출생 후 마우스 소뇌에서 프로미닌-1+ 줄기 세포의 정화
Summary
여기에서 입증된 것은 산후 마우스 소뇌로부터 백물 줄기 세포를 정화, 배양 및 분화하는 효율적이고 비용 효율적인 방법입니다.
Abstract
대부분의 소뇌 뉴런은 두 개의 배아 줄기 틈새에서 발생: 마름모꼴 입술 틈새, 모든 소뇌 흥분 성 글루타마테르뉴런을 생성, 및 심실 영역 틈새, 이는 억제 GABAergic Purkinje 세포를 생성하는, 이는 깊은 소뇌를 구성하는 뉴런입니다. 최근, 제3 줄기세포 틈새시장은 심실 영역 틈새에서 이차 발아 영역으로 발생한다는 설명이 있다. 이 틈새의 세포는 세포 표면 마커 prominin-1에 의해 정의되고 출생 후 소뇌의 발전 백색 물질에 국한됩니다. 이 틈새 는 산후 생성 된 소뇌 성상 세포와 함께 늦게 태어난 분자 층 GABAergic interneurons에 대한 계정. 그들의 발달 역할 이외에, 이 틈새 는 신경 변성 및 종양 발생에 그것의 관여에 관하여 번역중요성을 얻고 있습니다. 이 세포의 생물학은 그들의 정화를 위한 능률적인 기술의 부족 때문에 해독하기 어려웠습니다. 여기에서 입증된 것은 이러한 산후 소뇌 줄기 세포를 정화, 배양 및 분화하는 효율적인 방법입니다.
Introduction
소뇌는 오랫동안 자발적 운동1을조정하는 주요 뉴런 회로로 인식되어 왔다. 모터 출력을 미세 조정하고 움직임을 조정하기 위해 주변의 프로피오셉트 정보를 포함하는 신경 축의 넓은 swathes에서 입력을 받습니다. 최근에는 유사 정보 처리 네트워크2,,3,,4를이용하여 인지와 감정을 조절하는 데도 연루되어 있다.
성인 소뇌는 외부 소뇌 피질과 내부 백색 물질로 구성됩니다. 이 구조물 내의 산재는 깊은 intracerebellar 핵입니다. 신경계의 나머지와 마찬가지로, 소뇌의 발달은 이 잘 조직된 구조물을 산출하기 위하여 이동하고 분화하는 다능한 전구 세포 (줄기 세포)의 증식에 의해 구동됩니다. 초기 개발 (E10.5-E13.5), 개발 제 4 심실 주위 심실 줄기 틈새 는 버그만 glia와 함께 GABAergic 뉴런을 생성 (즉, Purkinje 세포, 루가로 세포, 골지 세포) Bergmann glia5,,6,,7,,8.
이후 개발(postnatal week 1)에서, 마름모꼴 입술에서 두 번째 줄기 세포 틈새는 MATH1-및 네스테틴 발현 전구체를 생성하여 흥분성 과립 뉴런9,,10,,11,,12를발생시다. 최근 제3 줄기세포 틈새시장이13에기재되어 있다. 이들 세포는 프로미닌-1(CD133이라고도 함)을 발현하며, 장 및 조혈계에서 줄기 세포의 서브세트를 정의하는 막 스패닝 당단백질14,,15,,16을발현한다. 생체 내 운명 매핑은 이러한 줄기 세포가 처음 3주 동안 성상세포와 함께 주요 분자층 인터뉴런(즉, 바구니 세포 및 성결세포)을 생성한다는 것을 보여줍니다. 과거에는, 사전 방법은 프로민-1 염색12,,13,,17에의존하는 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리는 기술(즉, 형광 활성화 세포 분류[FACS]])을 요구했기 때문에 시험관 내에서 이들 세포를 연구하기가 어려웠다. 이 프로토콜은 이러한 줄기 세포의 분리를 위한 면역자기 기반 방법을 설명하며, 그 후 쉽게 배양되고 분화될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prominin-1 발현 소뇌 줄기 세포는 출생 후 생활의 첫번째 3 주 도중 장래 백색 물질에서 상주합니다. 이들의 증식은 Purkinje세포(17)에의해 지지되는 소닉 고슴도치 통로에 의해 엄격하게 조절된다. 이 줄기 세포/선조는 바구니 세포및 stellate 세포에게 불린 나중에 태어난 GABAergic interneurons에 기여합니다. 이러한 인터뉴런은 분자층에 상주하며, 여기서 그들은 Purkinje 세포에 시냅스를 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그들의 제안에 대한 오팔 실험실 회원에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH 교부금 1RO1 NS062051 및 1RO1NS08251 (오팔 P)에 의해 지원되었다
Materials
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| culture plates ultra – low attachment | Corning | 3473 | |
| cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/ml |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/ml) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/ml |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40um |
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