Summary
여기에서 입증된 것은 산후 마우스 소뇌로부터 백물 줄기 세포를 정화, 배양 및 분화하는 효율적이고 비용 효율적인 방법입니다.
Abstract
대부분의 소뇌 뉴런은 두 개의 배아 줄기 틈새에서 발생: 마름모꼴 입술 틈새, 모든 소뇌 흥분 성 글루타마테르뉴런을 생성, 및 심실 영역 틈새, 이는 억제 GABAergic Purkinje 세포를 생성하는, 이는 깊은 소뇌를 구성하는 뉴런입니다. 최근, 제3 줄기세포 틈새시장은 심실 영역 틈새에서 이차 발아 영역으로 발생한다는 설명이 있다. 이 틈새의 세포는 세포 표면 마커 prominin-1에 의해 정의되고 출생 후 소뇌의 발전 백색 물질에 국한됩니다. 이 틈새 는 산후 생성 된 소뇌 성상 세포와 함께 늦게 태어난 분자 층 GABAergic interneurons에 대한 계정. 그들의 발달 역할 이외에, 이 틈새 는 신경 변성 및 종양 발생에 그것의 관여에 관하여 번역중요성을 얻고 있습니다. 이 세포의 생물학은 그들의 정화를 위한 능률적인 기술의 부족 때문에 해독하기 어려웠습니다. 여기에서 입증된 것은 이러한 산후 소뇌 줄기 세포를 정화, 배양 및 분화하는 효율적인 방법입니다.
Introduction
소뇌는 오랫동안 자발적 운동1을조정하는 주요 뉴런 회로로 인식되어 왔다. 모터 출력을 미세 조정하고 움직임을 조정하기 위해 주변의 프로피오셉트 정보를 포함하는 신경 축의 넓은 swathes에서 입력을 받습니다. 최근에는 유사 정보 처리 네트워크2,,3,,4를이용하여 인지와 감정을 조절하는 데도 연루되어 있다.
성인 소뇌는 외부 소뇌 피질과 내부 백색 물질로 구성됩니다. 이 구조물 내의 산재는 깊은 intracerebellar 핵입니다. 신경계의 나머지와 마찬가지로, 소뇌의 발달은 이 잘 조직된 구조물을 산출하기 위하여 이동하고 분화하는 다능한 전구 세포 (줄기 세포)의 증식에 의해 구동됩니다. 초기 개발 (E10.5-E13.5), 개발 제 4 심실 주위 심실 줄기 틈새 는 버그만 glia와 함께 GABAergic 뉴런을 생성 (즉, Purkinje 세포, 루가로 세포, 골지 세포) Bergmann glia5,,6,,7,,8.
이후 개발(postnatal week 1)에서, 마름모꼴 입술에서 두 번째 줄기 세포 틈새는 MATH1-및 네스테틴 발현 전구체를 생성하여 흥분성 과립 뉴런9,,10,,11,,12를발생시다. 최근 제3 줄기세포 틈새시장이13에기재되어 있다. 이들 세포는 프로미닌-1(CD133이라고도 함)을 발현하며, 장 및 조혈계에서 줄기 세포의 서브세트를 정의하는 막 스패닝 당단백질14,,15,,16을발현한다. 생체 내 운명 매핑은 이러한 줄기 세포가 처음 3주 동안 성상세포와 함께 주요 분자층 인터뉴런(즉, 바구니 세포 및 성결세포)을 생성한다는 것을 보여줍니다. 과거에는, 사전 방법은 프로민-1 염색12,,13,,17에의존하는 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리는 기술(즉, 형광 활성화 세포 분류[FACS]])을 요구했기 때문에 시험관 내에서 이들 세포를 연구하기가 어려웠다. 이 프로토콜은 이러한 줄기 세포의 분리를 위한 면역자기 기반 방법을 설명하며, 그 후 쉽게 배양되고 분화될 수 있다.
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Protocol
모든 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH의 가이드 (2011)에 따라 수행되었으며 노스 웨스턴 대학 IACUC (프로토콜 IS00011368)에 의해 승인되었습니다.
1. 솔루션 준비
- 파파인 (100 U / ml), 시스테인 (0.2 mg / ml) 및 DNase (250 U / ml)와 멸균 페놀 레드 함유 덜베코의 인산 완충 식염수 (DPBS)로 만든 조직 해리 솔루션을 준비하십시오.
- DNase 용액을 희석시키기 위해H2O. 50 mL에서 DNase I (1 병)의 호염화 분말 100 mg을 잘 혼합하고 스톡 용액을 걸링한다. 10 mL 재고 알리쿼트 준비. 스톡 튜브 1개를 0.5 mL 일회용 알리쿼트로 나눕니다. 이러한 일회용 알리쿼트(aliquots)를 -80°C에서 보관하십시오.
- 자기 컬럼 버퍼 X: 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 2 mM EDTA 용액을 준비하여 자기 분리 시약을 준비한다.
- 신경구 배지를 준비하려면, L-글루타민과 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 신경기근 배지를 사용하고 2% B27, 20 ng/mL 인간 재조합 표피 성장 인자(EGF) 및 20 ng/mL 인간 재조합 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 보충하십시오.
- 분화 매체를 준비하기 위하여는, 신경기분과 배지를 사용하고 10 ng/mL 분화 인자 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF-AA) 또는 10 ng/mL 백혈병 억제 인자 (LIF) 및 2% B27를 가진 보충교재를 이용하십시오.
- 초저 부착 12 웰 (3.5 cm2)및 6 웰 (9.6 cm2)배양 접시를 사용 하십시오.
2. 소뇌해부
- 이소플루란으로 마우스 새끼(P3-P7)를 마취시키고 외과용 가위를 사용하여 참수합니다.
- 새끼의 분리 된 머리에 70 % 에탄올을 뿌린다.
- 각 머리를 빈 멸균 10cm 배양 접시에 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김. 미세 해부 가위를 사용하여 피부를 분리 한 다음 중간 선을 따라 가위를 시상하여 두개골을 제거하십시오.
- #7 집게를 사용하여 뇌간에서 시작하여 두개골 뼈를 벗깁니다. 주걱을 사용하여 뇌를 조심스럽게 들어 올리고 소뇌를 그대로 유지하고 15 mL의 얼음 차가운 행크스 균형 소금 용액 (HBSS) 용액이 들어있는 신선한 멸균 10.0 cm 접시로 뇌를 옮김하십시오.
- 뇌가 들어있는 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 미세 #5 집게를 사용하여 소뇌에서 수막과 큰 혈관을 제거하고 주걱을 사용하여 뇌간에서 소뇌를 분리하십시오.
- 소뇌를 5.0 mL의 얼음 차가운 HBSS 용액을 포함하는 15 mL 원심 분리관으로 옮김. HBSS의 5.0 mL로 3x를 헹군다음 디캔팅하여 소뇌를 씻으소입니다.
참고: 각 소뇌는 추가 처리를 위해 자신의 튜브에 배치해야합니다.
3. 세포 현탁액 준비
- 마지막 헹구 후, 37°C로 미리 데운 파페인 계 조직 해리액 5 mL(전작13,,18)을첨가한다. 수조에서 37 °C에서 15 분 동안 조직을 배양하십시오. 튜브를 위아래 3x-5x매 3x로 뒤집어 서서히 영양 믹서를 사용하거나 손으로 혼합합니다.
- 앞서19일설명한 바와 같이 넓은 직경(일반 유리 파이펫)과 좁은 직경의 파스퇴르 피펫(분젠 버너 위에 가열하여 연마)을 준비한다.
- HBSS 용액 5 mL로 조직을 3x 씻어 손으로 디캔팅하는 동안 조직의 손실을 피하십시오.
- 마지막 HBSS 세척을 제거하고 250 μL의 DNase 용액을 함유한 DPBS 용액 5 mL을 조직에 추가합니다. 넓은 직경의 파스퇴르 피펫을 사용하여 10x-15x를 삼각화하여 조직을 해리합니다. 거품의 형성을 피하기 위해 부드럽게이 단계를 수행합니다.
- 그런 다음 수조에서 37°C에서 10분 동안 슬러리를 추가로 인큐베이션하고 튜브를 반전 및 곧게 펴혼합합니다.
- 감소된 직경의 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직 슬러리를 10배 더 삼각화한다. 큰 조직이 남아있는 경우, 피펫 의 끝으로 튜브의 바닥에 조직 조각을 부드럽게 누르고 세포가 미세 현탁액에 도달 할 때까지 파이펫팅을 계속합니다.
- 조직을 37°C에서 추가로 10분 동안 배양하고, 이전의 혼합 단계를 반복한다.
4. 줄기 세포의 면역 라벨링
- 원심분리기 튜브를 얼음 위에 놓고 다음 단계에 얼음으로 차가운 용액을 사용하십시오. 40 μm 세포 스트레이너를 통해 해리 된 세포를 50 mL 원심 분리 튜브로 변형시. 10.0 mL의 HBSS 솔루션으로 필터를 맨 위에 두면 셀이 이 추가 솔루션에서 메시를 통과할 수 있습니다.
- 여과된 세포를 신선한 15 mL 원심분리기 튜브로 옮기고 4°C에서 10분 동안 300 x g에서 세포 현탁액을 원심분리합니다. 진공 흡입기를 조심스럽게 사용하여 상한체를 완전히 흡인하고 폐기하십시오.
- 마그네틱 컬럼 버퍼의 160 μL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 자기 라벨링 전에 단일 셀 현탁액을 얻으려면 30 μm 나일론 메쉬를 통과하여 셀 덩어리를 제거하여 컬럼을 막을 수 있습니다.
- 항체가 프로미닌-1 발현 세포에 결합하기 위해 각 15 mL 튜브에 40 μL의 항 프로미닌-1 마이크로비드를 넣고, 15분 동안 냉장고에 혼합하고 배양합니다.
- 1.0-2.0 mL의 컬럼 버퍼 X와 원심분리기를 300 x g에서 10분 동안 추가하여 세포를 세척한다.
- 컬럼 버퍼 X의 1.0 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
참고: 작은 덩어리가 컬럼 버퍼 X의 1.0 mL와 펠릿의 재현탁 후 볼 경우, 그들은 파스퇴르 파이펫의 팁을 사용하여 신중하게 제거해야, 그렇지 않으면 이러한 덩어리는 세포 선별 중에 자기 열을 차단할 수 있습니다.
5. 자기 기둥 준비, 세포 선별 및 도금
참고: 지연이 신경구 형태에 영향을 미칠 수 있기 때문에 다른 유전자형 조건 (질병 대 제어)에서 자기 분리는 동시에 수행되어야합니다.
- 자기장에 노출된 자기 스탠드에 자기 열을 배치하여 자기 열을 준비합니다. 500 μL의 버퍼 X로 컬럼을 한 번 헹구고 폐기할 원심분리기 튜브에 떨어지는 버퍼를 적용합니다.
참고: 각 실험에 대해 신선한 자기 컬럼 버퍼 X를 준비합니다. 그렇지 않은 경우 줄기 세포 수율이 낮을 것입니다. - 레이블이 지정된 셀 서스펜션을 열에 적용합니다. 주로 소뇌 신경/신경교 혼합 세포로 구성된 표지되지 않은 세포를 포함하는 흐름을 신선한 15 mL 튜브로 수집한다(도1A).
- 완충 X의 500 μL로 컬럼을 3x 세척하십시오 (각 세척은 약 2-4 분 소요).
참고: 소뇌 신경 세포/신경 교 혼합 배양 소뇌 과립 뉴런으로 풍부 하 게 이 정화 단계의 유용한 부산물 역할을 할 수 있습니다. - 자기장에서 컬럼을 제거하고 1.5 mL 튜브에 놓습니다. 컬래버전 배지(neurosphere medium)를 1.0 mL을 컬럼에 넣고 플런저를 컬럼에 밀어 프로미닌-1 비드로 태그된 세포를 신선한 1.5 mL 팔콘 튜브로 플러시합니다.
- 프로미닌-1 표지세포의 순도를 향상시키기 위해, 5.1-5.4단계 다음의 두 번째 컬럼에 용출된 세포를 전달한다.
- 혈세포계로 세포를 계산합니다. 일반적인 수율은 소뇌 당 107 세포입니다. 세포를 초저 부착 플레이트(다운스트림 실험에 필요한 밀도에 따라 6 또는 12웰)에 플레이트합니다.
6. 신경구의 통과와 분화
- 초저 부착 12 웰 플레이트에 프로미닌-1 표지 줄기 세포를 신경구 배지(5,000세포/웰)로 플레이트합니다.
- 7-10 일 후, 세포는 공 모양의 부동 신경구 (기본 신경 구)를 산출하기 위해 분할합니다.
참고: 이 실험에서는 숫자로 확장되는 이차 신경구가 추가 사용을 위해 생성됩니다. 1 차적인 신경구 인구는 줄기 세포 속성이 없고 신경구와 함께 뭉쳐질 수 있는 오염세포를 포함할 수 있기 때문에, 이 실험을 위해 이용되지 않습니다. - 통과를 위해, 1.0 mL 파이펫 팁을 사용하여 배양 배지와 함께 1차 신경구를 15 mL 멸균 원심분리기 튜브로 옮김을 옮김을 전달한다. 300 x g에서 원심분리하여 신경구를 5분 동안 펠렛하고 상층을 버린다.
- 파파인 또는 0.05% 트립신 용액을 함유한 조직 해리 매체의 5 mL에서 펠릿을 다시 중단시다. 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 세포 현탁액을 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리. 신경구 배지의 5 mL에서 세포를 다시 중단하고 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 세포를 기계적으로 해리하고 천천히 10 배 위아래로 피펫팅합니다.
- 앞에서 설명한 바와 같이 신경구 매미디어에서 세포를 (다시) 플레이트한다. 배양일때 7-10일이 지나면 이차 신경구로 플레이트를 풍부하게 만들어야 합니다.
참고: 이러한 문화는 좋은 효율로 8 배까지 통과 될 수 있으며, 그 후에 신경 구 크기는 더 작고 증식 감소를 암시하는 경향이 있습니다. - 혈세포계의 세포를 카운트하고 폴리-D-리신 코팅 플레이트(6 또는 12웰)에 대한 향후 실험을 위한 최적의 숫자를 플레이트합니다.
- 줄기 세포를 분화하기 위해, 펠릿에 분화 배지를 추가하는 것을 제외하고, 앞서 설명한 바와 같이 원심분리에 의해 두 번째에서 8번째 통로까지 신경구를 수집한다.
참고: 시험관내에서 7일 후, 줄기세포는 뉴런 마커 β-III tubulin, 점성술 마커 GFAP 및 올리고엔드로시트 메이커 O4로 염색함으로써 입증된 바와 같이 뉴런, 성상세포 및 올리고엔드로시스트로시트로 분화한다.
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Representative Results
프로민-1-양성 산후 소뇌 줄기 세포는 성장 인자(EGF 및 bFGF)가 풍부한 신경구 배지에서 신경구를 형성하였다. 이들 신경구는 프로미닌-1-염색, 격리에 사용되는 마커, 또한 네스테틴 및 GFAP13과 같은 다른 줄기 세포 마커에 대한 얼룩으로서 양성이었다(도1). 줄기세포 마커 발현은 배양 전반에 걸쳐 적어도 8개의대구(20)에대해 유지되었다. 성장 인자의 철수 및 LIF 및 PDGF-AA의 존재 (이는 신경 세포 및 신경교 분화를 지원하는 인자이다21,,22),신경 구체는 신경 세포 및 신경교 혈통으로 분화(그림 2).
그림 1: 출생 후 소뇌에서 프로미닌-1 줄기 세포의 격리. (a)소뇌 줄기 세포를 면역자기성 프로미닌-1 구슬을 사용하여 분리하였다. 상단 패널: 광범위한 증식 및 자가 재생 특성을 가진 정제 된 줄기 세포 (컬럼 바인딩) 형성 된 신경 구. 컬럼(flowthrough)에 구속되지 않은 세포는 신경구를 형성할 수 없었다; 대신, 그들은 소뇌 신경 세포/신경 교 세포 혼합 세포되었다 (β-III tubulin/GFAP). 하단 패널: 줄기 세포 특이적 마커를 발현하는 프로미닌-1+ 세포로부터 형성된 신경구: 네스테틴, 프로미닌-1, 및 GFAP. (B)줄기세포 마커인 프로미닌-1및 네스테인및 뉴런 마커 β-III 튜불린에 대해 양성에 대해 음성으로 염색된 유동과정에서의 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 프로민-1 양성 신경구의 분화. 분화 인자 (PDGF-AA 또는 LIF)의 존재에서, 프로민-1 양성 신경구는 뉴런으로 분화 (β-III tubulin), 성상 세포 (GFAP), 및 올리고엔드로시테스 (O4). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Prominin-1 발현 소뇌 줄기 세포는 출생 후 생활의 첫번째 3 주 도중 장래 백색 물질에서 상주합니다. 이들의 증식은 Purkinje세포(17)에의해 지지되는 소닉 고슴도치 통로에 의해 엄격하게 조절된다. 이 줄기 세포/선조는 바구니 세포및 stellate 세포에게 불린 나중에 태어난 GABAergic interneurons에 기여합니다. 이러한 인터뉴런은 분자층에 상주하며, 여기서 그들은 Purkinje 세포에 시냅스를 삽입하고 GABAergic억제를통해 PC 지형 및 기능을 조각13,17,,23. 인터뉴런을 형성하는 것 외에도, 이 줄기 세포 집단은 또한 모든 산후 유래 소뇌 성상 세포17,,24를생성한다.
이 프로토콜은 출생 후 마우스 소뇌로부터 프로미닌-1/CD133 줄기 세포를 정제하는 쉽고 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 줄기 세포는 초저 부착 플레이트에서 배양되어야 합니다. 정상 플레이트에서 이러한 줄기 세포를 배양하면 신경구가 표면에 부착되어 줄기 세포 증식 및 분화로 이어질 수 있습니다. 여기서, 5,000개의 세포당 200-300개의 신경구의 수율은 단일 소뇌로부터 약 1 x 107 세포의 줄기 세포 수율에 해당한다. 이는 FACS 기반 전략에 대해 10배 더 비싼 것과 비슷합니다. 또한 FACS 장비에는 고가의 설치 및 고도로 숙련된 인력이 필요하며 쉽게 사용할 수 없습니다.
이들 줄기세포는 또한 암뿐만 아니라 신경발달 및 퇴행성 질환에 대한 연구에서 번역의 중요성이 증가하고 있으며25,,26,,27. 초기 생활에서 이러한 줄기 세포의 통제되지 않은 증식은 수질 모세포종28로이어지며, 우리 자신의 실험실에서 연구에 따르면 비정상적인 증식및 분화는 유전 질환 척추 세포 운동 실조 유형 120에서후기 소뇌 변성에 기여할 수 있음을 시사한다. 이 새로운 프로토콜은 이 세포를 공부를 위해 귀중할 것이고 건강과 질병에 있는 그들의 역할에 새로운 통찰력을 제공할 것입니다. 이 방법은 또한 신경 재생을 보증할 것입니다 두뇌에 치기 외상 및 그밖 모욕 후에 재생 요법에 있는 어드밴스로 이끌어 낼 수 있습니다. 이러한 기술은 장 및 골수와 같은 다른 조직으로부터 프로미닌-1 발현 줄기 세포를 추출하기 위해 일반화될 수 있으며, 여기서 그들은 또한15,,29를발현한다.
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Disclosures
이해 상충은 선언되지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 그들의 제안에 대한 오팔 실험실 회원에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH 교부금 1RO1 NS062051 및 1RO1NS08251 (오팔 P)에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2 mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Culture plates ultra - low attachment | Corning | 3473 | |
| Cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/mL |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/mL |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/mL) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/mL |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40 μm |
References
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