner, die die gleichen Zahlen wie die gerade aufgezeichneten Framenummern haben. Konvertieren Sie die Bilder im Ordner in 3D-TIFF-Dateien (markiertes Bilddateiformat) und nennen Sie sie "diastole.tif" und "systole.tif".
6. Segmentierung des Ventrikels
- Öffnen Sie die Bildanalysesoftware (siehe Tabelle der Materialien). Klicken Sie auf Datei | Öffnen Sie Datenund laden Sie "diastole.tif" und "systole.tif". Geben Sie die Voxelgröße entsprechend den Bildeinstellungen ein.
HINWEIS: Für das verwendete LSFM-System beträgt die typische Voxelgröße 0,65 x 0,65 x 2 m. - Klicken Sie auf das Bedienfeld "SEGMENTATION" und segmentieren Sie den Herzkammerteil manuell aus. Das integrierte"Schwellenwert"-Tool, das alle Regionen über einer bestimmten Intensität auswählen kann, kann diesen Prozess erleichtern. Der Ventrikel ist die dickere Kammer mit einer stärkeren Fluoreszenz.
HINWEIS: Achten Sie darauf, den atrioventrikulären Kanal und den Abflusstrakt in der segmentierten Herzkammer zu entfernen, da sich dies auf die Verschiebungsanalyse auswirkt. - Nachdem die Segmentierung abgeschlossen ist, klicken Sie auf das Bedienfeld"Projekt". Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf dieDiastole. Labels.tif" und "systole. Labels.tif" Tabs in der Konsole und klicken Sie auf "Exportieren von Daten als", um die Daten als 3D-TIFF-Dateien zu speichern.
7. Erstellung von rechteckigen Parallelepipeds zur Bildregistrierung
- Führen Sie "prepImage_1.m" in der Programmierumgebung aus (siehe Tabelle der Materialien). Öffnen Sie "prepImage_1.m", "ImPath" in Zeile 5, damit der Ordner die ursprünglichen und segmentierten TIFF-Dateien enthält, und ändern Sie "Slice" in Zeile 4 in die Anzahl der Slices der 3D-tif-Dateien.
- Nach dem Ausführen des Codes werden fünf neue 3D-TIFF-Dateien ("test.tif", "diastole_200.tif", "systole_200.tif", "diaLabel.tif" und "sysLabel200.tif") sowie zwei neue Ordner ("resample_dia" und "resample_sys") generiert.
8. Resample systolische und diastolische 3D-Herzen entlang der kurzen Achsenebene
- Importieren Sie alle fünf 3D-TIFF-Dateien in die Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Die Voxelgröße bleibt unverändert. - Wechseln Sie zum MULTIPLANAR-Bedienfeld. Wählen Sie "diastole_200.tif" als primäre Daten. Richten Sie die X-Achse (die grüne Linie in der XY-Ebene) an der vertikalen langen Achse des Ventrikels aus, und richten Sie die Z-Achse (die rote Linie in der YZ-Ebene) an der horizontalen langen Achse des Ventrikels aus.
HINWEIS: Die vertikale lange Achse wird bestimmt, indem die längste Achse ermittelt wird, die den Scheitelpunkt mit dem Abflusstrakt in der XY-Ebene verbindet, und die horizontale lange Achse wird bestimmt, indem die längste Achse ermittelt wird, die den Scheitelpunkt mit dem Abflusstrakt in der YZ-Ebene verbindet. Drehen Sie die Achse, indem Sie den Cursor am Ende der Achse platzieren. - Wählen Sie drei zufällige Punkte aus der schrägen YZ-Ebene (der kurzen Achsenebene) gegen den Uhrzeigersinn aus und zeichnen Sie deren 3D-Positionskoordinaten auf.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Punkte gegen den Uhrzeigersinn ausgewählt werden. - Wiederholen Sie die Schritte 8.2 und 8.3 für "systole_200.tif".
- Klicken Sie auf das Bedienfeld"PROJEKT". Erstellen Sie ein "Slice"-Objekt für "diastole_200.tif", indem Sie mit der rechten Maustaste auf "diastole_200.tif" klicken und nach dem Objekt"Slice"suchen. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das gerade erstellte Slice-Objekt und im Eigenschaftenbedienfeld | Optionen, überprüfen Sie "Plane festlegen" und wählen Sie drei Punkte in "Plane Definition". Geben Sie die Koordinaten der drei Punkte aus Schritt 7.3 ein.
- Wiederholen Sie Schritt 8.5 für "systole_200.tif".
HINWEIS: Das erstellte Slice-Objekt sollte den Namen "Slice 2" haben. - Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf "diastole_200.tif" und suchen Sie nach "Transformiertes Bild resample" und erstellen Sie das Objekt. Wählen Sie im Eigenschaftenbedienfeld "Slice" als "Referenz" aus und klicken Sie auf Übernehmen. Dadurch sollte ein Objekt mit dem Namen "diastole_200.transformed" generiert werden.
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf "diastole_200.transformed" und suchen Sie nach "Resample" und erstellen Sie das Objekt. Wählen Sie "Voxel Size" als "Modus" und ändern Sie "Voxel-Größe" in der Eigenschaften-Bedienfeld x = 1, y = 1 und z = 1.
- Klicken Sie auf "Bewerben". Dadurch sollte ein Objekt mit dem Namen "diastole_200.resampled" generiert werden. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf "diastole_200.resampled" und speichern Sie es als 3D-TIFF-Datei.
- Wiederholen Sie den gleichen Schritt für "diaLabel.tif" und "test.tif". Speichern Sie "diaLabel.resampled" und "test.resampled" als 3D-TIFF-Dateien. Wiederholen Sie den gleichen Schritt für "systole_200.tif", "sysLabel.tif" und "test.tif" mit"Slice 2" als Referenz, und speichern Sie "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" und "test2.resampled" als 3D-TIFF-Dateien.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass in diesem Schritt insgesamt sechs TIFF-Dateien gespeichert sind.
9. Teilung des resampelten Herzens
- Importieren Sie alle sechs neu gesampelten Dateien aus Schritt 8 in ImageJ. Wählen Sie ein Stück "systole_200.resampled", in dem der atrioventrikuläre Kanal klar visualisiert ist. Zeichnen Sie die Nummer des Slices auf.
- Verwenden Sie das "Bild | Transformieren | Drehen" Funktion von ImageJ, so dass der atrioventrikuläre Kanal vertikal ist. Wenden Sie dieselbe Drehung auf alle Dateien an. Schließen Sie alle Fenster, und speichern Sie alle Änderungen.
- Verschieben Sie "diastole_200.resampled", "diaLabel.resampled" und "test.resampled" in den Ordner "resample_dia", und verschieben Sie "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" und "test2.resampled" in den Ordner "resample_sys".
- Öffnen Sie "divider_2_8_pieces.m". Ändern Sie "ImPath" in Zeile 5 und "ImPath" in Zeile 395 in das Image-Verzeichnis. Ändern Sie die Variable "Mitte" in Zeile 22 und Zeile 411 in die Slice-Nummern, bei denen der atrioventrikuläre Kanal in "systole_200.resampled" und "diastole_200.resampled" klar visualisiert ist.
- Führen Sie den Code aus, und klicken Sie in den eingabeaufgeforderten Fenstern einmal in die Mitte des Ventrikels und einmal in die Mitte des atrioventrikulären Kanals. Dies muss zweimal sowohl für Systole- als auch für Diastole-Bilder getan werden.
10. Registrierung von systolischen und diastolischen Bildmatrizen
- Öffnen Sie "register_3.m" und ändern Sie "ImPath" in Zeile 4 in den Bildordnerpfad. Je nach Rechenleistung des Systems kann es 5–20 min dauern, diesen Code auszuführen.
HINWEIS: Die künstlich erzeugten rechteckigen Parallelepipeds in Schritt 7 werden für die starre 3D-Registrierung verwendet, die den Abstand zwischen zwei Punkten und Winkeln, die um drei Punkte abonniert sind, beibehält. Wenn die Enddiastole rechteckig parallelepiped (rot) in die End-Systole rechteckig parallelepiped (grün) registriert wird, erlaubt die folgende discrepant 3D-Position die Ableitung einer einzigartigen Matrix starrer Transformation, bestehend aus Rotation und Übersetzung von der End-Diastole-Matrix zur End-Systole-Matrix (Abbildung 1H). Wir führen die Registrierung und regularisierte Energieminimierung durch, um die Matrix nach der Transformation mit einer Bildverarbeitungs-Toolbox zu entschärfen (siehe Tabelle der Materialien). Eine detaillierte mathematische Beschreibung finden Sie unter Chen et al.8.
11. Ausgabe der Verschiebungsvektoren
- Öffnen Sie "displacement_4.m" und ändern Sie "ImPath" in Zeile 4 in den Bildordnerpfad.
- Führen Sie "displacement_4.m", die eine "vector8.txt"-Datei im Ordner "vectors" generiert. Sobald die Datei "vector8.txt" geöffnet ist, gibt es eine 8 x 4 Matrix. Jede Zeile der Matrix hat vier Zahlen, d. h. die Größen der X-Komponente, der Y-Komponente, der Z-Komponente und der SUMME-Größe des Verschiebungsvektors eines bestimmten Segments des Ventrikels.
HINWEIS: Der Verschiebungsvektor wird durch Berechnung der Verschiebung des Massenzentroids jedes Segments im 3D-Raum ermittelt. Wir berechnen die 3D-Massenzentroide (P
S und PD) Koordinaten (wobei k die X-, Y- oder Z-Koordinate angibt) jedes Segments (I-VI) im Segmentierungs-Dataset von Systole zu Diastole (Abbildung 1J). Wir definieren den Massenzentroid im 3D-Raum wie folgt:
wobei Cx = X, Cy = Y und Cz = Z, Mi = die Masse jedes Segments (I i -VI), m = die Anzahl der Voxel jedes Segments und die Dichtefunktion als segmentierter Bereich 1 ist, während der Rest 0 ist. Die L2-Norm der Teilverschiebungsvektoren entlang der X-, Y- und Z-Achse und der Summenverschiebungsvektor werden während des Herzzyklus berechnet. Die Matrix enthält insgesamt acht Zeilen. Die erste und die achte Reihe enthalten den atrioventrikulären Kanal und werden daher in unserer Analyse ignoriert. Die Segmente I bis VI werden durch die zweite Bis zur siebten Zeile dargestellt.
S und PD) Koordinaten (wobei k die X-, Y- oder Z-Koordinate angibt) jedes Segments (I-VI) im Segmentierungs-Dataset von Systole zu Diastole (Abbildung 1J). Wir definieren den 
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Representative Results
Das Verfahren, mit dem DIAMOND zur Beurteilung der segmentalen 3D-Herzfunktion entwickelt wurde, ist in Abbildung 1dargestellt. Nach der LSFM-Bildaufnahme und -rekonstruktion in 3D des embryonalen Zebrafischherzens (Abbildung 1A) wurde die wahre Kurzachsenebene als Ebene senkrecht zu den vertikalen und horizontalen langen Achsen bestimmt, die beide in einem Multiplane-Viewer bestimmt werden (Abbildung 1B). Das Herz wurde dann entlang der kurzen Achsenebene(Abbildung 1C) neu gesampelt und in acht gleiche Segmente unterteilt, die durch gleichmäßige Winkel nach einer virtuellen Divisionslinie (rote gepunktete Linie) gebildet werden, die das Zentrum der endokardialen ventrikulären Kavität mit der Mitte des atrioventrikulären Kanals verbindet (Abbildung 1E). Die 3D-Darstellungen der identifizierten Segmente sind in einer Querschnittsansicht (Abbildung 1F) und im Vergleich zu den Rohdaten dargestellt (Abbildung 2). Die Segmente VII und VIII wurden aus der Analyse entfernt, da sie den atrioventrikulären Kanal umfassen und daher im Vergleich zu anderen Segmenten weniger Myokard enthalten. Die verschiedenen Resampling-Ebenen für End-Systole (HS) und End-Diastole (HD) führen zu unterschiedlichen Koordinatensystemen für endsystolische und enddiastolische Matrixen, die registriert werden müssen, um ihre ursprüngliche räumliche Beziehung wiederherzustellen (Abbildung 1G). Das Koordinatensystem der endsystolischen Matrix wurde als Referenz für Konsistenz gewählt. Um die Transformationsmatrix (Tm) von der enddiastolischen Matrix bis zur endsystolischen Matrix zu bestimmen, wurde virtuell eine Matrix aus drei Parallelepipeds erstellt, die in 3D asymmetrisch ist und die gleiche Dimension wie die ursprüngliche Bildmatrix hat. Die Parallelepipeds wurden zweimal neu gesampelt, zuerst in der kurzen Achsenebene der End-Systole-Matrix und dann in der kurzen Achsenebene der Enddiastole-Matrix, was zu verschiedenen transformierten Parallelepipeds für Endsystole (grün) und Enddiastole (rot)(Abbildung 1H)führte.
Die grünen und roten Parallelepipeds wurden dann zusammen durch einen starren Körperregistrierungsalgorithmus registriert und Tm wurde berechnet und auf die Enddiastole-Matrix angewendet, um die Koordinaten wiederherzustellen (Abbildung 1I). Dieser Prozess ermöglicht eine nachträgliche Verfolgung der Verschiebungsvektoren von Massenzentroiden aus jedem Segment des Ventrikels während des Herzzyklus im 3D-Raum (Abbildung 1J). DIE DIAMOND Verschiebung der ventrikulären Segmente I–VI kann während mehrerer Zeitpunkte im Herzzyklus nachverfolgt werden (Abbildung 1K), was für die quantitative Analyse auf zwei Zeitpunkte von End-Systole bis Enddiastole vereinfacht werden kann (Abbildung 1L). Die von DIAMOND generierten Segmente können in Abbildung 2visualisiert werden, wobei jede Farbe ein Herzsegment darstellt.
Mit DIAMOND entdeckten wir die segmentale Heterogenität der Herzfunktion und die Anfälligkeit für Doxorubicin-induzierte Myokardverletzungen bei Zebrafischen. Nach einer 24-h-Behandlung mit 10 M Doxorubicin von 3–4 dpf (Abbildung 3A) verglichen wir die DIAMOND-Verschiebung ventrikulärer Segmente zwischen kontroll- und chemotherapiebehandelten Gruppen (Abbildung 3B) und 48 h nach der Behandlung (Abbildung 3C). Alle DIAMOND-Figuren folgen dem gleichen grafischen Muster wie die neu gesampelten Ventrikel entlang der kurzen Achse (Abbildung 1E). Die Daten werden als Prozentsätze dargestellt, indem die L2-Norm des Verschiebungsvektors auf den inneren Umfang des Herzens normalisiert wird, wobei die X-Komponenten (grün), Y (blau) und Z (orange) als ihre gewichteten Beiträge dargestellt werden. Bei 4 dpf lag die durchschnittliche L2-Norm der Segmentverschiebungsvektoren in Kontrollfischen zwischen 6,6 und 11,3 m oder 3,8–6,6 % nach der Normalisierung. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass unter Kontrollbedingungen die Basalsegmente I und VI die größten Verschiebungen durchlaufen und am anfälligsten für Doxorubicin-induzierte Herzverletzungen sind(Abbildung 3B, 29% Abnahme von 6,6–4,7%, n = 10 Kontrolle und n = 8 Doxorubicin, p < 0,01). Bei 6 dpf lag die durchschnittliche L2-Norm der Segmentverschiebungsvektoren in den Kontrollfischen zwischen 6,8–14 m oder 3,9–8% nach der Normalisierung. Bei 6 dpf erholten sich die Basalsegmente I und VI die DIAMOND-Verschiebung auf Kontrollniveaus, was auf eine segmentale Regeneration hindeutet(Abbildung 3C, n = 10 Steuerung und n = 8 Doxorubicin). Parallel dazu wurde eine Verschlechterung der 2D-Basalbelastung von -53 bis -38% bei 4 dpf nach Doxorubicin-Behandlung beobachtet, gefolgt von einer Rückkehr zu Kontrollniveaus bei 6 dpf, was die DIAMOND-Verschiebungsergebnisse bestätigte (Abbildung 3D, 3E). Eine parallele Abnahme der globalen Auswurffraktion als Reaktion auf Doxorubicin bei 4 dpf mit Einer Erholung bei 6 dpf wurde ebenfalls beobachtet (Abbildung 3F, 3G).
Als nächstes haben wir DIAMOND während der Doxorubicin-Behandlung und Notch-Signalwegmodulation mit dem Notch-Inhibitor DAPT und Rettung mit Notch-Downstream-Effektoren NICD und NRG1 mRNA angewendet (Abbildung 4A). NICD und NRG1 mRNA Mikroinjektion rettete die Abnahme der DIAMOND-Verschiebung und EF nach akuter Chemotherapie-induzierte Verletzung bei 4 dpf (Abbildung 4B, 4D). Die Exposition gegenüber dem Kerbinhibitor DAPT zusammen mit Doxorubicin führte zusätzlich zu den Basalsegmenten I und VI zu einer diffuseren Abnahme der DIAMOND-Verschiebung (Abbildung 4B). Darüber hinaus behinderte die Hemmung des Kerbewegs nach chemoinduzierten Verletzungen die Erholung der DIAMOND-Verschiebung der Basalsegmente und EF bei 6 dpf. Die Hemmung wurde durch die Kerb-Downstream-Effektoren NICD und NRG1 (Abbildung 4C, 4E) gerettet.
Abbildung 1: 4D DIAMOND Verschiebungsentwicklung. (A) Rohbilder wurden durch Leuchtstoffmikroskopie erfasst. (B und C) Rekonstruiertes 3D-Herz wurde entlang der wahren Kurzenachsenebenenansicht neu gesampelt. (D) Schematische Darstellung des embryonalen Zebrafischherzens. (E und F) 2D- und 3D-Abbildungen der Aufteilung des Ventrikels in acht Segmente ohne die Segmente VII und VIII. (G) Die verschiedenen Koordinatensysteme von End-Systole und Enddiastole nach Resampling. (H) Für die Erzeugung einer Transformationsmatrix (Tm) wurde eine Gruppe rechteckiger Parallelepipeds erstellt. (I) Registrierte endsystolische und enddiastolische Koordinatensysteme durch Anwendung von Tm. (J) Verschiebungsvektor des segmentalen Massenzentroids von End-Systole zu Enddiastole. (K) DIAMOND Verschiebung der ventrikulären Segmente I-VI, die während mehrerer Zeitpunkte im Herzzyklus verfolgt werden. (L) DIAMOND Verschiebung der ventrikulären Segmente I–VI von End-Systole zu Enddiastole. Diese Figur von Chen et al.8 wird mit Genehmigung der American Society for Clinical Investigation (ASCI) reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: DIAMOND-Segmentierung des embryonalen Zebrafischherzens im Vergleich zu Rohdaten in 3D. Das embryonale Zebrafischherz wurde hier in sechs Segmente (Volumen) unterteilt, die hier in verschiedenen Farben für die Berechnung von DIAMOND-Verschiebungen dargestellt werden (links). Der von DIAMOND berechnete Verschiebungsvektor jedes Segments stellt seine segmentale Herzfunktion dar. Der Atrium und der Abflusstrakt wurden während der Segmentierung entfernt. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: DIAMOND entwirrt die segmentale Heterogenität der Herzfunktion und die Anfälligkeit für chemotherapieinduzierte Verletzungen. (A) Versuchsplan der Doxorubicin-Behandlung. (B und C) Segmentaler Vergleich von DIAMOND-Verschiebungsvektoren normalisiert sich auf den inneren Myokardumfang zwischen Kontroll- und Doxorubicin-behandelten Gruppen bei 4 und 6 dpf (t-Tests, **p < 0,01, n = 8–10 pro Gruppe). (D und E) Bewertung der Dehnung in der ventrikulären Basis, die ein ähnliches Verletzungs- und Regenerationsmuster wie die DIAMOND-Verschiebungsvektoren darstellt (*p < 0,05, n = 6–8 pro Gruppe). (F und G) Abnahme der Auswurffraktion als Reaktion auf Doxorubicin bei 4 dpf mit Erholung bei 6 dpf, nach einem Muster ähnlich segmentalen DIAMOND-Verschiebungen auf globaler ventrikulärer Ebene (t-Tests, **p < 0,01, Fehlerbalken SEM, n = 6–10 pro Gruppe). Diese Figur von Chen et al.8 wird mit Genehmigung des ASCI reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: DIAMOND-Mechanik zur Beurteilung der Notch-vermittelten Myokard-Rückgewinnung nach Doxorubicin-induzierten Verletzungen. (A) Versuchsplan. (B und C) NICD und NRG1 Notch downstream effectors retteten die Verringerung der DIAMOND-Verschiebung in den Segmenten I und VI bei 4 dpf. Bei 6 dpf beeinträchtigte die Hemmung der Notch-Signalisierung durch DAPT die Wiederherstellung der segmentalen Herzfunktion (ANOVA, **p < 0,01 Dox vs. Steuerung;p < 0,05,p < 0,01, Dox + DAPT vs. Steuerung, n = 6–10 pro Gruppe). (D und E) Auswurffraktion bestätigt DIE DIAMOND-Mechanik auf globaler Ebene (ANOVA, *p < 0,05, **p < 0,01, Fehlerbalken SEM, n = 5–11 pro Gruppe). Diese Figur von Chen et al.8 wird mit Genehmigung des ASCI reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Eine strenge Strategie zur Quantifizierung der segmentalen Myokardfunktion ist entscheidend, um die Herzmechanik über die traditionelle EF hinaus zu bewerten, bekannt als ein unsensibler und verzögerter Indikator für Myokardverletzungen1,4,12. Daher hat es ein wachsendes Interesse an Markern früher Myokardveränderungen gegeben, und ein wachsender Körper der Literatur unterstützt myokardische Verformungsparameter als Frühindikator zur Vorhersage ventrikulärer Dysfunktion4,13. Die echokardiographische Messung der linksventrikulären (LV) Dehnung bietet eine etablierte Methode der Myokardverformungsmessung13. Allerdings leidet die Gewebe-Doppler-basierte Dehnungsbildgebung unter einer Reihe von Mängeln aufgrund von Winkelabhängigkeit und Intraobserver- und Interobservervariabilität14. Speckle Tracking Echokardiographie (STE) kann winkelunabhängige 2D- und 3D-Gewebeverformung auflösen, aber die Genauigkeit der 2D-Speckle-Tracking wird durch Durch-Ebenen-Bewegung6beeinflusst, während 3D-Speckle-Tracking erfordert überlegene räumliche Auflösung, um die positiven Ultraschall-Interferenzmuster (Speckles) in 3D und hohe zeitliche Auflösung zu lösen, um die Flecken zwischen Frames15zu verfolgen. Im vorliegenden Protokoll beschreiben wir DIAMOND-Verschiebung als einen neuartigen myokarden Verformungsparameter zur In-vivo-Quantifizierung der 4D-Segmentherzfunktion bei Zebrafischen. Im Vergleich zu EF- und 2D-Dehnungals Referenzstandards liefert DIAMOND zusätzliche segmentale Verformungsinformationen, ohne durch Durchgangsbewegungen beeinflusst zu werden. Durch die Integration von DIAMOND mit 4D LSFM kann unsere Technik den Verschiebungsvektor eines Herzsegments von 20–30 m Breite bewerten, was selbst für das fortschrittlichste 3D-STE-System mit Millimeter-Auflösung16derzeit nicht möglich ist.
Um DIAMOND anzuwenden, ist es wichtig, ein umfassendes Verständnis der anatomischen Struktur des embryonalen Zebrafischherzens zu haben. Bei der Bildsegmentierung ist es wichtig, dass der atrioventrikuläre Kanal und der Abflusstrakt korrekt identifiziert und vom Rest des Myokards segmentiert werden, wenn der Benutzer Schritt 6 im Protokoll durchführt. Darüber hinaus müssen die horizontalen und die vertikalen langen Achsen des Ventrikels genau bestimmt werden, um die wahre Kurzachsenebene für das Bildresampling in Schritt 8 abzuleiten.
Der wichtigste Ratenbegrenzungsfaktor bei der Anwendung von DIAMOND ist die manuelle Segmentierung des Ventrikels, die zeitaufwändig wird, wenn mehrere Phasen während des Herzzyklus bewertet werden müssen. Mit der Weiterentwicklung von maschinellem Lernen und neuronalen Netzwerken konnte eine automatisierte Kardialsegmentierungsmethode17,18,19,20 in DIAMOND integriert werden, um die segmentale Herzfunktion über den gesamten Herzzyklus zu überwachen. Weitere Anwendungen von DIAMOND sind auch die Integration mit Echokardiographie, Mikro-CT oder Mikro-MRT, geeignet in größeren Tiermodellen für die multiskale Beurteilung von Herzverletzungen und Regeneration21. Allerdings erfordert die Methode zunächst anpassungsbedürftig auf das Vorhandensein von Myokardfasern, was zu komplexeren Herzverformungen einschließlich Torsion bei Säugetierenführt 22,23.
Insgesamt bietet DIAMOND eine neuartige Methode zur Bewertung der segmentalen Herzfunktion bei embryonalen Zebrafischen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen und kann als Plattform für das Hochdurchsatz-In-vivo-Screening von Wegen im Zusammenhang mit Chemotherapie-induzierte Kartotoxizität.
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Disclosures
Die Autoren haben erklärt, dass es keinen Interessenkonflikt gibt.
Acknowledgments
Die aktuelle Arbeit wurde von den Zuschüssen der American Heart Association 16SDG30910007 und 18CDA34110338 und von den National Institutes of Health Grants HL083015, HL111437, HL118650 und HL129727 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira6 | FEI | Image analyzing software | |
| DAPT | Millipore Sigma | D5942-5MG | |
| Doxorubicin hydrochloride | Millipore Sigma | D1515-10MG | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Millipore Sigma | E10521-10G | Tricaine |
| MATLAB | MathWorks | Programming environment | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MathWorks | Image processing toolbox |
References
- Ewer, M. S., Ewer, S. M.
- Thavendiranathan, P., Wintersperger Bernd, J., Scott, F. D., Thomas D, M. H. Cardiac MRI in the Assessment of Cardiac Injury and Toxicity From Cancer Chemotherapy. Circulation: Cardiovascular Imaging. 6 (6), 1080-1091 (2013).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Thavendiranathan, P., et al. Use of Myocardial Strain Imaging by Echocardiography for the Early Detection of Cardiotoxicity in Patients During and After Cancer Chemotherapy. A Systematic Review. 63 (25), Part A 2751-2768 (2014).
- Collier, P., Phelan, D., Klein, A. A Test in Context: Myocardial Strain Measured by Speckle-Tracking Echocardiography. Journal of the American College of Cardiology. 69 (8), 1043-1056 (2017).
- Hanekom, L., Cho, G. Y., Leano, R., Jeffriess, L., Marwick, T. H. Comparison of two-dimensional speckle and tissue Doppler strain measurement during dobutamine stress echocardiography: an angiographic correlation. European Heart Journal. 28 (14), 1765-1772 (2007).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Chen, J., et al. Displacement analysis of myocardial mechanical deformation (DIAMOND) reveals segmental susceptibility to doxorubicin-induced injury and regeneration. JCI Insight. 4 (8), e125362 (2019).
- Messerschmidt, V., et al. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Journal of Visualized Experiments. (138), e57763 (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Lenneman, C. G., Sawyer, D. B. Cardio-Oncology: An Update on Cardiotoxicity of Cancer-Related Treatment. Circulation Research. 118 (6), 1008-1020 (2016).
- Geyer, H., et al. Assessment of Myocardial Mechanics Using Speckle Tracking Echocardiography: Fundamentals and Clinical Applications. Journal of the American Society of Echocardiography. 23 (4), 351-369 (2010).
- Castro, P. L., Greenberg, N. L., Drinko, J., Garcia, M. J., Thomas, J. D. Potential pitfalls of strain rate imaging: angle dependency. Biomedical Sciences Instrumentation. 36, 197-202 (2000).
- Seo, Y., Ishizu, T., Aonuma, K. Current Status of 3Dimensional Speckle Tracking Echocardiography: A Review from Our Experiences. Journal of Cardiovascular Ultrasound. 22 (2), 49-57 (2014).
- Amzulescu, M. S., et al. Improvements of Myocardial Deformation Assessment by Three-Dimensional Speckle-Tracking versus Two-Dimensional Speckle-Tracking Revealed by Cardiac Magnetic Resonance Tagging. Journal of the American Society of Echocardiography. 31 (9), 1021-1033 (2018).
- Wolterink, J. M., Leiner, T., Viergever, M. A., Išgum, I. Reconstruction, Segmentation, and Analysis of Medical Images. Zuluaga, M. A., et al. , Springer International Publishing. 95-102 (2016).
- Avendi, M. R., Kheradvar, A., Jafarkhani, H. A combined deep-learning and deformable-model approach to fully automatic segmentation of the left ventricle in cardiac MRI. Medical Image Analysis. 30, 108-119 (2016).
- Packard, R. R. S., et al. Automated Segmentation of Light-Sheet Fluorescent Imaging to Characterize Experimental Doxorubicin-Induced Cardiac Injury and Repair. Scientific Reports. 7 (1), 8603 (2017).
- Jay Kuo, C. C., Chen, Y.
- Natarajan, N., et al. Complement Receptor C5aR1 Plays an Evolutionarily Conserved Role in Successful Cardiac Regeneration. Circulation. 137 (20), 2152-2165 (2018).
- Zhukov, L., Barr, A. H. IEEE Visualization VIS 2003. , 597-602 (2003).
- Nielles-Vallespin, S., et al. In vivo diffusion tensor MRI of the human heart: Reproducibility of breath-hold and navigator-based approaches. Magnetic Resonance in Medicine. 70 (2), 454-465 (2013).
