Summary
Målet med denne protokollen er å detaljere en ny metode for vurdering av segmental hjertefunksjon i embryonale sebrafisk under både fysiologiske og patologiske forhold.
Abstract
Sebrafisk blir i økende grad brukt som modellorganisme for kardiomyopatier og regenerering. Nåværende metoder som evaluerer hjertefunksjonen, klarer ikke å på en pålitelig måte oppdage segmental mekanikk og er ikke lett gjennomførbare i sebrafisk. Her presenterer vi en halvautomatisert, åpen kildekode-metode for kvantitativ vurdering av firedimensjonal (4D) segmental hjertefunksjon: forskyvningsanalyse av myokardmekanisk deformasjon (DIAMOND). Transgene embryonale sebrafisk ble avbildet in vivo ved hjelp av et lysark fluorescens mikroskopisystem med 4D hjertebevegelsesynkronisering. Kjøpte 3D digitale hjerter ble rekonstruert ved ende-systole og end-diastole, og ventrikkelen ble manuelt segmentert i binære datasett. Deretter ble hjertet reorientert og isotropisk resamplet langs den sanne korte aksen, og ventrikkelen ble jevnt delt inn i åtte porsjoner (I-VIII) langs den korte aksen. På grunn av de forskjellige omsamplingsflyene og matrisene ved endesystole og end-diastole, ble det søkt om bilderegistrering for å gjenopprette det opprinnelige romlige forholdet mellom de omsamplede systolisk og diastoliske bildematrisene. Etter bilderegistrering ble forskyvningsvektoren av hvert segment fra endesystole til end-diastole beregnet basert på forskyvning av massecentroider i tre dimensjoner (3D). DIAMOND viser at basal myokardsegmenter ved siden av attriventrikulær kanal gjennomgår den høyeste mekaniske deformasjonen og er mest utsatt for doksorubicin-indusert hjerteskade. Samlet sett gir DIAMOND ny innsikt i segmental hjertemekanikk i sebrafiskembryoer utover tradisjonell ejeksjonsfraksjon (EF) under både fysiologiske og patologiske forhold.
Introduction
Kjemoterapi-indusert hjertetoksisitet og påfølgende hjertesvikt er en av hovedårsakene til kjemoterapiseponering1. Derfor spiller hjertefunksjonell vurdering en avgjørende rolle i identifiseringen av hjertetoksisitet og, enda viktigere, i prediksjon av tidlig hjerteskade etter kjemoterapi2. Imidlertid møter dagens tilnærminger for hjertefunksjonell vurdering begrensninger. Metoder som venstre ventrikulær utstøting fraksjon (LVEF) gir bare global og ofte forsinket hjertemekanikk etter skade3,4. Tissue Doppler imaging gir segmental myokard deformasjonsinformasjon, men lider av betydelig intraobserver og interobserver variabilitet, delvis på grunn av ultralyd strålevinkelavhengighet5. Todimensjonal (2D) speckle sporing benytter B-modus for ekkokardiografi, som teoretisk eliminerer vinkelavhengigheten, men nøyaktigheten er begrenset av ut-av-plan bevegelse6. Derfor mangler en streng tilnærming for kvantifiserende segmental hjertefunksjon i både forskning og kliniske innstillinger.
I denne sammenheng utviklet vi en 4D kvantifiseringsmetode for analyse av segmental hjertefunksjon som vi kalte forskyvningsanalyse av myokardmekanisk deformasjon (DIAMOND), for å bestemme forskyvningsvektorene av myokardmassecentroider i 3D-rommet. Vi søkte DIAMOND for in vivo vurdering av hjertefunksjon og doksorubicin-indusert hjertetoksisitet med sebrafisk (Danio rerio) som dyremodell, valgt på grunn av deres regenererende myokardium og høyt bevarte utviklingsgener7. Vi sammenlignet videre segmental DIAMOND-forskyvning med global ejeksjonsfraksjon (EF) bestemmelse og 2D-belastning etter behandling med doksorubicin. Ved å integrere DIAMOND-forskyvning med 4D lysark fluorescerende mikroskopi (LSFM) ervervet gjengivelse av embryonale sebrafisk hjerter, diamond viser at basal myokard segmenter ved siden av atrioventrikulær kanalen gjennomgå den høyeste mekaniske deformasjon og er mest utsatt for akutt dorubxoicin hjerteskade8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder som er beskrevet her, er godkjent av UCLA Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), og eksperimenter ble utført i samsvar med protokoller godkjent av UCLA Office of Animal Research.
1. Avl Tg (cmlc2:mCherry) sebrafisk og samling av embryoer
- Følg bolig-, avls- og embryoinnsamlingsprosedyrene som beskrevet i tidligere etablerte husdyrhold og avlspraksis. For detaljer, se Messerschmidt et al.9.
- Behandle de innsamlede embryoene med 0,003 % 1-fenyl-2-thiourea (PTU) i E3 medium 18 h postfertilisering for å opprettholde gjennomsiktigheten av embryoene for LSFM-avbildning.
2. Behandling med Doxorubicin for å indusere hjerteskade
- Ved 3 dager etterfertilisering (dpf), behandle embryoene med doksorubicin i en konsentrasjon på 10 μM i E3 fiskevannmedium. Etter en 24 timer behandling til 4 dpf, skift ut doksorubicinmediet med friskt E3-medium.
FORSIKTIG: Doxorubicin er en kjemoterapi medisiner. Egnet personlig verneutstyr (PPE) er nødvendig og avfallet skal kastes i biohazard avfallsbeholdere.
3. Hakk banemodulasjon
- Behandle sebrafiskembryoer med Hakk-banehemmeren (2S)-N-[(3,5-difluorolenyl)acetyl]-L-alanyl-2-fenyl]glycin 1,1-dimetyletylester (DAPT) ved en konsentrasjon på 10 μM i E3 fiskevann medium fra 3–6 dpf.
- Mikroinjiser hakk nedstrøms effektorer Hakk intracellulært domene (NICD) og Neuregulin-1 (Nrg-1) mRNA ved konsentrasjoner på henholdsvis 10 pg/nL og 5 pg/nL i 1-cellestadiet sebrafiskembryoer8,10.
MERK: Mikroinjeksjonen utføres under et mikroskop med støtte fra en luftpumpe for å kontrollere volumet som injiseres nøyaktig. MRNA mikroinjeksjon i cellen er gjort når det befruktede egget er på første cellestadium. For detaljer om forberedelse og sekvens av mRNAs, se Chen et al.8. For detaljer om mikroinjeksjon og tilberedning av injeksjonsnåler, se Rosen et al.10.
4. LSFM-avbildning og synkronisering etter bildebehandling
- For LSFM-bildeteknikker og synkroniseringsalgoritmen etter bildebehandling, kan du se detaljer i tidligere publikasjoner9,11.
MERK: Kort, vårt system benytter en kontinuerlig bølge laser som belysning kilde for å bilde alle transgene sebrafisk linjer. Deteksjonsmodulen består av to vitenskapelige komplementære metalloksid halvleder (sCMOS) kameraer og to sett med filtre for tokanals bildebehandling. Deteksjonsmodulen er vinkelrett installert på belysningsplanet. Hver LSFM ramme er anskaffet innen en 20 msec eksponeringstid, mens løsekraften i tverrsnitt er ~ 0,65 μm og trinnstørrelsen mellom sammenhengende rammer er ~ 2 μm. En 589 nm laser ble brukt til å opphisse mCherry fluorescerende signaler.
5. Rekonstruksjon av 3D systolisk og diastolisk hjerte
- Åpne mappen som er opprettet av postsynkroniseringsalgoritmen, og åpne deretter mappen"Utdata". Velg midtplanet i hjertet, og legg hele mappen i ImageJ. Finn den første diastoliske og systolisk fasen, og registrer rammenummeret.
- Åpne mappen "Utdata/etter tilstand" og finn mappene som har de samme tallene som rammenumrene som nettopp er registrert. Konverter bildene i mappen til 3D TIFF (tagged bilde filformat) filer og navngi dem "diastole.tif" og "systole.tif".
6. Segmentering av ventrikkelen
- Åpne bildeanalyseprogramvaren (se Materialtabell). Klikk på Fil | Åpne data,og last "diastole.tif" og "systole.tif". Angi voxel-størrelsen i henhold til bildeinnstillingene.
MERK: For LSFM-systemet som brukes, er den typiske voxelstørrelsen 0,65 μm x 0,65 μm x 2 μm. - Klikk på"SEGMENTERING"-panelet og segmenter ventrikkeldelen av hjertet manuelt. Det innebygde "Threshold"-verktøyet som kan velge alle regionene over en viss intensitet, kan lette denne prosessen. Ventrikkelen er det tykkere kammeret med en sterkere fluorescens.
MERK: Sørg for å fjerne den atromikkeliske kanalen og utstrømningskanalen i segmentert ventrikkel, fordi dette påvirker forskyvningsanalysen. - Når segmenteringen er ferdig,klikker du på "Prosjekt"-panelet. Høyreklikk på"diastole. Etiketter.tif" og "systole. Labels.tif" faner i konsollen og klikk"Eksporter data som"for å lagre dataene som 3D TIFF-filer.
7. Opprettelse av rektangulære parallellrør for bilderegistrering
- Kjør "prepImage_1.m" i programmeringsmiljøet (se Materialtabell). Åpne "prepImage_1.m", "ImPath" i linje 5 slik at mappen inneholder de opprinnelige og segmenterte TIFF-filer, og endre "skive" i linje 4 til antall skiver av 3D tif filer.
- Etter å ha kjørt koden, vil den generere fem nye 3D TIFF-filer ("test.tif", "diastole_200.tif", "systole_200.tif", "diaLabel.tif" og "sysLabel200.tif") samt to nye mapper ("resample_dia" og "resample_sys").
8. Prøv systolisk og diastoliske 3D-hjerter langs det korte akseplanet
- Importer alle fem 3D TIFF-filer til bildeanalyseprogramvaren (se Materialtabell).
MERK: Voxel-størrelsen er uendret. - Gå til MULTIPLANAR-panelet. Velg "diastole_200.tif" som primærdata. Juster X-aksen (den grønne linjen i XY-planet) etter den vertikale lange aksen på ventrikkelen, og juster Z-aksen (den røde linjen i YZ-planet) etter den horisontale lange aksen på ventrikkelen.
MERK: Den vertikale lange aksen bestemmes ved å finne den lengste aksen som forbinder toppunktet og utstrømningskanalen i XY-planet, og den horisontale lange aksen bestemmes ved å finne den lengste aksen som forbinder toppunktet og utstrømningskanalen i YZ-flyet. Roter aksen ved å plassere markøren på slutten av aksen. - Velg tre tilfeldige punkter fra det skrå YZ-flyet (det korte akseplanet) på en moturvis måte og registrere sine 3D-posisjonskoordinater.
MERK: Kontroller at punktene er valgt på en moturvis måte. - Gjenta trinn 8.2 og 8.3 for "systole_200.tif".
- Klikk på"PROJECT"-panelet. Opprett et"Slice"-objekt for "diastole_200.tif" ved å høyreklikke på "diastole_200.tif" og søke etter"Slice"-objektet. Venstre klikk på Slice-objektet nettopp opprettet, og i Egenskaper-panelet | Valg, sjekk "Sett plan" og velg tre punkter i "Plane Definition". Angi koordinatene for de tre punktene fra trinn 7,3.
- Gjenta trinn 8.5 for "systole_200.tif".
MERK: Slice-objektet som er opprettet, skal ha navnet "Slice 2". - Høyreklikk "diastole_200.tif" og søk etter "Prøv på nytt transformert bilde"og opprett objektet. I Egenskaper-panelet velger du"Slice" som"Referanse"og klikker på Bruk. Dette bør generere et objekt som heter "diastole_200.transformed".
- Høyreklikk "diastole_200.transformed" og søk etter "Prøv på nytt" og opprett objektet. Velg"Voxel Size" som"Mode"og endre "Voxel Size" for å være x = 1, y = 1 og z = 1 i Egenskaper-panelet.
- Klikk "Bruk". Dette bør generere et objekt med navnet "diastole_200.resampled". Høyreklikk "diastole_200.resampled" og lagre den som en 3D TIFF-fil.
- Gjenta det samme trinnet for "diaLabel.tif" og "test.tif". Lagre "diaLabel.resampled" og "test.resampled" som 3D TIFF-filer. Gjenta det samme trinnet for "systole_200.tif", "sysLabel.tif" og "test.tif" ved hjelp av "Slice 2" som referanse, og lagre "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" og "test2.resampled" som 3D TIFF-filer.
MERK: Kontroller at det er totalt seks TIFF-filer lagret i dette trinnet.
9. Deling av det omsamplede hjertet
- Importer alle seks samplede filer på nytt fra trinn 8 til ImageJ. Velg et stykke "systole_200.resampled" der attriventrikulær kanal er tydelig visualisert. Registrer nummeret på stykket.
- Bruk"Bilde | Transform | Roter" funksjonen til ImageJ slik at den atriventrikulære kanalen er vertikal. Bruk samme rotasjon på alle filer. Lukk alle vinduer og lagre alle endringer.
- Flytt "diastole_200.resampled", "diaLabel.resampled" og "test.resampled" til mappen "resample_dia", og flytt "systole_200.resampled", "sysLable.resampled" og "test2.resampled" til mappen "resample_sys".
- Åpent "divider_2_8_pieces.m". Endre "ImPath" i linje 5 og "ImPath" i linje 395 til bildekatalogen. Endre variabelen "Midten" i linje 22 og linje 411 til skivetallene der attrioventrikulær kanalen er tydelig visualisert i "systole_200.resampled" og "diastole_200.resampled".
- Kjør koden, og i de tilskyndede vinduene klikker du én gang i midten av ventrikkelen og klikker én gang i midten av attriventrikulær kanalen. Dette må gjøres to ganger for både systole og diastole bilder.
10. Registrering av systolisk og diastolisk bilde matriser
- Åpne "register_3.m" og endre "ImPath" i linje 4 til bildemappebanen. Det kan ta 5–20 min å kjøre denne koden, avhengig av systemets beregningskraft.
MERK: Kunstig opprettede rektangulære parallellrør i trinn 7 brukes til 3D-stiv registrering som bevarer avstanden mellom to punkter og vinkler som abonneres med tre poeng. Når den sluttdiagnostiserede rektangulære parallellrøret (rød) er registrert på endesystole rektangulær parallelle (grønn), tillater den påfølgende diskrepant 3D-plasseringen avledning av en unik matrise av stiv transformasjon bestående av rotasjon og oversettelse fra endediastjalmatrisen til end-systole matrise (Figur 1H). Vi utfører registrering og regularisert energiminimering for å denoise matrisen etter transformasjonen ved hjelp av en bildebehandlingsverktøykasse (se Materialtabell). For en detaljert matematisk beskrivelse, vennligst se Chen et al.8.
11. Utgang av forskyvningvektorer
- Åpne "displacement_4.m" og endre "ImPath" i linje 4 til bildemappebanen.
- Kjør "displacement_4.m", som genererer en "vector8.txt" fil i mappen "vektorer". Når "vector8.txt"-filen er åpen, vil det være en 8 x 4 matrise. Hver rad i matrisen har fire tall, som er størrelsene på X-komponenten, Y-komponenten, Z-komponenten og SUMMER-størrelsen på forskyvningsvektoren til et bestemt segment av ventrikkelen.
MERK: Forskyvningsvektoren oppnås ved å beregne forskyvningen av massecentroiden til hvert segment i 3D-rom. Vi beregner 3D mass centroid (PS og PD)
koordinater (der k indikerer x, Y eller Z koordinate, henholdsvis) av hvert segment (I-VI) i segmentering datasettet fra systole til diastole (Figur 1J). Vi definerer massecentroid i 3D-rom som følger:
der Cx = X, Cy = Y og Cz = Z, Mi = massen i hvert segment (I ≤ i ≤ VI), m = antall voxels av hvert segment, og ρ = tetthetsfunksjonen som den segmenterte regionen er 1 mens resten er 0. L2-normen for sub-forskyvningvektorene langs X-, Y-og Z-aksene og sumforskyvningsvektoren beregnes under hjertesyklusen. Det er totalt åtte rader i matrisen. Den første raden og den åttende raden inneholder attriventrikulær kanal og blir dermed ignorert i vår analyse. Segmenter I til VI representeres av den andre raden til syvende rad.
koordinater (der k indikerer x, Y eller Z koordinate, henholdsvis) av hvert segment (I-VI) i segmentering datasettet fra systole til diastole (Figur 1J). Vi definerer massecentroid 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prosessen som DIAMOND ble utviklet for å vurdere 3D segmental hjertefunksjon er presentert i figur 1. Etter LSFM bildeoppkjøp og rekonstruksjon i 3D av embryonale sebrafisk hjerte (Figur 1A),ble den sanne korte aksen flyet bestemt som flyet vinkelrett på de vertikale og horisontale lange aksene, som begge bestemmes i en flerplanbetrakter (Figur 1B). Hjertet ble deretter samplet på nytt langs det korte akseplanet (figur 1C),og delt inn i åtte like segmenter som utgjorde av jevne vinkler i henhold til en virtuell divisjonslinje (rød stiplet linje) som forbinder midten av det endocardiale ventrikulære hulrommet til midten av atriventrikulær kanalen (Figur 1E). 3D-avbildningene av de identifiserte segmentene er illustrert i en tverrsnittsvisning (figur 1F) og i sammenligning med rådataene (figur 2). Segmenter VII og VIII ble fjernet fra analysen fordi de omfatter den atromikkelkanalen og dermed inneholder mindre myokarkort sammenlignet med andre segmenter. De forskjellige resamplingsflyene for end-systole (HS) og end-diastole (HD) fører til distinkte koordinatsystemer for sluttsystolisk og endediastoliske matriser, som må registreres for å gjenopprette sitt opprinnelige romlige forhold (figur 1G). Koordinatsystemet for den endesystoliske matrisen ble valgt som referanse for konsistens. For å bestemme transformasjonsmatrisen (Tm) fra den endediastoliske matrisen til den sluttsystoliske matrisen, ble en matrise med tre parallellrør, som er asymmetrisk i 3D og har samme dimensjon som den opprinnelige bildematrisen, nesten opprettet. Parallellrørene ble samplet to ganger, først i kortakseplanet på end-systole matrisen, og deretter i kortakseplanet av endediastolmatrisen, noe som førte til forskjellige forvandlede parallellrør for endesystole (grønn) og end-diastole (rød) (Figur 1H).
De grønne og røde parallellrørene ble deretter registrert sammen av en stiv kroppsregistreringsalgoritme og Tm ble beregnet og brukt på end-diastole matrisen for å gjenopprette koordinatene (Figur 1I). Denne prosessen tillater etterfølgende sporing i 3D-rommet av forskyvningvektorer av massecentroider fra et hvert segment av ventrikkelen under hjertesyklusen (Figur 1J). DIAMOND forskyvning av ventrikulære segmenter I-VI kan spores under flere tidspunkter i hjertesyklusen (Figur 1K), som kan forenkles for kvantitativ analyse til to tidspunkter som spenner fra endesystole til end-diastole (Figur 1L). Segmentene generert av DIAMOND kan visualiseres i figur 2, der hver farge representerer ett hjertesegment.
Med DIAMOND avdekket vi segmental heterogenitet av hjertefunksjon og mottakelighet for doksorubicin-indusert myokardskade i sebrafisk. Etter en 24 timer behandling med 10 μM doksorubicin fra 3-4 dpf (figur 3A),sammenlignet vi DIAMOND-forskyvning av ventrikulære segmenter mellom kontroll og kjemoterapibehandlede grupper (figur 3B) og 48 timer etter behandling (figur 3C). Alle DIAMOND-figurer følger det samme grafiske mønsteret som de omsamplede ventriklene langs den korte aksen (Figur 1E). Dataene presenteres som prosenter ved å normalisere L2-normen for forskyvningsvektoren til hjertets indre omkrets, med X (grønn), Y (blå) og Z-komponenter (oransje) illustrert som deres vektede bidrag. Ved 4 dpf varierte den gjennomsnittlige L2-normen for segmental forskyvningsvektorer i kontrollfisk fra 6,6–11,3 μm, eller 3,8–6,6 % etter normalisering. Våre resultater indikerer at under kontrollforhold gjennomgår basalsegmentene I og VI de største forskyvningene og er de som er mest utsatt for doksorubicinindusert personskade (figur 3B, 29 % reduksjon fra 6,6–4,7%, n = 10 kontroll og n = 8 doksorubicin, p < 0,01). Ved 6 dpf varierte den gjennomsnittlige L2-normen for segmental forskyvningsvektorer i kontrollfisken fra 6,8–14 μm, eller 3,9–8 % etter normalisering. Ved 6 dpf, basal segmenter I og VI gjenopprettet DIAMOND forskyvning til kontrollnivåer, noe som tyder segmental regenerering(Figur 3C, n = 10 kontroll og n = 8 doksorubicin). Parallelt ble en forverring i 2D-basalbelastning fra -53 til -38 % observert ved 4 dpf etter behandling med doksorubicin, etterfulgt av en tilbakevending til kontrollnivåer ved 6 dpf, noe som bekrefter DIAMOND-forskyvningsresultatene (figur 3D, 3E). En parallell reduksjon i global utstøtingsfraksjon som svar på doksorubicin ved 4 dpf med utvinning ved 6 dpf ble også observert (Figur 3F, 3G).
Vi brukte deretter DIAMOND under doksorubicinbehandling og hakkveimodulasjon ved hjelp av Hakk-hemmeren DAPT og redning ved hjelp av Hakk nedstrøms effektorer NICD og NRG1 mRNA (figur 4A). NICD og NRG1 mRNA mikroinjeksjon reddet nedgangen i DIAMOND forskyvning og EF etter akutt kjemoterapi-indusert skade ved 4 dpf (Figur 4B, 4D). Eksponering for Hakk-hemmeren DAPT sammen med doksorubicin førte til en mer diffus reduksjon i DIAMOND-forskyvning, i tillegg til basalsegmentene I og VI (figur 4B). Videre hindret hemming av Notch-banen etter kjemoindusert skade ytterligere utvinning av DIAMOND-forskyvning av basalsegmentene og EF ved 6 dpf. Hemmingen ble reddet av Hakk nedstrøms effektorer NICD og NRG1 (Figur 4C, 4E).
Figur 1: 4D DIAMOND forskyvning utvikling. (A) Rå bilder ble tatt av lysark fluorescerende mikroskopi. (B og C) Rekonstruert 3D hjerte ble samplet på nytt langs den sanne kortaksen planvisning. (D) Skjematisk illustrasjon av embryonale sebrafisk hjerte. (E og F) 2D og 3D illustrasjoner av fordelingen av ventrikkelen i åtte segmenter unntatt segmenter VII og VIII. (G) De forskjellige koordinatsystemene for endesystole og end-diastole etter resampling. (H) En gruppe rektangulære parallellrør ble opprettet for generering av en transformasjonsmatrise (Tm). (I) Registrerte endesystolisk og endediastolisk koordinatsystemer ved å bruke Tm. (J) Forskyvning vektor av segmental masse centroid fra ende-systole til end-diastole. (K) DIAMOND forskyvning av ventrikulære segmenter I-VI sporet under flere tidspunkter i hjertesyklusen. (L) DIAMOND forskyvning av ventrikulære segmenter I-VI fra ende-systole til end-diastole. Dette tallet fra Chen et al.8 er gjengitt med tillatelse fra American Society for Clinical Investigation (ASCI). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: DIAMOND segmentering av det embryonale sebrafiskhjertet sammenlignet med rådata i 3D. Det embryonale sebrafiskhjertet ble delt inn i seks segmenter (volumer) avbildet her i forskjellige farger for beregning av DIAMOND-forskyvninger (venstre). Forskyvningvektoren av hvert segment beregnet av DIAMOND representerer sin segmentale hjertefunksjon. Atriumet og utstrømningskanalen ble fjernet under segmentering. Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 3: DIAMOND avslører segmental heterogenitet i hjertefunksjon og mottakelighet for kjemoterapi-indusert skade. (A) Eksperimentell tidsplan for doksorubicinbehandling. (B og C) Segmental sammenligning av DIAMOND forskyvning vektorer normalisert til indre myokard omkrets mellom kontroll og doksorubicin-behandlet grupper på 4 og 6 dpf (t tester, **p < 0,01, n = 8-10 per gruppe). (D og E) Vurdering av belastning i den ventrikulære basen som viser et lignende skade- og regenereringsmønster som DIAMOND-forskyvningsvektorene (*p < 0,05, n = 6–8 per gruppe). (F og G) Reduksjon i utstøtingsfraksjon som svar på doksorubicin ved 4 dpf med utvinning ved 6 dpf, etter et mønster som ligner segmental DIAMOND forskyvninger på globalt ventrikulært nivå (t tester, **p < 0,01, feilstenger SEM, n = 6-10 per gruppe). Dette tallet fra Chen et al.8 er gjengitt med tillatelse fra ASCI. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: DIAMANTmekanikk for vurdering av hakkmediert myokardutvinning etter doksorubicinindusert skade. (A) Eksperimentell tidsplan. (B og C) NICD og NRG1 Hakk nedstrøms effektorer reddet reduksjonen av DIAMOND forskyvning i segmenter I og VI ved 4 dpf. Ved 6 dpf, hemming av Notch signalisering av DAPT svekket restaureringen av segmental hjertefunksjon (ANOVA, **p < 0,01 Dox vs. kontroll; †p < 0,05, ††p < 0,01, Dox + DAPT vs. kontroll, n = 6-10 per gruppe). (D og E) Utstøtingsfraksjon bekrefter DIAMANTmekanikk på globalt nivå (ANOVA, *p < 0,05, **p < 0,01, feilfelt SEM, n = 5–11 per gruppe). Dette tallet fra Chen et al.8 er gjengitt med tillatelse fra ASCI. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En streng strategi for kvantifisering av segmental hjerteinfarkt funksjon er avgjørende for å vurdere hjertemekanikk utover tradisjonell EF, kjent for å være en ufølsom og forsinket indikator på hjerteinfarkt skade1,4,12. Derfor har det vært en økende interesse for markører for tidlige myokardendringer, og en voksende mengde litteratur støtter myokarddeformasjonsparametere som en tidlig indikator for å forutsi ventrikulær dysfunksjon4,13. Ekkokardiografisk måling av venstre ventrikulær (LV) stamme gir en etablert metode for myokarddeformasjonsmåling13. Imidlertid lider vev Doppler-basert belastningavbildning av en rekke mangler på grunn av vinkelavhengighet og intraobserver og interobservervariabilitet14. Speckle sporing ekkokardiografi (STE) kan løse vinkeluavhengig 2D og 3D vev deformasjon, men nøyaktigheten av 2D speckle sporing påvirkes av gjennom-flyet bevegelse6,mens 3D speckle sporing krever overlegen romlig oppløsning for å løse de positive ultralyd interferens mønstre (speckles) i 3D og høy temporal oppløsning for å spore flekker mellom rammer15. I den nåværende protokollen beskriver vi DIAMOND-forskyvning som en ny myokarddeformasjonsparameter for in vivo kvantifisering av 4D segmental hjertefunksjon i sebrafisk. Sammenlignet med EF og 2D-belastning som referansestandarder, gir DIAMOND ytterligere segmental deformasjonsinformasjon uten å bli påvirket av bevegelse gjennom hele flyet. Ved å integrere DIAMOND med 4D LSFM, kan vår teknikk vurdere forskyvningsvektoren til et hjertesegment 20–30 μm i bredden, noe som for tiden er umulig for selv det mest avanserte 3D STE-systemet, som har millimeterrekkeviddeoppløsning16.
For å bruke DIAMOND er det avgjørende å ha en omfattende forståelse av den anatomiske strukturen i det embryonale sebrafiskhjertet. Under bildesegmentering er det viktig at den atromriklære kanalen og utstrømningskanalen er korrekt identifisert og segmentert fra resten av myokardiet når brukeren utfører trinn 6 i protokollen. Videre må de horisontale og vertikale lange aksene i ventrikkelen bestemmes nøyaktig for å utlede det sanne kortakseplanet for bildeprøvetaking i trinn 8.
Den store ratebegrensende faktoren for å bruke DIAMOND er manuell segmentering av ventrikkelen, som blir tidkrevende når flere faser i hjertesyklusen må evalueres. Med fremme av maskinlæring og nevrale nettverk, en automatisert hjertesegmenteringsmetode17,18,19,20 kan integreres med DIAMOND for å gi overvåking av segmental hjertefunksjon gjennom hele hjertesyklusen. Videre anvendelser av DIAMOND inkluderer også integrasjon med ekkokardiografi, mikro-CT eller mikro-MR, egnet i større dyremodeller for flerskala vurdering av hjerteskade og regenerering21. Metoden vil imidlertid først kreve tilpasning til tilstedeværelsen av myokardfibre som fører til mer kompleks hjertedeformasjon, inkludert torsjon hos pattedyr22,23.
Samlet sett gir DIAMOND en ny metode for å evaluere segmental hjertefunksjon i embryonale sebrafisk under både fysiologiske og patologiske forhold og kan brukes som en plattform for høy gjennomstrømning in vivo screening av veier forbundet med kjemoterapi-indusert hjertetoksisitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har erklært at det ikke finnes noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Det nåværende arbeidet ble finansiert av American Heart Association tilskudd 16SDG30910007 og 18CDA34110338, og av National Institutes of Health tilskudd HL083015, HL111437, HL118650, og HL129727.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira6 | FEI | Image analyzing software | |
| DAPT | Millipore Sigma | D5942-5MG | |
| Doxorubicin hydrochloride | Millipore Sigma | D1515-10MG | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Millipore Sigma | E10521-10G | Tricaine |
| MATLAB | MathWorks | Programming environment | |
| MATLAB Image Processing Toolbox | MathWorks | Image processing toolbox |
References
- Ewer, M. S., Ewer, S. M.
- Thavendiranathan, P., Wintersperger Bernd, J., Scott, F. D., Thomas D, M. H. Cardiac MRI in the Assessment of Cardiac Injury and Toxicity From Cancer Chemotherapy. Circulation: Cardiovascular Imaging. 6 (6), 1080-1091 (2013).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Thavendiranathan, P., et al. Use of Myocardial Strain Imaging by Echocardiography for the Early Detection of Cardiotoxicity in Patients During and After Cancer Chemotherapy. A Systematic Review. 63 (25), Part A 2751-2768 (2014).
- Collier, P., Phelan, D., Klein, A. A Test in Context: Myocardial Strain Measured by Speckle-Tracking Echocardiography. Journal of the American College of Cardiology. 69 (8), 1043-1056 (2017).
- Hanekom, L., Cho, G. Y., Leano, R., Jeffriess, L., Marwick, T. H. Comparison of two-dimensional speckle and tissue Doppler strain measurement during dobutamine stress echocardiography: an angiographic correlation. European Heart Journal. 28 (14), 1765-1772 (2007).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Chen, J., et al. Displacement analysis of myocardial mechanical deformation (DIAMOND) reveals segmental susceptibility to doxorubicin-induced injury and regeneration. JCI Insight. 4 (8), e125362 (2019).
- Messerschmidt, V., et al. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Journal of Visualized Experiments. (138), e57763 (2018).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Lenneman, C. G., Sawyer, D. B. Cardio-Oncology: An Update on Cardiotoxicity of Cancer-Related Treatment. Circulation Research. 118 (6), 1008-1020 (2016).
- Geyer, H., et al. Assessment of Myocardial Mechanics Using Speckle Tracking Echocardiography: Fundamentals and Clinical Applications. Journal of the American Society of Echocardiography. 23 (4), 351-369 (2010).
- Castro, P. L., Greenberg, N. L., Drinko, J., Garcia, M. J., Thomas, J. D. Potential pitfalls of strain rate imaging: angle dependency. Biomedical Sciences Instrumentation. 36, 197-202 (2000).
- Seo, Y., Ishizu, T., Aonuma, K. Current Status of 3Dimensional Speckle Tracking Echocardiography: A Review from Our Experiences. Journal of Cardiovascular Ultrasound. 22 (2), 49-57 (2014).
- Amzulescu, M. S., et al. Improvements of Myocardial Deformation Assessment by Three-Dimensional Speckle-Tracking versus Two-Dimensional Speckle-Tracking Revealed by Cardiac Magnetic Resonance Tagging. Journal of the American Society of Echocardiography. 31 (9), 1021-1033 (2018).
- Wolterink, J. M., Leiner, T., Viergever, M. A., Išgum, I. Reconstruction, Segmentation, and Analysis of Medical Images. Zuluaga, M. A., et al. , Springer International Publishing. 95-102 (2016).
- Avendi, M. R., Kheradvar, A., Jafarkhani, H. A combined deep-learning and deformable-model approach to fully automatic segmentation of the left ventricle in cardiac MRI. Medical Image Analysis. 30, 108-119 (2016).
- Packard, R. R. S., et al. Automated Segmentation of Light-Sheet Fluorescent Imaging to Characterize Experimental Doxorubicin-Induced Cardiac Injury and Repair. Scientific Reports. 7 (1), 8603 (2017).
- Jay Kuo, C. C., Chen, Y.
- Natarajan, N., et al. Complement Receptor C5aR1 Plays an Evolutionarily Conserved Role in Successful Cardiac Regeneration. Circulation. 137 (20), 2152-2165 (2018).
- Zhukov, L., Barr, A. H. IEEE Visualization VIS 2003. , 597-602 (2003).
- Nielles-Vallespin, S., et al. In vivo diffusion tensor MRI of the human heart: Reproducibility of breath-hold and navigator-based approaches. Magnetic Resonance in Medicine. 70 (2), 454-465 (2013).
