Summary

Purificación de Prominin-1+ Células Madre del Cerebelo de Ratón Postnatal

Published: April 12, 2020
doi:

Summary

Aquí se muestra un método eficiente y rentable para purificar, cultivar y diferenciar las células madre de la materia blanca del cerebelo del ratón postnatal.

Abstract

La mayoría de las neuronas cerebelosas surgen de dos nichos de tallo embrionario: un nicho de labio rombio, que genera todas las neuronas glutamatérgicas excitatorias cerebelosas, y un nicho de zona ventricular, que genera las células purines gecolégicas inhibitorias, que son neuronas que constituyen los núcleos cerebelosares profundos y Bergman glia. Recientemente, se ha descrito un tercer nicho de células madre que surge como una zona germinal secundaria del nicho de la zona ventricular. Las células de este nicho se definen por el marcador de superficie celular prominina-1 y se localizan a la materia blanca en desarrollo del cerebelo postnatal. Este nicho representa la capa molecular de nacimiento tardío interneuronas GABAérgicas junto con astrocitos cerebelos generados posnatalmente. Además de su papel de desarrollo, este nicho está ganando importancia traslacional en cuanto a su participación en la neurodegeneración y la tumorigenesis. La biología de estas células ha sido difícil de descifrar debido a la falta de técnicas eficientes para su purificación. Aquí se muestran métodos eficientes para purificar, cultivar y diferenciar estas células madre cerebelosas posnatales.

Introduction

El cerebelo ha sido reconocido durante mucho tiempo como un circuito neuronal importante que coordina el movimiento voluntario1. Recibe la entrada de las amplias franjas de la neuroeje, que incluye información proprioceptiva de la periferia, con el fin de afinar la salida del motor y coordinar el movimiento. Más recientemente, también se ha implicado en la regulación de la cognición y las emociones mediante el uso potencial de redes de procesamiento de información similares2,3,4.

El cerebelo adulto se compone de una corteza cerebelosa externa y materia blanca interna. Intercalados dentro de estas estructuras son núcleos intracentesis retorcedos profundos. Al igual que el resto del sistema nervioso, el desarrollo del cerebelo es impulsado por la proliferación de células progenitoras multipotentes (células madre) que migran y se diferencian para producir esta estructura bien organizada. En desarrollo temprano (E10.5–E13.5), un nicho de tallo ventricular alrededor del cuarto ventrículo en desarrollo genera neuronas GABAérgicas (es decir, células Purkinje, células Lugaro, células Golgi) junto con Bergmann glia5,,6,7,8.

Más tarde en desarrollo (semana postnatal uno), un segundo nicho de células madre en el labio rombico genera progenitores QUE expresan MATH1- y Nestin que dan lugar a neuronas de gránulos excitatorios99,10,,11,,12. Recientemente se ha descrito un tercer nicho de células madre13. Estas células expresan prominina-1 (también conocida como CD133), una glicoproteína que abarca membranas y define un subconjunto de células madre en el intestino y los sistemas hematopoyéticos14,,15,,16. El mapeo del destino in vivo muestra que estas células madre generan interneuronas clave de capa molecular (es decir, células de cesta y células estelares), junto con astrocitos, durante las tres primeras semanas postnatales. En el pasado, ha sido difícil estudiar estas células in vitro porque los métodos anteriores han requerido técnicas costosas y que consumen mucho tiempo (es decir, clasificación celular activada por fluorescencia [FACS]) que dependen de la tinción de prominina-112,13,17. Este protocolo describe un método basado en inmunomagnética para el aislamiento de estas células madre que luego se puede cultivar y diferenciar fácilmente.

Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con la Guía de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio (2011) y fueron aprobados por la Universidad Northwestern IACUC (Protocolo IS00011368). 1. Preparación de soluciones Preparar la solución de disociación tisular hecha de solución salina tamponada de fosfato de fenol estéril que contiene el fenol (DPBS) con papaína (100 U/ml), cisteína (0,2 mg/ml) y DNase (250 U/ml). Para preparar l…

Representative Results

Las células madre cerebelosas posnatales promininas-1 positivas formaron neuroesferas en neuroesferas medianas ricas en factores de crecimiento (EGF y bFGF). Estas neuroesferas fueron positivas para la prominina-1-tinción, el marcador utilizado para el aislamiento, y también como una mancha para otros marcadores de células madre como Nestin y GFAP13 (Figura 1). La expresión del marcador de células madre se mantuvo durante todo el cultivo y hasta por lo menos och…

Discussion

Las células madre cerebelosas promininas-1 que expresan residen en la materia blanca prospectiva durante las primeras 3 semanas de vida postnatal. Su proliferación está estrechamente controlada por la vía sónica del erizo apoyada por las células de Purkinje17. Estas células madre / progenitores contribuyen a las interneuronas GABAérgicas de nacimiento posterior llamadas células de la cesta y células estelares. Estas interneuronas residen en la capa molecular, donde sinapsis en las célul…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a los miembros del laboratorio Opal por sus sugerencias. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NIH 1RO1 NS062051 y 1RO1NS08251 (Opal P)

Materials

0.05%Trypsin Thermo Fisher Scientific 25300054 0.05%
2% B27 Gibco; Thermo Fisher Scientific 17504001
2mM EDTA solution Corning 46-034-CI
Anti- Prominin-1 microbeads Miltenyi Biote 130-092-333
bovine serum albumin Sigma A9418
Column MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
culture plates ultra – low attachment Corning 3473
cysteine Sigma C7880
DNase Sigma D4513-1VL 250 U/ml
Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline Thermo Fisher Scientific 14040141
Hank's balanced salt solution-HBSS Gibco 14025-092
Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor Promega G507A 20 ng/ml
Human recombinant Epidermal Growth Factor Promega G502A 20 ng/ml
Leukemia Inhibitory Factor Sigma L5158
l-glutamine Gibco 25030081
Microscopy Lieca TCS SP5 confocal microscopes
MiniMACS separator Miltenyi Biotec 130-042-102
mouse anti-Prominin-1 Affymetrix eBioscience 14-1331 1 in 100
Nestin Abcam ab27952 1 in 200
Neurobasal medium Thermo Fisher 25030081
O4 Millopore MAB345
Papain Worthington LS003126 (100 U/ml)
Platelet- Derived Growth Factor Sigma H8291 10 ng/ml
Poly-D-Lysine Sigma P6407
rabbit anti-tubulin, b-III Sigma T2200 1 in 500
Rabit anti-GFAP Dako Z0334 1 in 500
Separation columns-MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Sterile cell strainer Fisher Scientific 22363547 40um

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Cite This Article
Edamakanti, C. R., Opal, P. Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum. J. Vis. Exp. (158), e60554, doi:10.3791/60554 (2020).

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