Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو تفصيل طريقة جديدة لتقييم وظيفة القلب القطاعية في سمك الحمار الوحشي الجنيني في ظل كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية.
Abstract
وتستخدم بشكل متزايد حمار وحشي ككائن حي نموذجي لاعتلال عضلة القلب والتجدد. تفشل الأساليب الحالية التي تقيّم وظيفة القلب في الكشف عن الميكانيكا القطاعية بشكل موثوق وليست ممكنة بسهولة في سمك الحمار الوحشي. نقدم هنا طريقة شبه آلية مفتوحة المصدر للتقييم الكمي لوظيفة القلب القطعية رباعية الأبعاد: تحليل الإزاحة للتشوه الميكانيكي عضلة القلب (DIAMOND). تم تصوير سمك الحمار الوحشي الجنيني المعدل وراثيا في الجسم الحي باستخدام نظام المجهر الفلوري الفاتح مع تزامن حركة القلب 4D. تم إعادة بناء القلوب الرقمية ثلاثية الأبعاد المكتسبة في نهاية الانقباض ونهاية الانبساط ، وتم تقسيم البطين يدويًا إلى مجموعات بيانات ثنائية. ثم أعيد توجيه القلب وأعيد تعيناته على طول المحور القصير الحقيقي، وقسم البطين بالتساوي إلى ثمانية أجزاء (I-VIII) على طول المحور القصير. بسبب مختلف مستويات إعادة العينات والمصفوفات في نهاية systole ونهاية الانبساط ، تم تطبيق مصفوفة التحول لتسجيل الصور لاستعادة العلاقة المكانية الأصلية بين المصفوفات الصورة الانقباضي والانبساطي resampled. بعد تسجيل الصور، تم حساب متجه الإزاحة لكل جزء من نهاية الانقباض إلى النهاية على أساس إزاحة السنتاد الجماعية في ثلاثة أبعاد (ثلاثية الأبعاد). يظهر DIAMOND أن الأجزاء القلبية القاعدية المجاورة للقناة الأذينية البطينية تخضع لأعلى تشوه ميكانيكي وهي الأكثر عرضة لإصابة القلب الناجمة عن الدوكسوروبيسين. بشكل عام، توفر DIAMOND رؤى جديدة في ميكانيكا القلب القطاعية في أجنة حمار وحشي تتجاوز جزء القذف التقليدي (EF) في ظل كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية.
Introduction
السمية القلبية الناجمة عن العلاج الكيميائي وفشل القلب الذي يترتب على ذلك هي واحدة من الأسباب الرئيسية لوقف العلاج الكيميائي1. لذلك ، يلعب التقييم الوظيفي القلبي دورًا حاسمًا في تحديد سمية القلب ، والأهم من ذلك ، في التنبؤ بإصابات القلب المبكرة بعد العلاج الكيميائي2. ومع ذلك، فإن النُهج الحالية للتقييم الوظيفي القلبي تواجه قيودًا. طرق مثل كسر طرد البطين الأيسر (LVEF) توفر فقط ميكانيكا القلب العالمية والمؤجلة في كثير من الأحيان بعد الإصابة3،4. يوفر تصوير الأنسجة دوبلر معلومات تشوه عضلة القلب القطاعية ولكنه يعاني من تقلبات كبيرة داخل المراقب وبين المراقب ، ويرجع ذلك جزئيًا إلى تبعية زاوية شعاع الموجات فوق الصوتية5. يستخدم التتبع ذو الأبعاد الثنائية (2D) وضع B من تخطيط صدى القلب ، والذي يلغي نظريًا تبعية الزاوية ، ولكن دقته محدودة بالحركة خارج المستوى6. لذلك ، لا يوجد نهج صارم لقياس وظيفة القلب القطاعي في كل من الإعدادات البحثية والسريرية.
في هذا السياق، قمنا بتطوير طريقة قياس كمي 4D لتحليل وظيفة القلب القطاعية التي قمنا بتسمية تحليل الإزاحة للتشوه الميكانيكي عضلة القلب (DIAMOND)، لتحديد ناقلات الإزاحة من centroids الجماعية القلبية في الفضاء ثلاثي الأبعاد. طبقنا DIAMOND لتقييم في الجسم الحي لوظيفة القلب وسمية القلب الناجمة عن doxorubicin مع حمار وحشي(Danio rerio)كنموذج الحيوان ، الذي تم اختياره بسبب تجديد عضلة القلب والجينات التنموية المحفوظة للغاية7. كما قارنا إزاحة DIAMOND المجزأة مع تحديد كسر القذف العالمي (EF) والإجهاد 2D بعد علاج الدوكسوروبيسين. من خلال دمج إزاحة DIAMOND مع المجهر الفلوري 4D ورقة خفيفة (LSFM) المكتسبة تقديم قلوب حمار وحشي الجنينية، DIAMOND يظهر أن شرائح عضلة القلب القاعدية المجاورة للقناة الأذينية البطينية تخضع لأعلى تشوه ميكانيكي وهي الأكثر عرضة لإصابة القلب الدوكسوروبيسين الحادة8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الأساليب الموصوفة هنا من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها في جامعة كاليفورنيا (IACUC) ، وتم إجراء التجارب وفقًا للبروتوكولات المعتمدة من قبل مكتب أبحاث الحيوانات في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس.
1. تربية Tg (cmlc2:mCherry) حمار وحشي وجمع الأجنة
- اتباع إجراءات السكن والتربية وجمع الأجنة كما هو موضح في ممارسات تربية وتربية المنشأ سابقاً. لمزيد من التفاصيل، انظر ميسيرشميدت وآخرون9.
- علاج الأجنة التي تم جمعها مع 0.003٪ 1-الفينيل-2-thiourea (PTU) في E3 المتوسطة 18 ح بعد الإخصاب للحفاظ على شفافية الأجنة لتصوير LSFM.
2. علاج دوكسوروبيسين للحث على إصابة القلب
- في 3 أيام بعد الإخصاب (dpf), علاج الأجنة مع دوكسوروبيسين بتركيز 10 ميكرومتر في E3 وسط مياه الأسماك. بعد علاج 24 ساعة إلى 4 dpf, استبدال متوسط دوكسوروبيسين مع E3 المتوسط الطازجة.
تنبيه: دوكسوروبيسين هو دواء للعلاج الكيميائي. وثمة حاجة إلى معدات الحماية الشخصية المناسبة وينبغي التخلص من النفايات في حاويات نفايات المخاطر البيولوجية.
3. تشكيل مسار الشق
- علاج أجنة سمك الحمار الوحشي مع مثبط مسار نوتش (2S)-N-(3,5-difluorophenyl)acetyl]-L-alanyl-2-phenyl]glycine 1,1-dimethylethyl ester (DAPT) بتركيز 10 ميكرومتر في وسط مياه السمك E3 من 3-6 dpf.
- Microinject The Notch downstream effects Notch المجال داخل الخلايا (NICD) وNeuregulin-1 (Nrg-1) مرنا بتركيزات 10 pg/nL و 5 pg/nL، على التوالي، في الأجنة حمار وحشي مرحلة 1 خلية8،10.
ملاحظة: يتم إجراء الحقن المجهري تحت المجهر بدعم من مضخة الهواء للتحكم بدقة في حجم الحقن. يتم الحقن المجهري للمرنا في الخلية عندما تكون البويضة المخصبة في مرحلة الخلية الأولى. للحصول على تفاصيل حول إعداد وتسلسل mRNAs، انظر تشنوآخرون. للحصول على تفاصيل حول الحقن المجهري وإعداد إبر الحقن، انظر روزين وآخرون10.
4. LSFM التصوير ومزامنة ما بعد التصوير
- للاطلاع على تقنيات التصوير LSFM وخوارزمية مزامنة ما بعد التصوير، راجع التفاصيل في المنشورات السابقة9و11.
ملاحظة: لفترة وجيزة، يستخدم نظامنا ليزر الموجة المستمرة كمصدر الإضاءة لتصوير جميع خطوط حمار وحشي المعدلة وراثيا. وتتألف وحدة الكشف من كاميرتين علميتين متكاملتين لأشباه الموصلات المعدنية (sCMOS) ومجموعتين من المرشحات للتصوير بالقناة المزدوجة. يتم تثبيت وحدة الكشف عموديًا على مستوى الإضاءة. يتم الحصول على كل إطار LSFM في غضون 20 msec وقت التعرض، في حين أن قوة حل في المقطع العرضي هو ~ 0.65 ميكرون وحجم الخطوة بين الإطارات المتتالية هو ~ 2 ميكرون. تم استخدام ليزر 589 نانومتر لإثارة إشارات الفلورسنت mCherry.
5. إعادة بناء القلب الانقباضي والانبساطي ثلاثي الأبعاد
- افتح المجلد الذي تم إنشاؤه بواسطة خوارزمية مزامنة المشاركة، ثم افتح مجلد"الإخراج". حدد المستوى الأوسط للقلب وحمّل المجلد بأكمله إلى ImageJ. العثور على المرحلة الانبساطية الأولى والانقباضي وتسجيل رقم الإطار.
- افتح مجلد "الإخراج/حسب الحالة" وابحث عن المجلدات التي لها نفس أرقام الإطارات المسجلة للتو. تحويل الصور في المجلد إلى TIFF 3D (تنسيق ملف الصورة الموسومة) الملفات وتسميتها "diastole.tif" و "systole.tif".
6- تجزئة البطين
- افتح برنامج تحليل الصور (انظر جدول المواد). انقر فوق ملف | فتح البيانات، وتحميل "diastole.tif" و "systole.tif". أدخل حجم فوكسل وفقًا لإعدادات التصوير.
ملاحظة: بالنسبة لنظام LSFM المستخدم، يبلغ حجم فوكسل النموذجي 0.65 ميكرومتر × 0.65 ميكرومتر × 2 ميكرومتر. - انقر فوق"تجزئة"لوحة ويدويا تقسيم الجزء البطين يمن القلب. المدمج في"عتبة"أداة التي يمكن تحديد جميع المناطق فوق كثافة معينة يمكن أن تسهل هذه العملية. البطين هو غرفة أكثر سمكا مع الفلورسة أقوى.
ملاحظة: تأكد من إزالة القناة الأذينية البطينية والقناة الخارجة في البطين المجزأ، لأن هذا يؤثر على تحليل الإزاحة. - بعد الانتهاء من التجزئة، انقر فوق لوحة"المشروع". الحق انقر فوق"انبساط. Labels.tif" و"systole. Labels.tif" علامات التبويب في وحدة التحكم وانقر فوق"تصدير البيانات كما" لحفظ البيانات كملفات TIFF 3D.
7. إنشاء متوازيات مستطيلة لتسجيل الصور
- تشغيل "prepImage_1.m" في بيئة البرمجة (انظر جدول المواد). فتح "prepImage_1.m"،"ImPath" في سطر 5 بحيث يحتوي المجلد على ملفات TIFF الأصلية والمجزأة ، وتغيير "شريحة" في السطر 4 إلى عدد شرائح ملفات tif ثلاثية الأبعاد.
- بعد تشغيل التعليمات البرمجية، فإنه سيتم إنشاء خمسة ملفات TIFF 3D جديدة ("test.tif" و "diastole_200.tif" و "systole_200.tif" و "diaLabel.tif" و "sysLabel200.tif") بالإضافة إلى مجلدين جديدين ("resample_dia" و "resample_sys").
8. إعادة عينة قلوب 3D الانقباضي والانبساطي على طول مستوى المحور القصير
- استيراد جميع ملفات TIFF ثلاثية الأبعاد الخمسة في برنامج تحليل الصور (انظر جدول المواد).
ملاحظة: حجم voxel لم يتغير. - انتقل إلى لوحة MULTIPLANAR. اختر "diastole_200.tif" كبيانات أساسية. قم بمحاذاة المحور X (الخط الأخضر في المستوى XY) مع المحور الرأسي الطويل للبطين، ومحاذاة المحور Z (الخط الأحمر في مستوى YZ) مع المحور الأفقي الطويل للبطين.
ملاحظة: يتم تحديد المحور الرأسي الطويل من خلال العثور على أطول محور يربط بين القمة ومسار التدفق الخارجي في مستوى XY، ويتم تحديد المحور الأفقي الطويل من خلال العثور على أطول محور يربط بين القمة ومسار التدفق في مستوى YZ. تدوير المحور عن طريق وضع المؤشر في نهاية المحور. - اختر ثلاث نقاط عشوائية من مستوى YZ المائل (مستوى المحور القصير) بطريقة عكس عقارب الساعة وسجل إحداثيات موضعها ثلاثية الأبعاد.
ملاحظة: تأكد من اختيار النقاط بطريقة عكس عقارب الساعة. - كرر الخطوتين 8.2 و 8.3 لـ "systole_200.tif".
- انقر فوق لوحة"PROJECT". إنشاء"شريحة"كائن ل "diastole_200.tif" عن طريق النقر على اليمين على "diastole_200.tif" والبحث عن"شريحة"الكائن. انقر على اليسار على كائن الشريحة الذي تم إنشاؤه للتو، وفي لوحة الخصائص | خيارات، والتحقق من"تعيين الطائرة"واختيار ثلاث نقاط في"تعريف الطائرة". أدخل إحداثيات النقاط الثلاث من الخطوة 7.3.
- كرر الخطوة 8.5 لـ "systole_200.tif".
ملاحظة: يجب أن يكون كائن الشريحة الذي تم إنشاؤه اسم"شريحة 2". - انقر على اليمين "diastole_200.tif" والبحث عن"إعادة تشكيل صورة تحويلها"وإنشاء الكائن. في لوحة الخصائص، اختر"شريحة"كـ"مرجع"وانقر فوق تطبيق. يجب أن ينشئ هذا كائن يسمى"diastole_200.transformed".
- انقر على اليمين "diastole_200.transformed"والبحث عن"Resample"وإنشاء الكائن. اختر"حجم Voxel"كـ"وضع"وغيّر"حجم فوكسل"ليكون x = 1، y = 1، وz = 1 في لوحة الخصائص.
- انقر فوق"تطبيق". يجب أن ينشئ هذا كائن يسمى"diastole_200.resampled". انقر على اليمين "diastole_200.resampled" وحفظه كملف TIFF ثلاثي الأبعاد.
- كرر نفس الخطوة لـ "diaLabel.tif" و "test.tif". حفظ "diaLabel.resampled" و "test.resampled" كملفات TIFF 3D. كرر نفس الخطوة لـ "systole_200.tif" و "sysLabel.tif" و "test.tif" باستخدام"Slice 2"كمرجع وحفظ "systole_200.resampled" و "sysLable.resampled" و "test2.resampled" كملفات TIFF ثلاثية الأبعاد.
ملاحظة: تأكد من وجود ما مجموعه ستة ملفات TIFF المحفوظة في هذه الخطوة.
9- تقسيم القلب الذي أعيد تعيناته
- استيراد كافة الملفات الستة التي تم إعادة تشكيلها من الخطوة 8 إلى ImageJ. حدد شريحة من "systole_200.resampled" التي يتم فيها تصور القناة الأذينية البطينية بوضوح. تسجيل رقم الشريحة.
- استخدام "صورة | تحويل | تدوير" وظيفة ImageJ بحيث تكون القناة الأذينية للفرن عمودي. تطبيق نفس التناوب على كافة الملفات. أغلق جميع النوافذ واحفظ جميع التغييرات.
- نقل "diastole_200.resampled" و "diaLabel.resampled" و "test.resampled" إلى مجلد "resample_dia" ونقل "systole_200.resampled" و "sysLable.resampled" و "test2.resampled" إلى مجلد "resample_sys".
- فتح "divider_2_8_pieces.m". تغيير "ImPath" في السطر 5 و"ImPath"في سطر 395 إلى دليل الصورة. تغيير المتغير"الأوسط"في السطر 22 والخط 411 إلى أرقام شريحة حيث يتم تصور القناة الأذينية بوضوح في "systole_200.resampled" و "diastole_200.resampled".
- تشغيل رمز، وفي ويندوز يطالب انقر مرة واحدة في وسط البطين وانقر مرة واحدة في وسط القناة الأذينية. هذا يحتاج إلى القيام به مرتين لكل من الصور systeal وانقباض.
10- تسجيل مصفوفات الصور الانقباضي والانبساطي
- فتح "register_3.m" وتغيير"ImPath"في السطر 4 إلى مسار مجلد الصورة. قد يستغرق 5-20 دقيقة لتشغيل هذا الرمز اعتماداً على قوة حساب النظام.
ملاحظة: يتم استخدام التوازي المستطيل الذي تم إنشاؤه اصطناعيًا في الخطوة 7 للتسجيل ثلاثي الأبعاد الذي يحافظ على المسافة بين نقطتين والزوايا التي يتم الاشتراك فيها بثلاث نقاط. عندما يتم تسجيل نهاية diastole مستطيلة متوازية (أحمر) إلى نهاية systeal مستطيلة parallelepiped (الأخضر)، والموقع 3D discrepant التي تلت ذلك يسمح اشتقاق مصفوفة فريدة من التحول جامدة تتكون من التناوب والترجمة من مصفوفة نهاية الانبساط إلى مصفوفة نهاية systeal(الشكل 1H). نقوم بالتسجيل وتقنين تقليل الطاقة إلى تقليل الضوضاء في المصفوفة بعد التحويل باستخدام صندوق أدوات معالجة الصور (انظر جدول المواد). للحصول على وصف رياضي مفصل، يرجى الاطلاع على تشن وآخرون8.
11- ناتج ناقلات التشرد
- فتح "displacement_4.m" وتغيير"ImPath"في السطر 4 إلى مسار مجلد الصورة.
- تشغيل "displacement_4.m"، الذي ينشئ ملف "vector8.txt" في مجلد "المتجهات". بمجرد فتح ملف "vector8.txt" ، سيكون هناك مصفوفة 8 × 4. يحتوي كل صف من المصفوفة على أربعة أرقام، وهي مقادير مكون X، مكون Y، مكون Z، وحجم SUM لمتجه الإزاحة لجزء معين من البطين.
ملاحظة: يتم الحصول على متجه الإزاحة عن طريق حساب إزاحة الكتلة المئوية لكل جزء في مساحة ثلاثية الأبعاد. نقوم بحساب الكتلة ثلاثية الأبعاد (PS
و PD)إحداثيات (حيث يشير k إلى إحداثيات X أو Y أو Z، على التوالي) لكل جزء (I-VI) في مجموعة بيانات التجزئة من الانقباض إلى الانبساط(الشكل 1J). نحن نحدد الكتلة المئوية في الفضاء ثلاثي الأبعاد على النحو التالي:
حيث Cx = X، Cy = Y، وCz = Z، Mi = كتلة كل قطعة (I ≤ i ≤ VI)، m = عدد voxels لكل جزء، وο = دالة الكثافة كمنطقة مجزأة هي 1 بينما الباقي هو 0. يتم حساب المعيار L2 لناقلات الإزاحة الفرعية على طول محاور X و Y و Z ومتجه الإزاحة الإجمالي خلال دورة القلب. هناك ما مجموعه ثمانية صفوف في المصفوفة. الصف الأول والصف الثامن تحتوي على قناة الأذينين وبالتالي يتم تجاهلها في تحليلنا. يتم تمثيل الأجزاء من الأول إلى السادس بالصف الثاني إلى الصف السابع.
و PD)إحداثيات (حيث يشير k إلى إحداثيات X أو Y أو Z، على التوالي) لكل جزء (I-VI) في مجموعة بيانات التجزئة من الانقباض إلى الانبساط(الشكل 1J). نحن نحدد الكتلة 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تقديم العملية التي تم تطوير هادلتقييم وظيفة القلب القطاعي 3D في الشكل 1. بعد الحصول على صورة LSFM وإعادة بنائها في قلب الحمار الوحشي الجنيني(الشكل 1A)، تم تحديد مستوى المحور القصير الحقيقي كطائرة عمودية على المحاور الطويلة الرأسية والأفقية ، وكلاهما يتم تحديده في عارض متعدد الطائرات(الشكل 1B). ثم تم إعادة تشكيل القلب على طول مستوى المحور القصير(الشكل 1C)، وقسمت إلى ثمانية أجزاء متساوية تشكلها زوايا متساوية وفقًا لخط تقسيم افتراضي (خط منقط أحمر) يربط مركز تجويف البطين الأجوفدي بمركز القناة الأذينية(الشكل 1E). يتم توضيح الصور ثلاثية الأبعاد للأجزاء المحددة في عرض مقطعي(الشكل 1F)وبالمقارنة مع البيانات الخام(الشكل 2). وقد أزيل تُزال الأجزاء السابعة والثامنة من التحليل لأنها تشمل القناة الأذينية البطينية وبالتالي تحتوي على أقل من عضلة القلب مقارنة بالقطاعات الأخرى. تؤدي مستويات إعادة العينات المختلفة للانقباض النهائي (HS)ونهاية الانانبساط (HD)إلى أنظمة تنسيق متميزة للمصفوفات النهائية الانقباضي والانبساطية النهائية ، والتي تحتاج إلى تسجيلها لاستعادة علاقتها المكانية الأصلية(الشكل 1G). وقد اختير نظام الإحداثيات للمصفوفة النهائية الانقباضي كمرجع للاتساق. لتحديد مصفوفة التحويل (Tm)من المصفوفة النهائية الانبساطية إلى المصفوفة النهائية الانقباضي ، تم إنشاء مصفوفة من ثلاثة متوازيات ، وهي غير متناظرة في 3D ولها نفس البعد مثل مصفوفة الصورة الأصلية ، تقريبًا. تم إعادة أخذ عينات من المتوازيمرتين ، أولاً في مستوى المحور القصير لمصفوفة النهاية ، ثم في مستوى المحور القصير لمصفوفة النهاية ، مما أدى إلى أوجه متوازية مختلفة متحولة لنهاية systeal (الأخضر) ونهاية الانبساط (الأحمر)(الشكل 1H).
ثم تم تسجيل التوازي الأخضر والأحمر معا من قبل خوارزمية تسجيل الجسم جامدة وتم حسابT m وتطبيقها على مصفوفة نهاية الانبساط لاستعادة الإحداثيات(الشكل 1I). تسمح هذه العملية بتتبع لاحق في المساحة ثلاثية الأبعاد لناقلات الإزاحة للكميات المئوية الجماعية من أي جزء من البطين خلال دورة القلب(الشكل 1J). يمكن تتبع إزاحة الماس للأجزاء البطينية I-VI خلال نقاط زمنية متعددة في دورة القلب(الشكل 1K)، والتي يمكن تبسيطها للتحليل الكمي إلى نقطتين زمنيتين تتراوحمن نهاية التصريف إلى النهاية الانبساط(الشكل 1L). يمكن تصور الأجزاء التي تم إنشاؤها بواسطة DIAMOND في الشكل 2، حيث يمثل كل لون جزءًا واحدًا من القلب.
مع DIAMOND ، كشفنا عن عدم التجانس القطاعي لوظيفة القلب والتعرض لإصابة عضلة القلب الناجمة عن الدوكسوروبيسين في سمك الحمار الوحشي. بعد علاج 24 ساعة مع 10 ميكرومتر دوكسوروبيسين من 3-4 dpf(الشكل 3A)، قارنا إزاحة DIAMOND من أجزاء البطين بين مجموعات التحكم والعلاج الكيميائي(الشكل 3B)و 48 ساعة بعد العلاج(الشكل 3C). تتبع جميع أرقام DIAMOND نفس النمط الرسومي مثل البطينين الذي أعيد تعيناته على طول المحور القصير(الشكل 1E). يتم تقديم البيانات كنسب مئوية عن طريق تطبيع المعيار L2 لمتجه الإزاحة إلى المحيط الداخلي للقلب، مع توضيح مكونات X (أخضر) وY (أزرق) وZ (برتقالي) كمساهماتها المرجحة. في 4 dpf، تراوح متوسط L2-القاعدة من ناقلات النزوح القطاعي في الأسماك السيطرة من 6.6-11.3 ميكرومتر، أو 3.8-6.6٪ بعد التطبيع. تشير نتائجنا إلى أنه في ظل ظروف السيطرة ، فإن الأجزاء القاعدية الأولى والسادسة تخضع لأكبر عمليات الإزاحة وهي الأكثر عرضة لإصابة القلب الناجمة عن الدوكسوروبيسين(الشكل 3B، 29٪ انخفاض من 6.6-4.7٪ ، n = 10 التحكم ون = 8 دوكسوروبيسين ، p < 0.01). في 6 dpf، تراوح متوسط L2-القاعدة من ناقلات الإزاحة القطاعية في الأسماك المكافحة من 6.8-14 ميكرومتر، أو 3.9-8٪ بعد التطبيع. في 6 dpf، استعادت الأجزاء القاعدية الأولى والسادسة إزاحة الماس للسيطرة على مستويات، مما يشير إلى تجديد القطاعات(الشكل 3C،n = 10 التحكم ون = 8 دوكسوروبيسين). وبالتوازي مع ذلك، لوحظ تفاقم في سلالة القاعدية 2D من -53 إلى -38٪ في 4 dpf بعد علاج دوكسوروبيسين، تليها العودة إلى مستويات السيطرة في 6 dpf، مما يؤكد نتائج النزوح الماس(الشكل 3D، 3E). كما لوحظ انخفاض مواز في كسر القذف العالمي استجابة لدوكسوروبيسين عند 4 دبف مع الاسترداد عند 6 دبف(الشكل 3واو، 3G).
نحن تطبيق الماس المقبل خلال علاج دوكسوروبيسين وتعديل مسار الشق باستخدام مثبط الشق DAPT والإنقاذ باستخدام نوتش المصب المؤثرات NICD وNRG1 مرنا(الشكل 4A). NICD وNRG1 mRNA الحقن المجهري أنقذ الانخفاض في النزوح الماس وEF بعد إصابة حادة الناجمة عن العلاج الكيميائي في 4 dpf(الشكل 4B, 4D). أدى التعرض لمثبط نوتش DAPT جنبا إلى جنب مع دوكسوروبيسين إلى انخفاض أكثر انتشارا في إزاحة الماس، بالإضافة إلى الأجزاء القاعدية الأولى والسادسة(الشكل 4B). وعلاوة على ذلك، فإن تثبيط مسار نوتش بعد الإصابة الناجمة عن العلاج الكيميائي أعاق كذلك تعافي إزاحة الماس من الأجزاء القاعدية وEF عند 6 دبف. تم إنقاذ تثبيط من قبل المؤثرات المصب نوتش وNRG1 (الشكل 4C, 4E).
الشكل 1: تطوير النزوح من الألماس 4D. (أ)تم التقاط الصور الخام عن طريق المجهر الفلورسنت ورقة خفيفة. (B و C)تم إعادة تشكيل القلب ثلاثي الأبعاد على طول عرض المستوى المحور القصير الحقيقي. (د)التوضيح التخطيطي للقلب حمار وحشي الجنينية. (E و F)2D و 3D الرسوم التوضيحية لتقسيم البطين إلى ثمانية أجزاء باستثناء الجزءين السابع والثامن. (G)أنظمة الإحداثيات المختلفة للانهي سالك ونهاية الانبساط بعد إعادة العيّنة. (H)تم إنشاء مجموعة من المتوازيات المستطيلة لتوليد مصفوفة تحويل (Tm). (I)أنظمة الإحداثيات النهائية الانقباضية والنهائية المسجلة عن طريق تطبيق Tm. (J)متجه الإزاحة من الكتلة القطاعية من نهاية systeal إلى نهاية الانبساط. (K)إزاحة الماس من الأجزاء البطينية I-VI تتبع خلال نقاط زمنية متعددة في دورة القلب. (L)إزاحة الماس من الأجزاء البطينية I-VI من نهاية systole إلى نهاية الانبساط. هذا الرقم من تشن وآخرون8 مستنسخ بإذن من الجمعية الأمريكية للتحقيقات السريرية (ASCI). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تجزئة الماس لقلب سمك الحمار الوحشي الجنيني مقارنة بالبيانات الخام في 3D. تم تقسيم قلب حمار وحشي جنيني إلى ستة أجزاء (مجلدات) مصورة هنا بألوان مختلفة لحساب إزاحة DIAMOND (يسار). يمثل متجه الإزاحة لكل شريحة محسوبة بواسطة DIAMOND وظيفتها القلبية القطاعية. تمت إزالة الأذين ومسار التدفق أثناء التجزئة. مقياس شريط = 50 ميكرون. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الماس يكشف التغاير القطاعي في وظيفة القلب والتعرض للإصابة الناجمة عن العلاج الكيميائي. (أ)الجدول الزمني التجريبي لعلاج دوكسوروبيسين. (B و C)مقارنة مقطعية لناقلات إزاحة DIAMOND تم تطبيعها إلى محيط عضلة القلب الداخلي بين مجموعات التحكم ومجموعات doxorubicin المعالجة عند 4 و 6 dpf (اختبارات t، **p < 0.01، n = 8-10 لكل مجموعة). (D و E)تقييم السلالة في قاعدة البطين التي تصور نمط إصابة وتجديد مماثل لناقلات إزاحة الماس (*p < 0.05، n = 6-8 لكل مجموعة). (F و G)انخفاض في كسر القذف استجابة لdoxorubicin في 4 dpf مع الانتعاش في 6 dpf، باتباع نمط مماثل لإزاحة الماس القطعي على مستوى البطين العالمي (t اختبارات، **ف < 0.01، أشرطة الخطأ SEM، n = 6-10 لكل مجموعة). ويرد هذا الرقم من تشين وآخرون8 بإذن من اللجنة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: ميكانيكا DIAMOND لتقييم استعادة عضلة القلب بوساطة نوتش بعد الإصابة الناجمة عن الدوكسوروبيسين. (أ)الجدول الزمني التجريبي. (B و C) NICD وNRG1 نوتش المصب المؤثرات أنقذ انخفاض النزوح الماس في القطاعين الأول والسادس في 4 dpf. في 6 dpf، تثبيط إشارات الشق من قبل DAPT يضعف استعادة وظيفة القلب القطاعية (ANOVA، **p < 0.01 دوكس مقابل التحكم؛ †p < 0.05، ††p < 0.lt، Dox + DAPT مقابل التحكم، n = 6-10 لكل مجموعة). (D و E)كسر طرد يؤكد ميكانيكا الماس على المستوى العالمي (ANOVA، *p < 0.05، **p < 0.01، أشرطة الخطأ SEM، n = 5-11 لكل مجموعة). ويرد هذا الرقم من تشين وآخرون8 بإذن من اللجنة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
استراتيجية صارمة للقياس الكمي لوظيفة عضلة القلب القطعية أمر بالغ الأهمية لتقييم ميكانيكا القلب خارج EF التقليدية، والمعروف أن يكون مؤشرا غير حساس وتأخر الإصابة عضلة القلب1،4،12. وبالتالي ، كان هناك اهتمام متزايد في علامات التغيرات المبكرة عضلة القلب ، ومجموعة متزايدة من الأدب يدعم معلمات تشوه عضلة القلب كمؤشر مبكر للتنبؤ بخلل البطين4،13. يوفر قياس صدى القلب لسلالة البطين الأيسر (LV) طريقة ثابتة لقياس تشوه عضلة القلب13. ومع ذلك ، يعاني تصوير الأنسجة السلالة المستندة إلى دوبلر من عدد من أوجه القصور بسبب تبعية الزاوية والتباين داخل المراقب وبين المراقب14. يمكن لـ Speckle trackography (STE) حل تشوه الأنسجة 2D و 3D المستقل الزاوية ، ولكن دقة التتبع 2D speckle تتأثر بالحركة من خلال الطائرة6، في حين يتطلب التتبع ثلاثي الأبعاد دقة مكانية متفوقة لحل أنماط التداخل بالموجات فوق الصوتية الإيجابية (بقع) بدقة زمنية ثلاثية الأبعاد وعالية لتتبع البقع بين الإطارات15. في البروتوكول الحالي، ونحن نصف النزوح الماس كمعلمة تشوه عضلة القلب رواية لفي الجسم الحي الكمي لوظيفة القلب القطعية 4D في حمار وحشي. بالمقارنة مع EF و 2D سلالة كمعايير مرجعية، DIAMOND يوفر معلومات تشوه قطاعات إضافية دون أن تتأثر الحركة من خلال الطائرة. من خلال دمج DIAMOND مع LSFM 4D ، يمكن لتقنية لدينا تقييم متجه الإزاحة لجزء القلب 20-30 ميكرومتر في العرض ، وهو أمر مستحيل حاليًا حتى لنظام STE ثلاثي الأبعاد الأكثر تقدمًا ، والذي يحتوي على دقة16ملليمترًا .
لتطبيق DIAMOND ، من الأهمية بمكان أن يكون لديك فهم شامل للبنية التشريحية لقلب حمار وحشي جنيني. أثناء تجزئة الصورة ، من الضروري أن يتم تحديد القناة الأذينية البطينية ومسار التدفق بشكل صحيح وتقسيمها من بقية عضلة القلب عندما يقوم المستخدم بتنفيذ الخطوة 6 في البروتوكول. وعلاوة على ذلك، يجب تحديد المحاور الأفقية والعمودية الطويلة للبطين بدقة من أجل اشتقاق مستوى المحور القصير الحقيقي لإعادة أخذ صورة في الخطوة 8.
العامل الرئيسي الذي يحد من معدل تطبيق DIAMOND هو التقسيم اليدوي للبطين ، والذي يصبح مضيعة للوقت عندما قد تحتاج مراحل متعددة خلال دورة القلب إلى تقييم. مع تقدم التعلم الآلي والشبكات العصبية ، يمكن دمج طريقة تجزئة القلب الآلي17و18و19و20 مع DIAMOND لتوفير مراقبة وظائف القلب القطاعية طوال دورة القلب بأكملها. وتشمل التطبيقات الأخرى للماس أيضا التكامل مع تخطيط صدى القلب، التصوير المقطعي الدقيق، أو التصوير بالرنين المغناطيسي الصغير، مناسبة في نماذج الحيوانات الكبيرة لتقييم متعددة النطاق من إصابات القلب وتجديد21. ومع ذلك ، فإن الطريقة تتطلب أولا التكيف مع وجود ألياف عضلة القلب مما يؤدي إلى تشوه القلب أكثر تعقيدا بما في ذلك التواء في الثدييات22،23.
بشكل عام ، توفر DIAMOND طريقة جديدة لتقييم وظيفة القلب القطاعي في سمك الحمار الوحشي الجنيني في ظل كل من الحالات الفسيولوجية والمرضية ويمكن استخدامها كمنصة للإنتاجية العالية في فحص الجسم الحي للمسارات المرتبطة سمية القلب الناجمة عن العلاج الكيميائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وأعلن صاحبا البلاغ أنه لا يوجد تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم تمويل العمل الحالي من قبل منح جمعية القلب الأمريكية 16SDG30910007 و 18CDA34110338 ، ومن قبل المعاهد الوطنية للمنح الصحية HL083015 ، HL1111437 ، HL118650 ، وHL129727.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira6 | FEI | Image analyzing software | |
| DAPT | Millipore Sigma | D5942-5MG | |
| Doxorubicin hydrochloride | Millipore Sigma | D1515-10MG | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Millipore Sigma | E10521-10G | Tricaine |
| MATLAB | MathWorks | Programming environment | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MathWorks | Image processing toolbox |
References
- Ewer, M. S., Ewer, S. M.
- Thavendiranathan, P., Wintersperger Bernd, J., Scott, F. D., Thomas D, M. H. Cardiac MRI in the Assessment of Cardiac Injury and Toxicity From Cancer Chemotherapy. Circulation: Cardiovascular Imaging. 6 (6), 1080-1091 (2013).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Thavendiranathan, P., et al. Use of Myocardial Strain Imaging by Echocardiography for the Early Detection of Cardiotoxicity in Patients During and After Cancer Chemotherapy. A Systematic Review. 63 (25), Part A 2751-2768 (2014).
- Collier, P., Phelan, D., Klein, A. A Test in Context: Myocardial Strain Measured by Speckle-Tracking Echocardiography. Journal of the American College of Cardiology. 69 (8), 1043-1056 (2017).
- Hanekom, L., Cho, G. Y., Leano, R., Jeffriess, L., Marwick, T. H. Comparison of two-dimensional speckle and tissue Doppler strain measurement during dobutamine stress echocardiography: an angiographic correlation. European Heart Journal. 28 (14), 1765-1772 (2007).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Chen, J., et al. Displacement analysis of myocardial mechanical deformation (DIAMOND) reveals segmental susceptibility to doxorubicin-induced injury and regeneration. JCI Insight. 4 (8), e125362 (2019).
- Messerschmidt, V., et al. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Journal of Visualized Experiments. (138), e57763 (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Lenneman, C. G., Sawyer, D. B. Cardio-Oncology: An Update on Cardiotoxicity of Cancer-Related Treatment. Circulation Research. 118 (6), 1008-1020 (2016).
- Geyer, H., et al. Assessment of Myocardial Mechanics Using Speckle Tracking Echocardiography: Fundamentals and Clinical Applications. Journal of the American Society of Echocardiography. 23 (4), 351-369 (2010).
- Castro, P. L., Greenberg, N. L., Drinko, J., Garcia, M. J., Thomas, J. D. Potential pitfalls of strain rate imaging: angle dependency. Biomedical Sciences Instrumentation. 36, 197-202 (2000).
- Seo, Y., Ishizu, T., Aonuma, K. Current Status of 3Dimensional Speckle Tracking Echocardiography: A Review from Our Experiences. Journal of Cardiovascular Ultrasound. 22 (2), 49-57 (2014).
- Amzulescu, M. S., et al. Improvements of Myocardial Deformation Assessment by Three-Dimensional Speckle-Tracking versus Two-Dimensional Speckle-Tracking Revealed by Cardiac Magnetic Resonance Tagging. Journal of the American Society of Echocardiography. 31 (9), 1021-1033 (2018).
- Wolterink, J. M., Leiner, T., Viergever, M. A., Išgum, I. Reconstruction, Segmentation, and Analysis of Medical Images. Zuluaga, M. A., et al. , Springer International Publishing. 95-102 (2016).
- Avendi, M. R., Kheradvar, A., Jafarkhani, H. A combined deep-learning and deformable-model approach to fully automatic segmentation of the left ventricle in cardiac MRI. Medical Image Analysis. 30, 108-119 (2016).
- Packard, R. R. S., et al. Automated Segmentation of Light-Sheet Fluorescent Imaging to Characterize Experimental Doxorubicin-Induced Cardiac Injury and Repair. Scientific Reports. 7 (1), 8603 (2017).
- Jay Kuo, C. C., Chen, Y.
- Natarajan, N., et al. Complement Receptor C5aR1 Plays an Evolutionarily Conserved Role in Successful Cardiac Regeneration. Circulation. 137 (20), 2152-2165 (2018).
- Zhukov, L., Barr, A. H. IEEE Visualization VIS 2003. , 597-602 (2003).
- Nielles-Vallespin, S., et al. In vivo diffusion tensor MRI of the human heart: Reproducibility of breath-hold and navigator-based approaches. Magnetic Resonance in Medicine. 70 (2), 454-465 (2013).
