Summary
El objetivo de este protocolo es detallar un método novedoso para la evaluación de la función cardíaca segmentaria en peces cebra embrionarios tanto en condiciones fisiológicas como patológicas.
Abstract
Los peces cebra se utilizan cada vez más como organismo modelo para cardiomiopatías y regeneración. Los métodos actuales que evalúan la función cardíaca no detectan de forma fiable la mecánica segmentamental y no son fácilmente factibles en el pez cebra. Aquí presentamos un método semiautomatizado de código abierto para la evaluación cuantitativa de la función cardíaca segmental de cuatro dimensiones (4D): análisis de desplazamiento de la deformación mecánica miocárdica (DIAMOND). El pez cebra embrionario transgénico se imágenó in vivo utilizando un sistema de microscopía de fluorescencia de láminas de luz con sincronización de movimiento cardíaco 4D. Los corazones digitales 3D adquiridos fueron reconstruidos a finales de sístole y end-diastole, y el ventrículo se segmentó manualmente en conjuntos de datos binarios. Luego, el corazón se reorientó e isotrópicamente remuestreó a lo largo del verdadero eje corto, y el ventrículo se dividió uniformemente en ocho porciones (I-VIII) a lo largo del eje corto. Debido a los diferentes planos de remuestreo y matrices en la sistole final y la diastola final, se aplicó una matriz de transformación para el registro de imágenes para restaurar la relación espacial original entre las matrices de imágenes sistólicas y diastólicas remuestreadas. Después del registro de la imagen, el vector de desplazamiento de cada segmento de la sistole final a la diastole final se calculó sobre la base del desplazamiento de centroides de masa en tres dimensiones (3D). DIAMOND muestra que los segmentos miocárdicos basales adyacentes al canal auriculoventricular experimentan la deformación mecánica más alta y son los más susceptibles a lesiones cardíacas inducidas por doxorubicina. En general, DIAMOND proporciona información novedosa sobre la mecánica cardíaca segmentaria en embriones de pez cebra más allá de la fracción de eyección tradicional (EF) en condiciones fisiológicas y patológicas.
Introduction
La toxicidad cardíaca inducida por quimioterapia y la insuficiencia cardíaca subsiguiente son una de las principales razones de la interrupción de la quimioterapia1. Por lo tanto, la evaluación funcional cardíaca desempeña un papel crucial en la identificación de la toxicidad cardíaca y, lo que es más importante, en la predicción de una lesión cardíaca temprana después de la quimioterapia2. Sin embargo, los enfoques actuales para la evaluación funcional cardíaca encuentran limitaciones. Métodos como la fracción de eyección ventricular izquierda (LVEF) proporcionan sólo mecánica cardíaca global y a menudo retrasada después de la lesión3,4. Las imágenes Doppler de tejido proporcionan información segmental de deformación miocárdica, pero sufre de una variabilidad intraobservador e interobservador significativa, en parte debido a la dependencia del ángulo del haz de ultrasonido5. El seguimiento de manchas bidimensionales (2D) utiliza el modo B de ecocardiografía, que teóricamente elimina la dependencia del ángulo, pero su precisión está limitada por el movimiento fuera del plano6. Por lo tanto, falta un enfoque riguroso para cuantificar la función cardíaca segmental tanto en la investigación como en los entornos clínicos.
En este contexto, desarrollamos un método de cuantificación 4D para el análisis de la función cardiaca segmental que denominamos análisis de desplazamiento de deformación mecánica miocárdica (DIAMOND), para determinar los vectores de desplazamiento de los centroides de masa miocárdica en el espacio 3D. Aplicamos DIAMOND para la evaluación in vivo de la función cardiaca y la toxicidad cardíaca inducida por doxorubicina con pez cebra (Danio rerio) como modelo animal, elegido debido a su miocardio regenerador y genes de desarrollo altamente conservados7. Además, comparamos el desplazamiento segmentario DIAMOND con la determinación de la fracción de eyección global (EF) y la deformación unitaria 2D tras el tratamiento con doxorubicina. Al integrar el desplazamiento DIAMOND con la microscopía fluorescente de hoja de luz 4D (LSFM) adquirida renderización de corazones de peces cebra embrionarios, DIAMOND muestra que los segmentos miocárdicos basales adyacentes al canal auriculoventricular sufren la deformación mecánica más alta y son los más susceptibles a lesiones cardíacas doxorubicinaagudas 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de UCLA, y los experimentos se realizaron de conformidad con los protocolos aprobados por la Oficina de Investigación Animal de UCLA.
1. Crianza Tg(cmlc2:mCherry) pez cebra y colección de embriones
- Siga los procedimientos de alojamiento, cría y recolección de embriones descritos en las prácticas de cría y cría previamente establecidas. Para obtener más información, véase Messerschmidt et al.9.
- Tratar los embriones recogidos con 0.003% 1-fenil-2-tiourea (PTU) en E3 medio 18 h postfertilización para mantener la transparencia de los embriones para la toma de imágenes LSFM.
2. Tratamiento con doxorubicina para inducir lesiones cardíacas
- A los 3 días de postfertilización (dpf), tratar los embriones con doxorubicina a una concentración de 10 m en el medio de agua de pescado E3. Después de un tratamiento de 24 horas a 4 dpf, reemplace el medio de doxorubicina por un medio E3 fresco.
ADVERTENCIA: La doxorubicina es un medicamento de quimioterapia. Se requiere un equipo de protección personal (EPP) adecuado y los residuos deben eliminarse en contenedores de residuos de riesgo biológico.
3. Modulación de la vía de la muesca
- Tratar embriones de pez cebra con el inhibidor de la vía de la muesca (2S)-N-[(3,5-difluorofenil)acetil]-L-aanyl-2-fenil]glycine 1,1-dimetiletilo éster (DAPT) a una concentración de 10 m en el medio de agua de pescado E3 de 3-6 dpf.
- Microinyectar los efectos de la muesca aguas abajo Notch dominio intracelular (NICD) y Neuregulin-1 (Nrg-1) mRNA a concentraciones de 10 pg/nL y 5 pg/nL, respectivamente, en los embriones de pez cebra de 1 célula8,10.
NOTA: La microinyección se realiza bajo un microscopio con el apoyo de una bomba de aire para controlar con precisión el volumen inyectado. La microinyección de ARNm en la célula se realiza cuando el óvulo fertilizado está en la primera etapa celular. Para obtener más información sobre la preparación y la secuencia de los ARNm, véase Chen et al.8. Para obtener más información sobre la microinyección y la preparación de agujas inyectables, véase Rosen et al.10.
4. Sincronización de imágenes Y post-imagen LSFM
- Para las técnicas de imagen LSFM y el algoritmo de sincronización post-imagen, ver detalles en las publicaciones anteriores9,11.
NOTA: Brevemente, nuestro sistema utiliza un láser de onda continua como fuente de iluminación para crear imágenes de todas las líneas transgénicas de peces cebra. El módulo de detección se compone de dos cámaras científicas complementarias de semiconductores de óxido metálico (sCMOS) y dos conjuntos de filtros para imágenes de doble canal. El módulo de detección se instala perpendicularmente en el plano de iluminación. Cada trama LSFM se adquiere dentro de un tiempo de exposición de 20 ms, mientras que la potencia de resolución en sección transversal es de 0,65 m y el tamaño del paso entre fotogramas consecutivos es de 2 m. Se utilizó un láser de 589 nm para excitar señales fluorescentes mCherry.
5. Reconstrucción del corazón sistólico y diastólico 3D
- Abra la carpeta creada por el algoritmo de sincronización posterior y, a continuación, abra la carpeta "Salida". Seleccione el plano central del corazón y cargue toda la carpeta en ImageJ. Encuentre la primera fase diastólica y sistólica y registre el número de fotograma.
- Abra la carpeta "Salida/Por estado" y busque las carpetas que tienen los mismos números que los números de fotograma que acaba de grabar. Convierta las imágenes de la carpeta en archivos TIFF 3D (formato de archivo de imagen etiquetado) y asímóceles "diastole.tif" y "systole.tif".
6. Segmentación del ventrículo
- Abra el software de análisis de imágenes (consulte Tabla de materiales). Haga clic en Archivo (File) ? Abra los datosy cargue "diastole.tif" y "systole.tif". Introduzca el tamaño del voxel de acuerdo con la configuración de imagen.
NOTA: Para el sistema LSFM utilizado, el tamaño típico de los vóxeles es de 0,65 ám x 0,65 ám x 2 m. - Haga clic en el panel "SEGMENTATION"y segmente manualmente la parte del ventrículo del corazón. La herramienta incorporada"Umbral"que puede seleccionar todas las regiones por encima de una cierta intensidad puede facilitar este proceso. El ventrículo es la cámara más gruesa con una fluorescencia más fuerte.
NOTA: Asegúrese de extraer el canal auriculoventricular y el tracto de salida en el ventrículo segmentado, ya que esto afecta el análisis de desplazamiento. - Una vez finalizada la segmentación, haga clic en el panel"Proyecto". Haga clic con el botón derecho en ladiastola .. Labels.tif" y "systole. Labels.tif" pestañas en la consola y haga clic en "Exportar datos como" para guardar los datos como archivos TIFF 3D.
7. Creación de paralelepípedos rectangulares para el registro de imágenes
- Ejecute "prepImage_1.m" en el entorno de programación (consulte Tabla de materiales). Abra "prepImage_1.m", "ImPath" en la línea 5 para que la carpeta contenga los archivos TIFF originales y segmentados, y cambie "sector" en la línea 4 al número de sectores de los archivos 3D tif.
- Después de ejecutar el código, generará cinco nuevos archivos TIFF 3D ("test.tif", "diastole_200.tif", "systole_200.tif", "diaLabel.tif" y "sysLabel200.tif") así como dos carpetas nuevas ("resample_dia" y "resample_sys").
8. Remuestrear los corazones 3D sistólicos y diastólicos a lo largo del plano de eje corto
- Importe los cinco archivos TIFF 3D al software de análisis de imágenes (consulte Tabla de materiales).
NOTA: El tamaño del voxel no cambia. - Vaya al panel MULTIPLANAR. Elija "diastole_200.tif" como datos principales. Alinee el eje X (la línea verde en el plano XY) con el eje largo vertical del ventrículo y alinee el eje Z (la línea roja en el plano YZ) con el eje largo horizontal del ventrículo.
NOTA: El eje largo vertical se determina mediante la búsqueda del eje más largo que conecta el ápice y el tracto de salida en el plano XY, y el eje largo horizontal se determina mediante la búsqueda del eje más largo que conecta el ápice y el tracto de salida en el plano YZ. Gire el eje colocando el cursor al final del eje. - Elija tres puntos aleatorios del plano YZ oblicuo (el plano de eje corto) en sentido contrario a las agujas del reloj y registre sus coordenadas de posición 3D.
NOTA: Asegúrese de que los puntos se eligen en sentido contrario a las agujas del reloj. - Repita los pasos 8.2 y 8.3 para "systole_200.tif".
- Haga clic en el panel "PROYECTO". Cree un objeto "Slice" para "diastole_200.tif" haciendo clic con el botón derecho en "diastole_200.tif" y buscando el objeto"Slice". Haga clic izquierdo en el objeto Slice que acaba de crear, y en el panel Propiedades . Opciones, marque"Establecer plano"y elija tres puntos en "Definiciónde plano ". Introduzca las coordenadas de los tres puntos del paso 7.3.
- Repita el paso 8.5 para "systole_200.tif".
NOTA: El objeto de sector creado debe tener el nombre "Slice 2". - Haga clic con el botón derecho en "diastole_200.tif" y busque"Remuestretransform Transformed Image"y cree el objeto. En el panel Propiedades, elija "Sector" como la "Referencia" y haga clic en Aplicar. Esto debería generar un objeto denominado "diastole_200.transformed".
- Haga clic con el botón derecho en "diastole_200.transformed" y busque "Resample" y cree el objeto. Elija " Tamaño deVoxel" como el "Modo" y cambie " Tamaño deVoxel" para ser x - 1, y - 1, y z - 1 en el panel Propiedades.
- Haga clic en "Aplicar". Esto debería generar un objeto denominado "diastole_200.resampled". Haga clic con el botón derecho en "diastole_200.resampled" y guárdelo como un archivo TIFF 3D.
- Repita el mismo paso para "diaLabel.tif" y "test.tif". Guarde "diaLabel.resampled" y "test.resampled" como archivos TIFF 3D. Repita el mismo paso para "systole_200.tif", "sysLabel.tif" y "test.tif" usando "Slice 2" como referencia y guarde "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" y "test2.resampled" como archivos TIFF 3D.
NOTA: Asegúrese de que hay un total de seis archivos TIFF guardados en este paso.
9. División del corazón remuestreado
- Importe los seis archivos remuestreados del paso 8 a ImageJ. Seleccione una rebanada de "systole_200.remuestreado" en la que se visualice claramente el canal auriculoventricular. Registre el número del sector.
- Utilice la"Imagen" Transformar ? Gire" función de ImageJ para que el canal auriculoventricular sea vertical. Aplique la misma rotación a todos los archivos. Cierre todas las ventanas y guarde todos los cambios.
- Mueva "diastole_200.resampled", "diaLabel.resampled" y "test.resampled" a la carpeta "resample_dia" y mueva "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" y "test2.resampled" a la carpeta "resample_sys".
- Abra "divider_2_8_pieces.m". Cambie "ImPath" en la línea 5 y "ImPath" en la línea 395 al directorio de imágenes. Cambie la variable"Medio"en la línea 22 y la línea 411 a los números de la rebanada donde el canal auriculoventricular se visualiza claramente en "systole_200.remuestreado" y "diastole_200.remuestreado".
- Ejecute el código, y en las ventanas le orantes haga clic una vez en el centro del ventrículo y haga clic una vez en el centro del canal auriculoventricular. Esto debe hacerse dos veces para las imágenes de sístole y diastole.
10. Registro de matrices de imágenes sistólicas y diastólicas
- Abra "register_3.m" y cambie "ImPath"en la línea 4 a la ruta de la carpeta de imágenes. Puede tardar entre 5 y 20 minutos en ejecutar este código en función de la potencia de cálculo del sistema.
NOTA: Los paralepípedos rectangulares creados artificialmente en el paso 7 se utilizan para el registro rígido 3D que preserva la distancia entre dos puntos y ángulos suscritos por tres puntos. Cuando el paralelepípedo rectangular end-diastole (rojo) se registra en el paralelepípedo rectangular de la sistole final (verde), la ubicación 3D discreta subsiguiente permite la derivación de una matriz única de transformación rígida que consiste en la rotación y la traslación de la matriz de diástole final a la matriz de sistolia final(Figura 1H). Realizamos el registro y la minimización de energía regularizada para eliminar el ruido de la matriz después de la transformación utilizando una caja de herramientas de procesamiento de imágenes (ver Tabla de Materiales). Para una descripción matemática detallada, véase Chen et al.8.
11. Salida de los vectores de desplazamiento
- Abra "displacement_4.m" y cambie "ImPath" en la línea 4 a la ruta de la carpeta de imágenes.
- Ejecute "displacement_4.m", que genera un archivo "vector8.txt" en la carpeta "vectores". Una vez que el archivo "vector8.txt" está abierto, habrá una matriz de 8 x 4. Cada fila de la matriz tiene cuatro números, que son las magnitudes del componente X, el componente Y, el componente Z y la magnitud SUM del vector de desplazamiento de un segmento específico del ventrículo.
NOTA: El vector de desplazamiento se obtiene calculando el desplazamiento del centroide de masa de cada segmento en el espacio 3D. Calculamos
las coordenadas centroide de masa 3D (PS y PD) (donde k indica la coordenada X, Y o Z, respectivamente) de cada segmento (I-VI) en el dataset de segmentación desde la sístole a la diástole(Figura 1J). Definimos el centroide de masa en el espacio 3D de la siguiente manera:
donde Cx x X, Cy á Y, y Cz a Z, Mi , la masa de cada segmento (I - i - VI), m - el número de vóxeles de cada segmento, y - la función de densidad como la región segmentada es 1 mientras que el resto es 0. La norma L2 de los vectores de subdesplazamiento a lo largo de los ejes X, Y y Z y el vector de desplazamiento de suma se calculan durante el ciclo cardíaco. Hay un total de ocho filas en la matriz. La primera fila y la octava fila contienen el canal auriculoventricular y por lo tanto se ignoran en nuestro análisis. Los segmentos I a VI se representan mediante la segunda fila de la séptima fila.
las coordenadas centroide de masa 3D (PS y PD) (donde k indica la coordenada X, Y o Z, respectivamente) de cada segmento (I-VI) en el dataset de segmentación desde la sístole a la diástole(Figura 1J). Definimos el centroide de 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El proceso mediante el cual se desarrolló EL DIAMANTE para evaluar la función cardíaca segmental 3D se presenta en la Figura 1. Tras la adquisición y reconstrucción de imágenes LSFM en 3D del corazón de pez cebra embrionario(Figura 1A),el plano de eje corto verdadero se determinó como el plano perpendicular a los ejes largos verticales y horizontales, ambos determinados en un visor multiplano(Figura 1B). El corazón fue remuestreado a lo largo del plano del eje corto(Figura 1C),y se dividió en ocho segmentos iguales constituidos por ángulos uniformes según una línea de división virtual (línea de puntos rojo) que conecta el centro de la cavidad ventricular endocardial con el centro del canal auriculoventricular(Figura 1E). Las representaciones 3D de los segmentos identificados se ilustran en una vista transversal(Figura 1F) y en comparación con los datos sin procesar (Figura 2). Los segmentos VII y VIII se eliminaron del análisis porque abarcan el canal auriculoventricular y, por lo tanto, contienen menos miocardio en comparación con otros segmentos. Los diferentes planos de remuestreo para la sistole final (HS)y la diastola final (HD) conducen a sistemas de coordenadas distintos para las matrices diastólicas finales y diastólicas finales, que deben registrarse para restaurar su relación espacial original(Figura 1G). El sistema de coordenadas de la matriz sistólica final se eligió como referencia para la coherencia. Para determinar la matriz de transformación (Tm) desde la matriz diastólica final hasta la matriz sistólica final, se creó virtualmente una matriz de tres paralelepípedos, que es asimétrica en 3D y tiene la misma dimensión que la matriz de imagen original. Los paralelepípedos se remuestrearon dos veces, primero en el plano de eje corto de la matriz de sistole final, y luego en el plano de eje corto de la matriz de diastola final, dando lugar a diferentes paralelepípedos transformados para la sistole final (verde) y el extremo diastolia (rojo)(Figura 1H).
Los paralepípedos verdes y rojos fueron registrados juntos por un algoritmo de registro de cuerpo rígido y Tm se calculó y aplicó a la matriz de diastolato final para restaurar las coordenadas(Figura 1I). Este proceso permite el seguimiento posterior en el espacio 3D de los vectores de desplazamiento de los centroides de masa de cualquier segmento del ventrículo durante el ciclo cardíaco(Figura 1J). El desplazamiento DIAMOND de los segmentos ventriculares I–VI se puede rastrear durante múltiples puntos de tiempo en el ciclo cardíaco(Figura 1K), que se puede simplificar para el análisis cuantitativo a dos puntos de tiempo que van desde la sistole final hasta la diastolade final(Figura 1L). Los segmentos generados por DIAMOND se pueden visualizar en la Figura 2,donde cada color representa un segmento cardíaco.
Con DIAMOND, descubrimos heterogeneidad segmental de la función cardíaca y la susceptibilidad a lesiones miocárdicas inducidas por doxorubicina en peces cebra. Tras un tratamiento de 24 horas con doxorubicina de 10 m de 3-4 dpf(Figura 3A),comparamos el desplazamiento DIAMOND de segmentos ventriculares entre grupos de control y tratados con quimioterapia(Figura 3B)y 48 h después del tratamiento(Figura 3C). Todas las figuras DIAMOND siguen el mismo patrón gráfico que los ventrículos remuestreados a lo largo del eje corto(Figura 1E). Los datos se presentan como porcentajes normalizando la norma L2 del vector de desplazamiento al perímetro interno del corazón, con los componentes X (verde), Y (azul) y Z (naranja) ilustrados como sus contribuciones ponderadas. A 4 dpf, la norma L2 promedio de los vectores de desplazamiento segmental en los peces de control osciló entre 6,6 y 11,3 m, o entre el 3,8 y el 6,6% después de la normalización. Nuestros resultados indican que, en condiciones de control, los segmentos basales I y VI experimentan los desplazamientos más grandes y son los más susceptibles a la lesión cardíaca inducida por doxorubicina(Figura 3B,29% disminución de 6.6–4.7%, n a 10 control y n a 8 doxorubicina, p < 0.01). A 6 dpf, la norma L2 promedio de los vectores de desplazamiento segmental en el pez de control osciló entre 6,8-14 m, o entre el 3,9 y el 8% después de la normalización. A 6 dpf, los segmentos basales I y VI recuperaron el desplazamiento DIAMOND para controlar los niveles, lo que sugiere la regeneración segmentada(Figura 3C,n a 10 control y n a 8 doxorubicina). Paralelamente, se observó un empeoramiento de la cepa basal 2D de -53 a -38% a 4 dpf tras el tratamiento con doxorubicina, seguido de un retorno a los niveles de control a 6 dpf, corroborando los resultados de desplazamiento DIAMOND(Figura 3D, 3E). También se observó una disminución paralela de la fracción de eyección global en respuesta a doxorubicina a 4 dpf con recuperación a 6 dpf(Figura 3F, 3G).
A continuación aplicamos DIAMOND durante el tratamiento con doxorubicina y la modulación de la vía Notch utilizando el inhibidor de la muesca DAPT y el rescate utilizando los efectores de notch aguas abajo NICD y NRG1 mRNA(Figura 4A). La microinyección de ARN MRNA NICD y NRG1 rescató la disminución del desplazamiento diamond y la EF después de una lesión aguda inducida por quimioterapia a 4 dpf(Figura 4B, 4D). La exposición al inhibidor de la muesca DAPT junto con la doxorubicina condujo a una disminución más difusa del desplazamiento DIAMOND, además de los segmentos basales I y VI(Figura 4B). Además, la inhibición de la vía Notch después de una lesión inducida por quimioterapia dificultó aún más la recuperación del desplazamiento DIAMOND de los segmentos basales y EF a 6 dpf. La inhibición fue rescatada por los efectores de notch en sentido descendente NICD y NRG1 (Figura 4C, 4E).
Figura 1: Desarrollo de desplazamiento 4D DIAMOND. (A) Las imágenes crudas fueron capturadas por microscopía fluorescente de hoja de luz. (B y C) El corazón 3D reconstruido se remuestreó a lo largo de la verdadera vista de plano de eje corto. (D) Ilustración esquemática del corazón de pez cebra embrionario. (E y F) ilustraciones 2D y 3D de la división del ventrículo en ocho segmentos excluyendo los segmentos VII y VIII. (G) Los diferentes sistemas de coordenadas de la sistole final y la diástole final después del remuestreo. (H) Se creó un grupo de paralelepípedos rectangulares para la generación de una matriz de transformación (Tm). (I) Sistemas de coordenadas end-sistólicas y diastólicas finales registradas aplicando Tm. (J) Vector de desplazamiento del centroide de masa segmental de la sistole final a la diastole final. (K) Desplazamiento DIAMOND de segmentos ventriculares I–VI seguidos durante múltiples puntos de tiempo en el ciclo cardíaco. (L) desplazamiento DIAMOND de los segmentos ventriculares I–VI de la sístole final a la diatosía final. Esta figura de Chen et al.8 se reproduce con permiso de la Sociedad Americana para la Investigación Clínica (ASCI). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Segmentación DIAMOND del corazón de pez cebra embrionario en comparación con los datos brutos en 3D. El corazón de pez cebra embrionario se dividió en seis segmentos (volúmenes) representados aquí en diferentes colores para el cálculo de desplazamientos DIAMOND (izquierda). El vector de desplazamiento de cada segmento calculado por DIAMOND representa su función cardíaca segmental. La aurícula y el tracto de salida se eliminaron durante la segmentación. Barra de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: DIAMOND desentraña la heterogeneidad segmental en la función cardíaca y la susceptibilidad a lesiones inducidas por quimioterapia. (A) Horario experimental del tratamiento con doxorubicina. (B y C) Comparación segmental de vectores de desplazamiento DIAMOND normalizados con el perímetro miocárdico interno entre grupos de control y doxorubicina tratados a 4 y 6 dpf (pruebas t, **p < 0,01, n a 8–10 por grupo). (D y E) Evaluación de la tensión en la base ventricular que representa una lesión y un patrón de regeneración similares a los vectores de desplazamiento DIAMOND (*p < 0,05, n a 6–8 por grupo). (F y G) Disminución de la fracción de eyección en respuesta a doxorubicina a 4 dpf con recuperación a 6 dpf, siguiendo un patrón similar a los desplazamientos segmentarios DIAMOND a nivel ventricular global (pruebas t, **p < 0,01, barras de error SEM, n a 6–10 por grupo). Esta figura de Chen et al.8 se reproduce con el permiso de la ASCI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Mecánica DIAMOND para la evaluación de la recuperación miocárdica mediada por Notch después de una lesión inducida por doxorubicina. (A) Programación experimental. (B y C) NICD y NRG1 Notch los efectores aguas abajo rescataron la reducción del desplazamiento DIAMOND en los segmentos I y VI a 4 dpf. A 6 dpf, la inhibición de la señalización de muesca por DAPT deterioró la restauración de la función cardíaca segmentaria (ANOVA, **p < 0.01 Dox vs. control;p < 0.05,p < 0.01, Dox + DAPT vs control, n a 6–10 por grupo). (D y E) Fracción de eyección corrobora la mecánica DIAMOND a nivel global (ANOVA, *p < 0.05, **p < 0.01, barras de error SEM, n a 5–11 por grupo). Esta figura de Chen et al.8 se reproduce con el permiso de la ASCI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Una estrategia rigurosa para la cuantificación de la función miocárdica segmentada es fundamental para evaluar la mecánica cardíaca más allá de la EF tradicional, conocida por ser un indicador insensible y retardado de la lesión miocárdica1,4,12. Por lo tanto, ha habido un creciente interés en los marcadores de los primeros cambios miocárdcos, y un creciente cuerpo de literatura apoya los parámetros de deformación miocárdica como un indicador temprano para pronosticar la disfunción ventricular4,13. La medición ecocardiográfica de la tensión ventricular izquierda (LV) proporciona un método establecido de medición de deformación miocárdica13. Sin embargo, las imágenes de cepas basadas en Doppler de tejidos sufren de una serie de deficiencias debido a la dependencia del ángulo y a la variabilidad intraobservador e interobservador14. La ecocardiografía de seguimiento de manchas (STE) puede resolver la deformación de tejido 2D y 3D independiente del ángulo, pero la precisión del seguimiento de manchas 2D se ve afectada por el movimiento a través del plano6,mientras que el seguimiento de manchas 3D requiere una resolución espacial superior para resolver los patrones de interferencia de ultrasonido positivo (manchas) en 3D y alta resolución temporal para rastrear las manchas entre fotogramas15. En el presente protocolo, describimos el desplazamiento DIAMOND como un novedoso parámetro de deformación miocárdica para la cuantificación in vivo de la función cardíaca segmental 4D en el pez cebra. En comparación con la tensión EF y 2D como estándares de referencia, DIAMOND proporciona información adicional de deformación segmental sin verse afectado por el movimiento a través del plano. Mediante la integración de DIAMOND con LSFM 4D, nuestra técnica puede evaluar el vector de desplazamiento de un segmento cardíaco de 20 a 30 m de ancho, lo que actualmente es imposible incluso para el sistema 3D STE más avanzado, que tiene resolución de rango milimétrico16.
Para aplicar DIAMOND, es fundamental tener una comprensión integral de la estructura anatómica del corazón de pez cebra embrionario. Durante la segmentación de la imagen, es esencial que el canal auriculoventricular y el tracto de salida se identifiquen y segmenten correctamente del resto del miocardio cuando el usuario está realizando el paso 6 en el protocolo. Además, los ejes largos horizontales y verticales del ventrículo deben determinarse con precisión para derivar el plano de eje corto verdadero para el remuestreo de imagen en el paso 8.
El principal factor limitante de la aplicación diamond es la segmentación manual del ventrículo, que se convierte en lento cuando es posible que sea necesario evaluar varias fases durante el ciclo cardíaco. Con el avance del aprendizaje automático y las redes neuronales, se podría integrar un método automatizado de segmentación cardiaca17,18,19,20 para proporcionar monitorización de la función cardíaca segmenta durante todo el ciclo cardíaco. Otras aplicaciones de DIAMOND también incluyen la integración con ecocardiografía, micro-CT o micro-RM, adecuado en modelos animales más grandes para la evaluación multiescala de lesiones cardíacas y regeneración21. Sin embargo, el método requerirá primero adaptación a la presencia de fibras miocárdicas que conduzca a una deformación cardíaca más compleja, incluida la torsión en mamíferos22,23.
En general, DIAMOND proporciona un método novedoso para evaluar la función cardíaca segmentaria en peces cebra embrionarios en condiciones fisiológicas y patológicas y puede utilizarse como plataforma para el cribado in vivo de alto rendimiento de las vías asociadas toxicidad cardíaca inducida por quimioterapia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores han declarado que no existe ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
El presente trabajo fue financiado por las subvenciones de la Asociación Americana del Corazón 16SDG30910007 y 18CDA34110338, y por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones HL083015, HL111437, HL118650 y HL129727.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira6 | FEI | Image analyzing software | |
| DAPT | Millipore Sigma | D5942-5MG | |
| Doxorubicin hydrochloride | Millipore Sigma | D1515-10MG | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Millipore Sigma | E10521-10G | Tricaine |
| MATLAB | MathWorks | Programming environment | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MathWorks | Image processing toolbox |
References
- Ewer, M. S., Ewer, S. M.
- Thavendiranathan, P., Wintersperger Bernd, J., Scott, F. D., Thomas D, M. H. Cardiac MRI in the Assessment of Cardiac Injury and Toxicity From Cancer Chemotherapy. Circulation: Cardiovascular Imaging. 6 (6), 1080-1091 (2013).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Thavendiranathan, P., et al. Use of Myocardial Strain Imaging by Echocardiography for the Early Detection of Cardiotoxicity in Patients During and After Cancer Chemotherapy. A Systematic Review. 63 (25), Part A 2751-2768 (2014).
- Collier, P., Phelan, D., Klein, A. A Test in Context: Myocardial Strain Measured by Speckle-Tracking Echocardiography. Journal of the American College of Cardiology. 69 (8), 1043-1056 (2017).
- Hanekom, L., Cho, G. Y., Leano, R., Jeffriess, L., Marwick, T. H. Comparison of two-dimensional speckle and tissue Doppler strain measurement during dobutamine stress echocardiography: an angiographic correlation. European Heart Journal. 28 (14), 1765-1772 (2007).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Chen, J., et al. Displacement analysis of myocardial mechanical deformation (DIAMOND) reveals segmental susceptibility to doxorubicin-induced injury and regeneration. JCI Insight. 4 (8), e125362 (2019).
- Messerschmidt, V., et al. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Journal of Visualized Experiments. (138), e57763 (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Lenneman, C. G., Sawyer, D. B. Cardio-Oncology: An Update on Cardiotoxicity of Cancer-Related Treatment. Circulation Research. 118 (6), 1008-1020 (2016).
- Geyer, H., et al. Assessment of Myocardial Mechanics Using Speckle Tracking Echocardiography: Fundamentals and Clinical Applications. Journal of the American Society of Echocardiography. 23 (4), 351-369 (2010).
- Castro, P. L., Greenberg, N. L., Drinko, J., Garcia, M. J., Thomas, J. D. Potential pitfalls of strain rate imaging: angle dependency. Biomedical Sciences Instrumentation. 36, 197-202 (2000).
- Seo, Y., Ishizu, T., Aonuma, K. Current Status of 3Dimensional Speckle Tracking Echocardiography: A Review from Our Experiences. Journal of Cardiovascular Ultrasound. 22 (2), 49-57 (2014).
- Amzulescu, M. S., et al. Improvements of Myocardial Deformation Assessment by Three-Dimensional Speckle-Tracking versus Two-Dimensional Speckle-Tracking Revealed by Cardiac Magnetic Resonance Tagging. Journal of the American Society of Echocardiography. 31 (9), 1021-1033 (2018).
- Wolterink, J. M., Leiner, T., Viergever, M. A., Išgum, I. Reconstruction, Segmentation, and Analysis of Medical Images. Zuluaga, M. A., et al. , Springer International Publishing. 95-102 (2016).
- Avendi, M. R., Kheradvar, A., Jafarkhani, H. A combined deep-learning and deformable-model approach to fully automatic segmentation of the left ventricle in cardiac MRI. Medical Image Analysis. 30, 108-119 (2016).
- Packard, R. R. S., et al. Automated Segmentation of Light-Sheet Fluorescent Imaging to Characterize Experimental Doxorubicin-Induced Cardiac Injury and Repair. Scientific Reports. 7 (1), 8603 (2017).
- Jay Kuo, C. C., Chen, Y.
- Natarajan, N., et al. Complement Receptor C5aR1 Plays an Evolutionarily Conserved Role in Successful Cardiac Regeneration. Circulation. 137 (20), 2152-2165 (2018).
- Zhukov, L., Barr, A. H. IEEE Visualization VIS 2003. , 597-602 (2003).
- Nielles-Vallespin, S., et al. In vivo diffusion tensor MRI of the human heart: Reproducibility of breath-hold and navigator-based approaches. Magnetic Resonance in Medicine. 70 (2), 454-465 (2013).
