Summary

Purification de la prominine-1- Cellules souches de Cerebellum souris postnatale

Published: April 12, 2020
doi:

Summary

Démontré ici est une méthode efficace et rentable pour purifier, la culture, et différencier les cellules souches de matière blanche du cervelet de souris postnatale.

Abstract

La plupart des neurones cérébellaires proviennent de deux niches souches embryonnaires : une niche rhombique pour les lèvres, qui génère tous les neurones glutamatergiques excitatoires cérélotés, et une niche de zone ventriculaire, qui génère les cellules inhibitrices de Purkinje GABAergic, qui sont des neurones qui constituent les noyaux cérébellaires profonds et les gliax de Bergman. Récemment, une troisième niche de cellules souches a été décrite qui se présente comme une zone germinale secondaire de la niche de zone ventriculaire. Les cellules de cette niche sont définies par le marqueur de surface cellulaire prominin-1 et sont localisées à la matière blanche en développement du cervelet postnatal. Ce créneau explique la couche moléculaire défunte GABAergic interneurons avec les astrocytes cérébellaires générés par la postnaline. En plus de leur rôle de développement, ce créneau gagne en importance translationnelle en ce qui concerne son implication dans la neurodégénérescence et la tumorigenesis. La biologie de ces cellules a été difficile à déchiffrer en raison d’un manque de techniques efficaces pour leur purification. Les méthodes efficaces pour purifier, culture et différencier ces cellules souches cérébellaires postnatales sont démontrées ici.

Introduction

Le cervelet a longtemps été reconnu comme un circuit neuronal majeur coordonnant le mouvement volontaire1. Il reçoit l’apport des larges pans des neuroaxis, qui comprend des informations proprioceptives de la périphérie, afin de régler finement la sortie du moteur et coordonner le mouvement. Plus récemment, il a également été impliqué dans la régulation de la cognition et des émotions en utilisant potentiellement des réseaux similaires de traitement de l’information2,3,4.

Le cervelet adulte est composé d’un cortex cérébellaire externe et de matière blanche intérieure. Entrecoupés dans ces structures sont des noyaux intracerebellaires profonds. Semblable au reste du système nerveux, le développement du cervelet est entraîné par la prolifération des cellules progénitrices multipotentes (cellules souches) qui migrent et se différencient pour donner cette structure bien organisée. Dans le développement précoce (E10.5-E13.5), une niche de tige ventriculaire autour du quatrième ventricule en développement génère des neurones GABAergic (c.-à-d. cellules Purkinje, cellules Lugaro, cellules Golgi) avec Bergmann glia5,6,7,8.

Plus tard dans le développement (semaine postnatale un), une deuxième niche de cellules souches dans la lèvre rhombique génère MATH1- et Nestin-exprimant les ancêtres qui donnent lieu à des neurones granule excitatoires9,10,11,12. Récemment, une troisième niche de cellules souches a été décrite13. Ces cellules expriment la prominine-1 (également connu sous le nom de CD133), une glycoprotéine couvrant la membrane qui définit un sous-ensemble de cellules souches dans l’intestin et les systèmes hématopoïétiques14,15,16. La cartographie du destin in vivo montre que ces cellules souches génèrent des interneurons de couches moléculaires clés (c.-à-d. les cellules de panier et les cellules de stellate), ainsi que les astrocytes, pendant les trois premières semaines postnatales. Dans le passé, il a été difficile d’étudier ces cellules in vitro parce que les méthodes antérieures ont exigé des techniques coûteuses et chronophages (c.-à-d., le tri cellulaire activé par la fluorescence [FACS]) qui dépendent de la coloration de prominine-112,13,17. Ce protocole décrit une méthode immunomagnétique-basée pour l’isolement de ces cellules souches qui peuvent alors être facilement cultivées et différenciées.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément au Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (2011) et ont été approuvées par l’IACUC de l’Université northwestern (Protocole IS00011368). 1. Préparation des solutions Préparer la solution de dissociation tissulaire faite à partir de phénol stérile contenant du dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) avec papain (100 U/ml), cystéine (0.2 mg/ml) et DNase (250 …

Representative Results

Les cellules souches cérébellaires postnatbellaires prominin-1-positives ont formé des neurosphères dans le milieu de la neurosphère riche en facteurs de croissance (EGF et bFGF). Ces neurosphères étaient positives pour la prominine-1-coloring, le marqueur utilisé pour l’isolement, et aussi comme une tache pour d’autres marqueurs de cellules souches tels que Nestin et GFAP13 (figure 1). L’expression du marqueur de cellules souches a été maintenue dans …

Discussion

Les cellules souches cérébellaires prominin-1-exprimant résident dans la matière blanche prospective pendant les 3 premières semaines de la vie postnatale. Leur prolifération est étroitement contrôlée par la voie sonore hérisson soutenu par les cellules Purkinje17. Ces cellules souches/progéniteurs contribuent à des interneurons GABAergic nés plus tard appelés cellules de panier et cellules de stellate. Ces interneurons résident dans la couche moléculaire, où ils synapse sur les c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions les membres du laboratoire Opal pour leurs suggestions. Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH 1RO1 NS062051 et 1RO1NS08251 (Opal P)

Materials

0.05%Trypsin Thermo Fisher Scientific 25300054 0.05%
2% B27 Gibco; Thermo Fisher Scientific 17504001
2mM EDTA solution Corning 46-034-CI
Anti- Prominin-1 microbeads Miltenyi Biote 130-092-333
bovine serum albumin Sigma A9418
Column MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
culture plates ultra – low attachment Corning 3473
cysteine Sigma C7880
DNase Sigma D4513-1VL 250 U/ml
Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline Thermo Fisher Scientific 14040141
Hank's balanced salt solution-HBSS Gibco 14025-092
Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor Promega G507A 20 ng/ml
Human recombinant Epidermal Growth Factor Promega G502A 20 ng/ml
Leukemia Inhibitory Factor Sigma L5158
l-glutamine Gibco 25030081
Microscopy Lieca TCS SP5 confocal microscopes
MiniMACS separator Miltenyi Biotec 130-042-102
mouse anti-Prominin-1 Affymetrix eBioscience 14-1331 1 in 100
Nestin Abcam ab27952 1 in 200
Neurobasal medium Thermo Fisher 25030081
O4 Millopore MAB345
Papain Worthington LS003126 (100 U/ml)
Platelet- Derived Growth Factor Sigma H8291 10 ng/ml
Poly-D-Lysine Sigma P6407
rabbit anti-tubulin, b-III Sigma T2200 1 in 500
Rabit anti-GFAP Dako Z0334 1 in 500
Separation columns-MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Sterile cell strainer Fisher Scientific 22363547 40um

References

  1. Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
  2. Carta, I., Chen, C. H., Schott, A. L., Dorizan, S., Khodakhah, K. Cerebellar modulation of the reward circuitry and social behavior. Science. 363, (2019).
  3. Sathyanesan, A., et al. Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders. Nature Reviews Neuroscience. 20, 298-313 (2019).
  4. Wagner, M. J., Kim, T. H., Savall, J., Schnitzer, M. J., Luo, L. Cerebellar granule cells encode the expectation of reward. Nature. 544, 96-100 (2017).
  5. Araujo, A. P. B., Carpi-Santos, R., Gomes, F. C. A. The Role of Astrocytes in the Development of the Cerebellum. Cerebellum. , (2019).
  6. Seto, Y., et al. Temporal identity transition from Purkinje cell progenitors to GABAergic interneuron progenitors in the cerebellum. Nature Communication. 5, 3337 (2014).
  7. Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cell Neurosciences. 8, 450 (2014).
  8. Koziol, L. F., et al. Consensus paper: the cerebellum’s role in movement and cognition. Cerebellum. 13, 151-177 (2014).
  9. Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
  10. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  11. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
  12. Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nature Neurosciences. 16, 1737-1744 (2013).
  13. Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nature Neurosciences. 8, 723-729 (2005).
  14. Toren, A., et al. CD133-positive hematopoietic stem cell “stemness” genes contain many genes mutated or abnormally expressed in leukemia. Stem Cells. 23, 1142-1153 (2005).
  15. Zhu, L., et al. Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation. Nature. 457, 603-607 (2009).
  16. Man, S. M., et al. Critical Role for the DNA Sensor AIM2 in Stem Cell Proliferation and Cancer. Cell. 162, 45-58 (2015).
  17. Fleming, J. T., et al. The Purkinje neuron acts as a central regulator of spatially and functionally distinct cerebellar precursors. Developmental Cell. 27, 278-292 (2013).
  18. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25, 1560-1570 (2007).
  19. Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nature Protocols. 7, 1741-1754 (2012).
  20. Edamakanti, C. R., Do, J., Didonna, A., Martina, M., Opal, P. Mutant ataxin1 disrupts cerebellar development in spinocerebellar ataxia type 1. Journal of Clinical Investigation. 128, 2252-2265 (2018).
  21. Erlandsson, A., Enarsson, M., Forsberg-Nilsson, K. Immature neurons from CNS stem cells proliferate in response to platelet-derived growth factor. Journal of Neurosciences. 21, 3483-3491 (2001).
  22. Galli, R., Pagano, S. F., Gritti, A., Vescovi, A. L. Regulation of neuronal differentiation in human CNS stem cell progeny by leukemia inhibitory factor. Developmental Neurosciences. 22, 86-95 (2000).
  23. Silbereis, J., Cheng, E., Ganat, Y. M., Ment, L. R., Vaccarino, F. M. Precursors with Glial Fibrillary Acidic Protein Promoter Activity Transiently Generate GABA Interneurons in the Postnatal Cerebellum. Stem Cells. 27, 1152-1163 (2009).
  24. Parmigiani, E., et al. Heterogeneity and Bipotency of Astroglial-Like Cerebellar Progenitors along the Interneuron and Glial Lineages. Journal of Neurosciences. 35, 7388-7402 (2015).
  25. Wojcinski, A., et al. Cerebellar granule cell replenishment postinjury by adaptive reprogramming of Nestin(+) progenitors. Nature Neurosciences. 20, 1361-1370 (2017).
  26. Yang, Z., Joyner, A. L. YAP1 is involved in replenishment of granule cell precursors following injury to the neonatal cerebellum. Developmental Biology. 1606 (19), 30207 (2019).
  27. Wang, S. S., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83, 518-532 (2014).
  28. Eberhart, C. G. Three down and one to go: modeling medulloblastoma subgroups. Cancer Cell. 21, 137-138 (2012).
  29. Takahashi, M., et al. CD133 is a positive marker for a distinct class of primitive human cord blood-derived CD34-negative hematopoietic stem cells. Leukemia. 28, 1308-1315 (2014).

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Cite This Article
Edamakanti, C. R., Opal, P. Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum. J. Vis. Exp. (158), e60554, doi:10.3791/60554 (2020).

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