Summary
Bu protokolün amacı, embriyonik zebrabalıklarında segmental kardiyak fonksiyonun hem fizyolojik hem de patolojik koşullarda değerlendirilmesi için yeni bir yöntemin ayrıntılarını vermektir.
Abstract
Zebra balıkları giderek kardiyomiyopatiler ve rejenerasyon için bir model organizma olarak kullanılmaktadır. Kardiyak fonksiyonu değerlendiren mevcut yöntemler segmental mekaniği güvenilir bir şekilde saptayamazlar ve zebra balıklarında kolayca mümkün değildir. Burada dört boyutlu (4D) segmental kardiyak fonksiyonun kantitatif değerlendirilmesi için yarı otomatik, açık kaynak yöntemi salıyoruz: miyokardiyal mekanik deformasyonun yer değiştirme analizi (DIAMOND). Transgenik embriyonik zebra balıkları 4D kardiyak hareket senkronizasyonu ile hafif yapraklı floresan mikroskopi sistemi kullanılarak in vivo olarak görüntülendi. Elde edilen 3D dijital kalpler end-systole ve end-diastole yeniden inşa edildi ve ventrikül el ile ikili veri kümeleri halinde segmente edildi. Daha sonra, kalp yeniden yönlendirildi ve izotropik gerçek kısa eksen boyunca yeniden örneklendi ve ventrikül kısa eksen boyunca sekiz bölüme (I-VIII) eşit olarak ayrıldı. End-systole ve end-diastole farklı resampling düzlemleri ve matrisler nedeniyle, yeniden örneklenmiş sistolik ve diyastolik görüntü matrisler arasındaki orijinal mekansal ilişkiyi geri yüklemek için görüntü kaydı için bir dönüşüm matris uygulanmıştır. Görüntü kaydından sonra, her segmentin yer değiştirme vektörü uç-systole'den son diyastole'e kütle sentroidlerinin üç boyutlu (3D) yer değiştirmesine göre hesaplanmıştır. DIAMOND, atriyoventriküler kanala bitişik bazal miyokardiyal segmentlerin en yüksek mekanik deformasyona tabi olduğunu ve doksorubisin indüklenen kardiyak yaralanmalara en yatkın olduğunu göstermektedir. Genel olarak DIAMOND, hem fizyolojik hem de patolojik koşullar altında geleneksel ejeksiyon fraksiyonu (EF) ötesinde zebra balığı embriyolarında segmental kardiyak mekaniği ne yeni bilgiler sağlar.
Introduction
Kemoterapiye bağlı kardiyak toksisite ve ardından gelen kalp yetmezliği kemoterapi kesilmesinin başlıca nedenlerinden biridir1. Bu nedenle kardiyak fonksiyonel değerlendirme, kardiyak toksisitenin belirlenmesinde ve daha da önemlisi kemoterapi sonrası erken kardiyak yaralanmanın tahmininde önemli bir rol oynamaktadır2. Ancak kardiyak fonksiyonel değerlendirme için güncel yaklaşımlar sınırlamalarla karşılaşın. Sol ventrikül ejeksiyon fraksiyonu (LVEF) gibi yöntemler sadece küresel ve genellikle yaralanma dan sonra gecikmiş kardiyak mekaniği sağlar3,4. Doku Doppler görüntüleme segmental miyokardiyal deformasyon bilgi sağlar ama önemli intraobserver ve interobserver değişkenlik muzdarip, kısmen ultrason ışın açısı bağımlılığı nedeniyle5. İki boyutlu (2D) benek izleme, teorik olarak açı bağımlılığını ortadan kaldıran ekokardiyografinin B-modunu kullanır, ancak doğruluğu düzlem dışı hareket6ile sınırlıdır. Bu nedenle, segmental kardiyak fonksiyonun ölçülmesi için titiz bir yaklaşım hem araştırma hem de klinik ortamlarda eksiktir.
Bu bağlamda, miyokardiyal mekanik deformasyonun (DIAMOND) yer değiştirme analiziadını verdiğimiz segmental kardiyak fonksiyonun analizi için, 3Boyutlu alanda miyokardiyal kitle sentroidlerinin yer değiştirme vektörlerini belirlemek için 4Boyutlu bir niceleme yöntemi geliştirdik. Biz hayvan modeli olarak zebra balığı ile kardiyak fonksiyon ve doksorubisin kaynaklı kardiyak toksisite in vivo değerlendirilmesi için DIAMOND uygulanan (Danio rerio) hayvan modeli olarak, onların rejenere miyokardiyum ve son derece korunmuş gelişimgenleri nedeniyle seçilen7. Ayrıca segmental DIAMOND deplasmanı ile küresel ejeksiyon fraksiyonu (EF) tayini ve doksorubisin tedavisi sonrası 2D suş ile karşılaştık. 4D ışık yaprak floresan mikroskopi ile DIAMOND deplasman entegre ederek (LSFM) embriyonik zebrabalığı kalpleri elde render, DIAMOND bazal miyokardiyal segmentleri atriyoventriküler kanal bitişik en yüksek mekanik deformasyon geçmesi ve akut doksorubisin kardiyak yaralanma8duyarlı olduğunu gösterir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler UCLA Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ve deneyler UCLA Hayvan Araştırma Ofisi tarafından onaylanan protokollere uygun olarak yapılmıştır.
1. Üreme Tg(cmlc2:mCherry) zebra balığı ve embriyo toplama
- Daha önce kurulmuş hayvancılık ve ıslah uygulamalarında açıklandığı gibi konut, ıslah ve embriyo toplama prosedürlerini takip edin. Ayrıntılar için Messerschmidt ve ark.9'abakın.
- Toplanan embriyoları % 0.003 1-fenil-2-tiourea (PTU) ile Tedavi E3 orta 18 h postfertilizasyon LSFM görüntüleme için embriyoların şeffaflığı korumak için.
2. Kardiyak yaralanmaya neden olmak için doksorubisin tedavisi
- 3 gün postfertilizasyon (dpf), E3 balık suyu orta 10 μM konsantrasyonda doksorubisin ile embriyolar tedavi. 4 dpf için 24 saat tedaviden sonra, taze E3 orta doksorubisin orta değiştirin.
DİkKAT: Doksorubisin bir kemoterapi ilacıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) gereklidir ve atıklar biyolojik tehlike atık kaplarında bertaraf edilmelidir.
3. Çentik yol modülasyonu
- Zebra balığı embriyolarına Notch yolu inhibitörü (2S)-N-[(3,5-diflorofenil)asetil]-L-alanyl-2-fenil]glisin 1,1-dimetiletil ester (DAPT) 3-6 dpf'den itibaren E3 balık suyu ortasında 10 μM konsantrasyonda tedavi edin.
- 10 pg /nL ve 5 pg/nL konsantrasyonlarında notch downstream efektörleri Notch hücre içi etki alanı (NICD) ve Neuregulin-1 (Nrg-1) mRNA, sırasıyla, 1 hücreli evre zebrabalığı embriyoları8,10.
NOT: Mikroenjeksiyon, enjekte edilen hacmi doğru bir şekilde kontrol etmek için bir hava pompası desteği ile mikroskop altında gerçekleştirilir. Hücreiçine mRNA mikroenjeksiyonu, döllenmiş yumurta ilk hücre evresinde olduğunda yapılır. mRNA'ların hazırlanması ve sırası hakkında ayrıntılı bilgi için Chen ve ark.8'ebakınız. Enjeksiyon iğnelerinin mikroenjeksiyonu ve hazırlanması hakkında ayrıntılı bilgi için Rosen ve ark.10'abakınız.
4. LSFM görüntüleme ve post-görüntüleme senkronizasyonu
- LSFM görüntüleme teknikleri ve post-görüntüleme senkronizasyon algoritması için, önceki yayınlarda ayrıntıları görmek9,11.
NOT: Kısaca, sistemimiz tüm transgenik zebra balığı hatlarını görüntülemek için aydınlatma kaynağı olarak sürekli dalga lazeri kullanmaktadır. Algılama modülü iki bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (sCMOS) kamera ve çift kanallı görüntüleme için iki filtre kümesinden oluşur. Algılama modülü aydınlatma düzlemine dik olarak monte edilmiştir. Her LSFM çerçevesi 20 msn pozlama süresi içinde elde edilirken, kesitteki çözme gücü ~0,65 μm ve ardışık kareler arasındaki adım boyutu ~2 μm'dir. 589 nm lazer mCherry floresan sinyalleri heyecanlandırmak için kullanılmıştır.
5. 3D sistolik ve diyastolik kalbin rekonstrüksiyonu
- Post eşitleme algoritması tarafından oluşturulan klasörü açın, sonra "Çıktı" klasörünü açın. Kalbin orta düzlemini seçin ve tüm klasörü ImageJ'e yükleyin. İlk diyastolik ve sistolik fazı bulun ve kare numarasını kaydedin.
- "Çıktı/Duruma Göre" klasörünü açın ve az önce kaydedilmiş kare numaralarıyla aynı sayılara sahip klasörleri bulun. Klasördeki görüntüleri 3B TIFF (etiketli resim dosyası biçimi) dosyalarına dönüştürün ve onlara "diastole.tif" ve "systole.tif" adını ver.
6. Ventrikül segmentasyonu
- Görüntü çözümleme yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu). Dosyayı Tıklatın | Verileri açınve "diastole.tif" ve "systole.tif" yüklerini yükleyin. Görüntüleme ayarlarına göre voxel boyutunu girin.
NOT: Kullanılan LSFM sistemi için tipik voxel boyutu 0,65 μm x 0,65 μm x 2 μm'dir. - "SEGMENTASYON" paneline tıklayın ve kalbin ventrikül kısmını el ile ayırın. Belirli bir yoğunluğun üzerindeki tüm bölgeleri seçebilen yerleşik "Eşik" aracı bu işlemi kolaylaştırabilir. Ventrikül daha güçlü bir floresan ile kalın oda.
NOT: Atriyoventriküler kanalı ve segmentli ventriküldeki çıkış yollarını çıkardığından emin olun, çünkü bu yer değiştirme analizini etkiler. - Segmentasyon yapıldıktan sonra "Project" paneline tıklayın. Sağ tıklayın "diastole. Etiketler.tif" ve "systole. Etiketler.tif" sekmeleri konsolda ve 3D TIFF dosyaları olarak veri kaydetmek için "Veri Dışa aktarın" tıklayın.
7. Resim kaydı için dikdörtgen paralelepipedlerin oluşturulması
- "prepImage_1.m" yi programlama ortamında çalıştırın (bkz. Malzemeler Tablosu). 5. satırda "prepImage_1.m", "ImPath" dosyasını açın, böylece klasör orijinal ve bölümlü TIFF dosyalarını içerir ve "slice" satır 4'ü 3D tif dosyalarının dilim sayısına değiştirin.
- Kodu çalıştırdıktan sonra beş yeni 3D TIFF dosyası ("test.tif", "diastole_200.tif", "systole_200.tif", "diaLabel.tif", "sysLabel200.tif") ve iki yeni klasör ("resample_dia" ve "resample_sys") oluşturur.
8. Kısa eksen düzlemi boyunca sistolik ve diyastolik 3D kalpleri yeniden örnekleme
- Beş adet 3B TIFF dosyasını görüntü çözümleme yazılımına aktarın (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Voxel boyutu değişmez. - MULTIPLANAR paneline gidin. Birincil veri olarak "diastole_200.tif"i seçin. X eksenini (XY düzlemindeki yeşil çizgi) ventrikülün dikey uzun ekseniyle hizala ve Z eksenini (YZ düzlemindeki kırmızı çizgi) ventrikülün yatay uzun ekseniyle hizala.
NOT: Dikey uzun eksen, XY düzleminde apeks ve çıkış yolu bağlayan en uzun eksen bulunarak belirlenir ve yatay uzun eksen, tepeyi ve YZ düzlemindeki çıkış yolu bağlayan en uzun ekseni bularak belirlenir. İmleci eksenin sonuna yerleştirerek ekseni döndürün. - Oblik YZ düzleminden (kısa eksen düzlemi) saat yönünün tersine üç rasgele nokta seçin ve 3B konum koordinatlarını kaydedin.
NOT: Noktaların saat yönünün tersine seçildiğinden emin olun. - "systole_200.tif" için 8.2 ve 8.3 adımlarını tekrarlayın.
- "PROJE" paneline tıklayın. "diastole_200.tif" düğmesine sağ tıklayarak ve "Slice" nesnesi arayarak "diastole_200.tif" için "Dilim" nesnesi oluşturun. Yeni oluşturulan Dilim nesnesini sol tıklatın ve Özellikler panelinde | Seçenekler, "Düzlem Iseti" seçeneğini işaretleyin ve "Düzlem Tanımı"nda üç nokta seçin. Adım 7.3'ten üç noktanın koordinatlarını girin.
- "systole_200.tif" için 8.5 adımLarını tekrarlayın.
NOT: Oluşturulan dilim nesnesi "Slice 2" adı olmalıdır. - Sağ tıklayın "diastole_200.tif" ve "Resample Transformed Image" için arama ve nesne oluşturun. Özellikler panelinde "Slice" ı " "Reference" olarak seçin ve Uygula'yıtıklatın. Bu , "diastole_200.transformed" adlı bir nesne oluşturmalıdır.
- Sağ tıklayın "diastole_200.transformed" ve "Resample" için arama ve nesne oluşturun. "Voxel Size" i seçinve Özellikler panelinde " Voxel Size " seçeneğini belirleyin ve "Voxel Size" x = 1, y = 1 ve z = 1'i değiştirin.
- "Uygula" seçeneğini tıklatın. Bu , "diastole_200.resampled" adlı bir nesne oluşturmalı. Sağ tıklayın "diastole_200.resampled" ve bir 3D TIFF dosyası olarak kaydedin.
- "diaLabel.tif" ve "test.tif" için aynı adımı yineleyin. "diaLabel.resampled" ve "test.resampled" dosyalarını 3B TIFF dosyaları olarak kaydedin. "systole_200.tif", "sysLabel.tif" ve "test.tif" için"Slice 2" kullanarak aynı adımı başvuru olarak tekrarlayın ve "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" ve "test2.resampled" dosyalarını 3D TIFF dosyaları olarak kaydedin.
NOT: Bu adımda toplam altı TIFF dosyası kaydedildiemin.
9. Yeniden örneklenmiş kalbin bölünmesi
- Yeniden örneklenmiş altı dosyanın tümlerini 8 adımdan ImageJ'e aktarın. Atriyoventriküler kanalın açıkça görüntülendiği "systole_200.resampled" dilimini seçin. Dilimin numarasını kaydedin.
- " Resmi Kullanın| Dönüştür | Atriyoventriküler kanal dikey olacak şekilde ImageJ "fonksiyonu nu döndürün. Tüm dosyalara aynı döndürmeyi uygulayın. Tüm pencereleri kapatın ve tüm değişiklikleri kaydedin.
- "diastole_200.resampled", "diaLabel.resampled" ve "test.resampled"i "resample_dia" klasörüne taşıyın ve "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" ve "test2.resampled"i "resample_sys" klasörüne taşıyın.
- "divider_2_8_pieces.m"i aç. "ImPath" satır 5 ve "ImPath" satır395'i görüntü dizinine değiştirin. "Orta" satır 22 ve satır 411'i atriyoventriküler kanalın açıkça "systole_200.resampled" ve "diastole_200.resampled" olarak görselleştirildiği dilim numaralarına değiştirin.
- Kodu çalıştırın ve istenilen pencerelerde ventrikülün ortasına bir kez tıklayın ve atriyoventriküler kanalın merkezinde bir kez tıklatın. Bu hem systole ve diastole görüntüler için iki kez yapılması gerekir.
10. Sistolik ve diyastolik görüntü matrislerinin kaydı
- "register_3.m"yi açın ve"ImPath"satır4'ü resim klasörü yoluna değiştirin. Sistemin hesaplama gücüne bağlı olarak bu kodu çalıştırmak 5-20 dakika sürebilir.
NOT: 7. adımda yapay olarak oluşturulan dikdörtgen paralelepipedler, iki nokta ve üç nokta ile abone olunan açılar arasındaki mesafeyi koruyan 3B rijit kayıt için kullanılır. Son diyatobluk dikdörtgen paralelepiped (kırmızı) son-systole dikdörtgen parallelepiped (yeşil) kaydedildiğinde, takip eden diskrepant 3D konumu, son diyatoblum matrisinden son-sistole matrisine dönüş ve çeviriden oluşan benzersiz bir rijit dönüştürme matrisinin türemine izin verir (Şekil 1H). Bir görüntü işleme araç kutusunu kullanarak dönüşümden sonra matrisi bozacak kayıt ve düzenli enerji minimizasyonu gerçekleştiriyoruz (Bkz. Malzeme Tablosu). Ayrıntılı bir matematiksel açıklama için chen ve ark.8'ebakın.
11. Yer değiştirme vektörlerinin çıkışı
- "displacement_4.m" dosyasını açın ve "ImPath" satırını 4'teki resim klasörü yoluna değiştirin.
- "vektörler" klasöründe "vector8.txt" dosyası oluşturan "displacement_4.m"yiçalıştırın. "vector8.txt" dosyası açıldıktan sonra 8 x 4 matris olacaktır. Matrisin her satırı, X bileşeninin büyüklükleri, Y bileşeni, Z bileşeni ve ventrikülün belirli bir bölümünün yer değiştirme vektörünün TOPLAM büyüklüğü olan dört sayıya sahiptir.
NOT: Yer değiştirme vektörü, her bir segmentin kütle sentroidinin 3B alanda yer değiştirmesi hesaplanarak elde edilir. Systole'den diastole'e segmentasyon veri setinde
her segmentin (I-VI) 3B kütle merkezsoid (PS ve PD)koordinatlarını (k'nin sırasıyla X, Y veya Z koordinatını gösterdiği yerde) hesaplıyoruz. 3B alanda kütle merkezroidini aşağıdaki gibi tanımlıyoruz:
Cx x, Cy = Y ve Cz = Z, Mi = her segmentin kütlesi (I ≤ i ≤ VI), m = her segmentin voxel sayısı ve ρ = segmentli bölge olarak yoğunluk fonksiyonu 1 ise geri kalanı 0'dır. X-, Y- ve Z eksenleri boyunca yer değiştirme vektörlerinin L2 normları ve toplam yer değiştirme vektörü kardiyak döngü sırasında hesaplanır. Matriste toplam sekiz satır vardır. Birinci ve sekizinci sıra atriyoventriküler kanalı içerir ve bu nedenle analizimizde göz ardı edilir. I'den VI'ya kadar olan segmentler yedinci satırın ikinci satırıyla temsil edilir.
her segmentin (I-VI) 3B kütle merkezsoid (PS ve PD)koordinatlarını (k'nin sırasıyla X, Y veya Z koordinatını gösterdiği yerde) hesaplıyoruz. 3B alanda kütle 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DIAMOND'ın 3Boyutlu segmental kardiyak fonksiyonunu değerlendirmek için geliştirildiği süreç Şekil 1'desunulmuştur. Embriyonik zebra balığı kalbinin 3Boyutlu LSFM görüntü edinimi ve rekonstrüksiyonu(Şekil 1A),gerçek kısa eksen düzlemi dikey ve yatay uzun eksenlere dik düzlem olarak belirlenmiştir ve bunların her ikisi de çok düzlemli bir görüntüleyicide belirlenir (Şekil 1B). Kalp daha sonra kısa eksen düzlemi boyunca yeniden örneklendi (Şekil 1C), ve endokardiyal ventriküler kavitenin merkezini atriyoventriküler kanalın merkezine bağlayan sanal bir bölme çizgisine (kırmızı noktalı çizgi) göre eşit açılarla oluşan sekiz eşit parçaya bölündü (Şekil 1E). Tanımlanan segmentlerin 3Boyutlu tasvirleri kesitsel bir görünümde(Şekil 1F)ve ham verilerle karşılaştırıldığında gösterilmiştir (Şekil 2). VII ve VIII segmentleri atriyoventriküler kanalı kapsadığı ve böylece diğer segmentlere göre daha az miyokardiyum içerdiği için analizden çıkarıldı. End-ss (HS)ve end-diastole (HD)için farklı yeniden örnekleme düzlemleri, orijinal uzamsal ilişkilerini geri yüklemek için kaydedilmesi gereken son sistolik ve son diyastolik matrisler için farklı koordinat sistemlerine yol açar (Şekil 1G). Son sistolik matrisin koordinat sistemi tutarlılık için referans olarak seçilmiştir. Dönüşüm matrisini (Tm)uç diyastolik matristen uç sistolik matrise belirlemek için, 3B'de asimetrik olan ve orijinal görüntü matrisi ile aynı boyuta sahip üç paralel epipedden oluşan bir matris sanal olarak oluşturulmuştur. Parallelepipeds iki kez, ilk son-systole matris kısa eksen düzleminde, ve daha sonra son diyastole matris kısa eksen düzleminde, uç systole (yeşil) ve son diyatomi (kırmızı) için farklı dönüştürülmüş parallelepipeds yol(Şekil 1H)yeniden örneklenmiştir.
Yeşil ve kırmızı paralelepipedler daha sonra sert bir gövde kayıt algoritması ile birlikte kaydedildi ve Tm hesaplandı ve koordinatları geri yüklemek için son diyaçal matrisine uygulandı (Şekil 1I). Bu süreç, kardiyak döngü sırasında ventrikülün herhangi bir segmentinden kütle sentroidlerinin yer değiştirme vektörlerinin 3Boyutlu uzayında sonraki izlemelere izin verir(Şekil 1J). Ventriküler segmentlerin ELMAS yer değiştirmesi I-VI kardiyak döngüde birden fazla zaman noktasında izlenebilir(Şekil 1K),kantitatif analiz için iki zaman puanına kadar iki zaman puanına kadar olan son diyatondan(Şekil 1L). DIAMOND tarafından oluşturulan segmentler Şekil 2'degörselleştirilebilir, her renk bir kardiyak segmenti temsil eder.
DIAMOND ile zebra balığında kardiyak fonksiyonun segmental heterojenliğini ve doksorubisin kaynaklı miyokardiyal yaralanmaya yatkınlığını ortaya çıkardık. 3-4 dpf 'den 10 μM doksorubisin ile 24 saat tedaviden sonra(Şekil 3A),ventriküler segmentlerin kontrol ve kemoterapi ile tedavi edilen gruplar arasındaki DIAMOND deplasmanını(Şekil 3B) ve tedaviden sonra 48 saat(Şekil 3C)karşılaştırdık. Tüm DIAMOND şekilleri, kısa eksen boyunca yeniden örneklenmiş ventriküllerle aynı grafik deseni izler (Şekil 1E). Veriler, yer değiştirme vektörünün L2 normunun kalbin iç çevresine normalleştirilmesi, X (yeşil), Y (mavi) ve Z bileşenlerinin (turuncu) ağırlıklı katkıları olarak gösterildiği yüzdeler olarak sunulur. 4 dpf'de, kontrol balıklarında segmental yer değiştirme vektörlerinin ortalama L2 normu normalizasyondan sonra %6.6-11.3 m veya %3.8-6.6 arasında değişmekteydi. Sonuçlarımız, kontrol koşulları altında, bazal segmentler I ve VI en büyük yer değiştirmeleri geçmesi ve doksorubisin indüklenen kardiyak yaralanma(Şekil 3B, % 29 azalma 6.6-4.7%, n = 10 kontrol ve n = 8 doksorubisin, p < 0,01) duyarlı olanları göstermektedir. 6 dpf'de, kontrol balıklarında segmental yer değiştirme vektörlerinin ortalama L2 normu normalizasyondan sonra 6.8-14 μm veya %3.9-8 arasında değişmekteydi. 6 dpf'de, bazal segmentler I ve VI, segmental rejenerasyon(Şekil 3C, n = 10 kontrol ve n = 8 doksorubisin) öneren, kontrol düzeylerine DIAMOND deplasman ı kurtarıldı. Buna paralel olarak, doksorubisin tedavisinin ardından 4 dpf'de -53'ten -%-38'e kadar 2D bazal suşunda kötüleşme gözlendi ve ardından 6 dpf'de kontrol seviyelerine geri dönüş yapıldı ve DIAMOND yer değiştirme sonuçları doğrulandı(Şekil 3D, 3E). 4 dpf'de doksorubisin insasına yanıt olarak küresel ejeksiyon fraksiyonunda paralel bir azalma gözlendi ve 6 dpf'de iyileşme gözlendi (Şekil 3F, 3G).
Biz daha sonra doksorubisin tedavisi sırasında DIAMOND uygulanan ve Notch inhibitörü DAPT kullanarak Çentik yol modülasyonu ve Notch downstream efektörleri NICD ve NRG1 mRNA kullanarak kurtarma(Şekil 4A). NICD ve NRG1 mRNA mikroenjeksiyon 4 dpf akut kemoterapi kaynaklı yaralanma sonrası DIAMOND deplasman ve EF azalma kurtarıldı(Şekil 4B, 4D). Notch inhibitörü DAPT'ye doksorubisin ile birlikte maruz kalma, Bazal segmentler I ve VI'ya ek olarak DIAMOND deplasmanında daha yaygın bir azalmaya yol açmıştır (Şekil 4B). Ayrıca, kemoterapikaynaklı yaralanma sonrası Notch yolunun inhibisyonu daha fazla bazal segmentlerin DIAMOND deplasman ve 6 dpf EF kurtarma engelledi. İnhibisyon Notch downstream efektörleri NICD ve NRG1 tarafından kurtarıldı(Şekil 4C, 4E).
Şekil 1: 4D DIAMOND deplasman gelişimi. (A) Ham görüntüler hafif sac floresan mikroskopi ile yakalandı. (B ve C) Yeniden yapılandırılan 3D kalp, gerçek kısa eksenli düzlem görünümü boyunca yeniden örneklendi. (D) Embriyonik zebrabalığı kalbinin şematik illüstrasyonu. (E ve F) ventrikül bölünmesinin 2D ve 3D çizimleri VII ve VIII segmentleri hariç sekiz segmente ayrılır. (G) Yeniden örnekleme den sonra end-sistole ve end-diastole farklı koordinat sistemleri. (H) Bir dönüşüm matrisi (Tm)üretimi için dikdörtgen paralelepipedler grubu oluşturuldu. (I) Kayıtlı uç sistolik ve son diyastolik koordinat sistemleri Tm. (J) Segmental kütle sentroidin yer değiştirme vektörü end-systole'den end-diastole'e kadar. (K) Ventriküler segmentlerin DIAMOND deplasmanı I-VI kardiyak döngüde birden fazla zaman noktasında izlenir. (L) Ventriküler segmentlerin Diamond deplasmanı I-VI end-systole'den end-diastole'e kadar. Chen ve ark.8'den alınan bu rakam, American Society for Clinical Investigation (ASCI) izni ile çoğaltılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Embriyonik zebra balığı kalbinin ELMAS segmentasyonu 3D ham verilerle karşılaştırıldığında. Embriyonik zebrabalığı kalbi, DIAMOND yer değiştirmelerinin hesaplanması için burada farklı renklerde resmedilen altı parçaya (hacim) ayrılmıştır (solda). DIAMOND tarafından hesaplanan her segmentin yer değiştirme vektörü segmental kardiyak fonksiyonunu temsil eder. Segmentasyon sırasında atriyum ve çıkış yolu çıkarıldı. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: DIAMOND, kardiyak fonksiyonda segmental heterojenliği ve kemoterapiye bağlı yaralanmaya yatkınlığı çözer. (A) Doksorubisin tedavisinin deneysel programı. (B ve C) 4 ve 6 dpf 'de kontrol ve doksorubisin ile tedavi edilen gruplar arasındaki iç miyokardiyal çevreye normalleştirilen DIAMOND yer değiştirme vektörlerinin segmental karşılaştırılması (t testleri, **p < 0.01, n = 8-10 grup başına). (D ve E) Ventriküler tabandaki gerilmenin diamond deplasman vektörleri (*p < 0.05, n = 6-8 grup başına) benzer bir yaralanma ve rejenerasyon deseni olarak gösterilmesi. (F ve G) Küresel ventriküler düzeyde segmental DIAMOND deplasmanlarına benzer bir desen izleyerek (t testleri, **p < 0.01, hata çubukları SEM, n = 6-10 grup başına) 6 dpf'de 4 dpf'de doksorubisin ejeksiyon fraksiyonunda azalma. Chen ve ark.8'den alınan bu rakam ASCI'nin izniyle çoğaltılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Doksorubisin kaynaklı yaralanma sonrası Çentik aracılı miyokardiyal iyileşmenin değerlendirilmesi için DIAMOND mekaniği. (A) Deneysel program. (B ve C) NICD ve NRG1 Notch downstream efektörleri 4 dpf'de I ve VI segmentlerinde DIAMOND deplasmanının azaltılmasını kurtardı. 6 dpf'de, DAPT tarafından Çentik sinyalinin inhibisyonu segmental kardiyak fonksiyonun restorasyonunu bozabilir (ANOVA, **p < 0.01 Dox vs. kontrol; †p < 0.05†p < 0.01, Dox + DAPT vs. kontrol, n = 6-10 grup başına). (D ve E) Fırlatma fraksiyonu küresel düzeyde DIAMOND mekaniğini doğrular (ANOVA, *p < 0.05, **p < 0.01, hata çubukları SEM, n = 5-11 grup başına). Chen ve ark.8'den alınan bu rakam ASCI'nin izniyle çoğaltılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Segmental miyokardiyal fonksiyonun sayısallaştırılması için sıkı bir strateji geleneksel EF ötesinde kardiyak mekaniği değerlendirmek için önemlidir, miyokardiyal yaralanma duyarsız ve gecikmiş bir göstergesi olduğu bilinen1,4,12. Bu nedenle, erken miyokardiyal değişikliklerin belirteçleri artan bir ilgi olmuştur, ve literatür büyüyen bir vücut ventriküler disfonksiyon tahmin etmek için erken bir gösterge olarak miyokardiyal deformasyon parametrelerini destekler4,13. Sol ventrikül (LV) suşunun ekokardiyografik ölçümü miyokardiyal deformasyon ölçümü13'ünyerleşik bir yöntemini sağlar. Ancak, doku Doppler tabanlı gerinim görüntüleme açı bağımlılığı ve intraobserver ve interobserver değişkenlik14nedeniyle eksiklikleri bir dizi muzdarip. Benek izleme ekokardiyografi (STE) açıbağımsız 2D ve 3D doku deformasyonu çözebilir, ancak 2D benek izleme doğruluğu düzlemhareketi6 etkilenir, 3D benek izleme kareler arasındaki benekler izlemek için 3D ve yüksek zamansal çözünürlük pozitif ultrason girişim desenleri (benek) çözmek için üstün mekansal çözünürlük gerektirir iken15. Bu protokolde DIAMOND deplasmanını zebra balığında 4B segmental kardiyak fonksiyonun in vivo nicelölçümü için yeni bir miyokardiyal deformasyon parametresi olarak tanımlıyoruz. REFERANS standartları olarak EF ve 2D gerinim ile karşılaştırıldığında DIAMOND, düzlem boyunca hareketten etkilenmeden ek segmental deformasyon bilgileri sağlar. 4D LSFM ile DIAMOND entegre ederek, tekniğimiz şu anda milimetre aralığı çözünürlüğü16olan en gelişmiş 3D STE sistemi için bile imkansız olan 20-30 μm genişliğinde bir kalp segmentinin deplasman vektörü değerlendirebilirsiniz.
DIAMOND uygulamak için, embriyonik zebrabalığı kalbinin anatomik yapısının kapsamlı bir şekilde anlaşılması çok önemlidir. Görüntü segmentasyonu sırasında, kullanıcı protokolde 6. Ayrıca, ventrikülyatay ve dikey uzun eksenleri doğru adım 8 görüntü resampling için gerçek kısa eksen düzlemi elde etmek için belirlenmelidir.
DIAMOND'ı uygulamanın en önemli hız sınırlayıcı faktörü, kardiyak döngü sırasında birden fazla fazın değerlendirilmesi gerektiğinde zaman alan ventrikülün manuel segmentasyonudur. Makine öğrenimi ve sinir ağlarının ilerlemesi ile, otomatik kardiyak segmentasyon yöntemi17,18,19,20 tüm kardiyak döngüsü boyunca segmental kardiyak fonksiyonun izlenmesini sağlamak için DIAMOND ile entegre edilebilir. DIAMOND diğer uygulamalar da ekokardiyografi ile entegrasyon dahil, mikro-BT, veya mikro-MRG, kardiyak yaralanma ve rejenerasyon multiscale değerlendirilmesi için büyük hayvan modellerinde uygun21. Ancak, yöntem ilk memelilerde burulma22,23dahil olmak üzere daha karmaşık kardiyak deformasyona yol açan miyokardiyal liflerin varlığına adaptasyon gerektirir.
Genel olarak DIAMOND, embriyonik zebrabalıklarında hem fizyolojik hem de patolojik koşullar altında segmental kardiyak fonksiyonu değerlendirmek için yeni bir yöntem sunar ve yolların vivo taramasında yüksek iş lenme için bir platform olarak kullanılabilir. kemoterapiye bağlı kardiyak toksisite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmişler.
Acknowledgments
Mevcut çalışma Amerikan Kalp Derneği hibe 16SDG30910007 ve 18CDA34110338 ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından HL083015, HL1111437, HL118650 ve HL129727 hibe tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira6 | FEI | Image analyzing software | |
| DAPT | Millipore Sigma | D5942-5MG | |
| Doxorubicin hydrochloride | Millipore Sigma | D1515-10MG | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Millipore Sigma | E10521-10G | Tricaine |
| MATLAB | MathWorks | Programming environment | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MathWorks | Image processing toolbox |
References
- Ewer, M. S., Ewer, S. M.
- Thavendiranathan, P., Wintersperger Bernd, J., Scott, F. D., Thomas D, M. H. Cardiac MRI in the Assessment of Cardiac Injury and Toxicity From Cancer Chemotherapy. Circulation: Cardiovascular Imaging. 6 (6), 1080-1091 (2013).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Thavendiranathan, P., et al. Use of Myocardial Strain Imaging by Echocardiography for the Early Detection of Cardiotoxicity in Patients During and After Cancer Chemotherapy. A Systematic Review. 63 (25), Part A 2751-2768 (2014).
- Collier, P., Phelan, D., Klein, A. A Test in Context: Myocardial Strain Measured by Speckle-Tracking Echocardiography. Journal of the American College of Cardiology. 69 (8), 1043-1056 (2017).
- Hanekom, L., Cho, G. Y., Leano, R., Jeffriess, L., Marwick, T. H. Comparison of two-dimensional speckle and tissue Doppler strain measurement during dobutamine stress echocardiography: an angiographic correlation. European Heart Journal. 28 (14), 1765-1772 (2007).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Chen, J., et al. Displacement analysis of myocardial mechanical deformation (DIAMOND) reveals segmental susceptibility to doxorubicin-induced injury and regeneration. JCI Insight. 4 (8), e125362 (2019).
- Messerschmidt, V., et al. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Journal of Visualized Experiments. (138), e57763 (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Lenneman, C. G., Sawyer, D. B. Cardio-Oncology: An Update on Cardiotoxicity of Cancer-Related Treatment. Circulation Research. 118 (6), 1008-1020 (2016).
- Geyer, H., et al. Assessment of Myocardial Mechanics Using Speckle Tracking Echocardiography: Fundamentals and Clinical Applications. Journal of the American Society of Echocardiography. 23 (4), 351-369 (2010).
- Castro, P. L., Greenberg, N. L., Drinko, J., Garcia, M. J., Thomas, J. D. Potential pitfalls of strain rate imaging: angle dependency. Biomedical Sciences Instrumentation. 36, 197-202 (2000).
- Seo, Y., Ishizu, T., Aonuma, K. Current Status of 3Dimensional Speckle Tracking Echocardiography: A Review from Our Experiences. Journal of Cardiovascular Ultrasound. 22 (2), 49-57 (2014).
- Amzulescu, M. S., et al. Improvements of Myocardial Deformation Assessment by Three-Dimensional Speckle-Tracking versus Two-Dimensional Speckle-Tracking Revealed by Cardiac Magnetic Resonance Tagging. Journal of the American Society of Echocardiography. 31 (9), 1021-1033 (2018).
- Wolterink, J. M., Leiner, T., Viergever, M. A., Išgum, I. Reconstruction, Segmentation, and Analysis of Medical Images. Zuluaga, M. A., et al. , Springer International Publishing. 95-102 (2016).
- Avendi, M. R., Kheradvar, A., Jafarkhani, H. A combined deep-learning and deformable-model approach to fully automatic segmentation of the left ventricle in cardiac MRI. Medical Image Analysis. 30, 108-119 (2016).
- Packard, R. R. S., et al. Automated Segmentation of Light-Sheet Fluorescent Imaging to Characterize Experimental Doxorubicin-Induced Cardiac Injury and Repair. Scientific Reports. 7 (1), 8603 (2017).
- Jay Kuo, C. C., Chen, Y.
- Natarajan, N., et al. Complement Receptor C5aR1 Plays an Evolutionarily Conserved Role in Successful Cardiac Regeneration. Circulation. 137 (20), 2152-2165 (2018).
- Zhukov, L., Barr, A. H. IEEE Visualization VIS 2003. , 597-602 (2003).
- Nielles-Vallespin, S., et al. In vivo diffusion tensor MRI of the human heart: Reproducibility of breath-hold and navigator-based approaches. Magnetic Resonance in Medicine. 70 (2), 454-465 (2013).
