Summary
Aquí se muestra un método eficiente y rentable para purificar, cultivar y diferenciar las células madre de la materia blanca del cerebelo del ratón postnatal.
Abstract
La mayoría de las neuronas cerebelosas surgen de dos nichos de tallo embrionario: un nicho de labio rombio, que genera todas las neuronas glutamatérgicas excitatorias cerebelosas, y un nicho de zona ventricular, que genera las células purines gecolégicas inhibitorias, que son neuronas que constituyen los núcleos cerebelosares profundos y Bergman glia. Recientemente, se ha descrito un tercer nicho de células madre que surge como una zona germinal secundaria del nicho de la zona ventricular. Las células de este nicho se definen por el marcador de superficie celular prominina-1 y se localizan a la materia blanca en desarrollo del cerebelo postnatal. Este nicho representa la capa molecular de nacimiento tardío interneuronas GABAérgicas junto con astrocitos cerebelos generados posnatalmente. Además de su papel de desarrollo, este nicho está ganando importancia traslacional en cuanto a su participación en la neurodegeneración y la tumorigenesis. La biología de estas células ha sido difícil de descifrar debido a la falta de técnicas eficientes para su purificación. Aquí se muestran métodos eficientes para purificar, cultivar y diferenciar estas células madre cerebelosas posnatales.
Introduction
El cerebelo ha sido reconocido durante mucho tiempo como un circuito neuronal importante que coordina el movimiento voluntario1. Recibe la entrada de las amplias franjas de la neuroeje, que incluye información proprioceptiva de la periferia, con el fin de afinar la salida del motor y coordinar el movimiento. Más recientemente, también se ha implicado en la regulación de la cognición y las emociones mediante el uso potencial de redes de procesamiento de información similares2,3,4.
El cerebelo adulto se compone de una corteza cerebelosa externa y materia blanca interna. Intercalados dentro de estas estructuras son núcleos intracentesis retorcedos profundos. Al igual que el resto del sistema nervioso, el desarrollo del cerebelo es impulsado por la proliferación de células progenitoras multipotentes (células madre) que migran y se diferencian para producir esta estructura bien organizada. En desarrollo temprano (E10.5–E13.5), un nicho de tallo ventricular alrededor del cuarto ventrículo en desarrollo genera neuronas GABAérgicas (es decir, células Purkinje, células Lugaro, células Golgi) junto con Bergmann glia5,,6,7,8.
Más tarde en desarrollo (semana postnatal uno), un segundo nicho de células madre en el labio rombico genera progenitores QUE expresan MATH1- y Nestin que dan lugar a neuronas de gránulos excitatorios99,10,,11,,12. Recientemente se ha descrito un tercer nicho de células madre13. Estas células expresan prominina-1 (también conocida como CD133), una glicoproteína que abarca membranas y define un subconjunto de células madre en el intestino y los sistemas hematopoyéticos14,,15,,16. El mapeo del destino in vivo muestra que estas células madre generan interneuronas clave de capa molecular (es decir, células de cesta y células estelares), junto con astrocitos, durante las tres primeras semanas postnatales. En el pasado, ha sido difícil estudiar estas células in vitro porque los métodos anteriores han requerido técnicas costosas y que consumen mucho tiempo (es decir, clasificación celular activada por fluorescencia [FACS]) que dependen de la tinción de prominina-112,13,17. Este protocolo describe un método basado en inmunomagnética para el aislamiento de estas células madre que luego se puede cultivar y diferenciar fácilmente.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con la Guía de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio (2011) y fueron aprobados por la Universidad Northwestern IACUC (Protocolo IS00011368).
1. Preparación de soluciones
- Preparar la solución de disociación tisular hecha de solución salina tamponada de fosfato de fenol estéril que contiene el fenol (DPBS) con papaína (100 U/ml), cisteína (0,2 mg/ml) y DNase (250 U/ml).
- Para preparar la solución de DNase diluir 100 mg del polvo liofilizado de DNase I (una botella) en 50 ml de H2O. Mezclar bien y filtrar la solución en stock. Prepare alícuotas de stock de 10 ml. Divida un tubo de material en alícuotas de un solo uso de 0,5 ml. Almacene estas alícuotas de un solo uso a -80 oC.
- Preparar reactivos de separación magnética mediante la preparación del búfer magnético de columna X: 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) y solución EDTA de 2 mM.
- Para preparar los medios de neurosfera, utilice un medio neurobasal que contenga penicilina/estreptomicina con L-glutamina y suplemento con 2% B27, 20 ng/ml factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (EGF), y 20 ng/ml factor de crecimiento básico de fibroblastos humano recombinante (bFGF).
- Para preparar medios de diferenciación, utilice el medio neurobasal y suplemente con factor diferenciado de 10 ng/ml factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AA) o factor inhibitorio de leucemia de 10 ng/ml (LIF) y 2% B27.
- Utilice placas de cultivo de unión ultrabaja de 12 pocillos (3,5 cm2)y 6 placas de cultivo (9,6 cm2).
2. Disección de Cerebellum
- Anestetizar cachorros de ratón (P3-P7) con isoflurano y decapitar usando tijeras quirúrgicas.
- Rocíe la cabeza separada de los cachorros con 70% de etanol.
- Transfiera cada cabeza a un plato de cultivo estéril vacío de 10 cm. Separe la piel usando las tijeras de microdisección, luego retire el cráneo ejecutando las tijeras sagital a lo largo de la línea media.
- Usando #7 fórceps, despegue los huesos del cráneo comenzando caudalmente desde el tronco encefálico. Levante cuidadosamente el cerebro con una espátula, manteniendo el cerebelo intacto, y transfiera el cerebro a un plato fresco estéril de 10,0 cm que contiene 15 ml de solución de solución de sal equilibrada (HBSS) de Hanks helada.
- Coloque el plato que contiene el cerebro bajo un microscopio de disección. Usando #5 fórceps finos, retire las meninges y los vasos sanguíneos grandes del cerebelo y separe el cerebelo del tronco encefálico usando la espátula.
- Transfiera el cerebelo a un tubo centrífugo de 15 ml que contenga 5,0 ml de solución HBSS helada. Lavar el cerebelo enrredado y decantar 3 veces con 5,0 ml de HBSS.
NOTA: Cada cerebelo debe colocarse en su propio tubo para su posterior procesamiento.
3. Preparación de la suspensión celular
- Después del último enjuague, añadir 5 ml de solución de disociación de tejido a base de papaína (basada en trabajos anteriores13,,18) que se haya precalentado a 37 oC. Incubar el tejido durante 15 min a 37 oC en un baño de agua. Mezcle lentamente el contenido invirtiendo el tubo hacia arriba y hacia abajo 3 veces cada 3 minutos, ya sea utilizando un mezclador de nueces o a mano.
- Prepare una pipeta Pasteur de diámetro ancho (pipeta de vidrio regular) y de diámetro estrecho (pulida al fuego calentando sobre un quemador Bunsen) como se describió anteriormente19.
- Lavar el tejido 3x con 5 ml de solución de HBSS, evitando la pérdida del tejido mientras se decanta a mano.
- Retire el último lavado de HBSS y agregue 5 ml de solución DPBS que contenga 250 ml de solución de DNase al tejido. Disociar el tejido triturando 10x–15x usando la pipeta Pasteur de diámetro ancho. Realice este paso suavemente para evitar la formación de burbujas.
- A continuación, incubar la suspensión durante 10 minutos adicionales a 37 oC en el baño de agua, mezclando invirtiendo y enderezando el tubo.
- Utilice la pipeta Pasteur de diámetro reducido para triturar aún más la suspensión de tejido 10x. Si quedan trozos grandes de tejido, presione las piezas de tejido contra la parte inferior del tubo con la punta de la pipeta suavemente y continúe pipeteando hasta que las células alcancen una suspensión fina.
- Incubar el tejido a 37oC durante 10 min adicionales, repitiendo los pasos de mezcla anteriores.
4. Inmunoetiquetado de células madre
- Coloque los tubos centrífugos sobre hielo y utilice soluciones heladas para los siguientes pasos. Colar las células disociadas a través de un colador de células de 40 m en un tubo centrífugo de 50 ml. Cubra el filtro con 10,0 ml de solución HBSS para asegurarse de que las celdas pasan a través de la malla en esta solución adicional.
- Transfiera las células filtradas a un tubo de centrífuga fresco de 15 ml y centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 10 min a 4 oC. Aspirar y desechar el sobrenadante completamente usando cuidadosamente un aspirador de vacío.
- Resuspenda el pellet en 160 ml de búfer de columna magnética. Para obtener la suspensión de una sola célula antes del etiquetado magnético, pase las células a través de una malla de nylon de 30 m para eliminar los grumos celulares, que de lo contrario pueden obstruir la columna.
- Añadir 40 ml de microperlas antiprominina-1 a cada tubo de 15 ml, mezclar e incubar en un refrigerador durante 15 minutos para que el anticuerpo se una a las células que expresan prominina-1.
- Lave las células agregando 1.0–2.0 mL de tampón de columna X y centrífuga a 300 x g durante 10 min. Apiratee completamente el sobrenadante.
- Resuspenda el pellet en 1,0 ml del búfer de columna X.
NOTA: Si se observan pequeños grumos después de la resuspensión de pellets con 1,0 ml de búfer de columna X, deben retirarse cuidadosamente utilizando una punta de la pipeta Pasteur, de lo contrario estos grumos pueden bloquear la columna magnética durante la clasificación celular.
5. Preparación de columnas magnéticas, clasificación de celdas y chapado
NOTA: La separación magnética de diferentes condiciones de genotipo (enfermedad frente a control) debe realizarse al mismo tiempo, ya que cualquier retraso puede afectar a la morfología de la neuroesfera.
- Prepare las columnas magnéticas colocándolas en el soporte magnético expuesto al campo magnético. Enjuague la columna una vez con 500 ml de tampón X aplicando el tampón que gotea en un tubo de centrífuga que se va a desechar.
NOTA: Preparar nuevo búfer de columna magnética X para cada experimento; si no, entonces el rendimiento de las células madre será bajo. - Aplique la suspensión de celda etiquetada en la columna. Recoger el flujo que contiene células no etiquetadas que consisten principalmente en células mixtas neuronales/gliales cerebelosas en tubos frescos de 15 ml(Figura 1A).
- Lavar la columna 3x con 500 l de tampón X (cada lavado tarda alrededor de 2-4 min).
NOTA: El cultivo mixto neuronal/glial cerebeloso enriquecido con neuronas granulares cerebelosas puede servir como un subproducto útil de este paso de purificación. - Retire la columna del campo magnético y colóquela en un tubo de 1,5 ml. Añadir 1,0 ml de medio de cultivo (medio de la neurosfera) a la columna y empujar el émbolo en la columna para eliminar las células etiquetadas con cuentas prominina-1 en un tubo de halcón fresco de 1,5 ml.
- Para mejorar la pureza de las células etiquetadas con prominina-1, pase las células eluidas sobre una segunda columna siguiendo los pasos 5.1–5.4.
- Cuente las células con un hemocaquímetro. El rendimiento típico es de 107 células por cerebelo. Placar las células en placas de unión ultrabajas (6 o 12 pozos, basado en la densidad requerida para los experimentos aguas abajo).
6. Passaging de las neuroesferas y la diferenciación
- Placar las células madre con etiqueta prominina-1 en placas de unión ultrabaja 12 pocillos en medio de la neurosfera (5.000 células/pozo).
- Después de 7-10 días, las células se dividen para producir neuroesferas flotantes en forma de bola (nósferas primarias).
NOTA: En este experimento, se generan neuroesferas secundarias que se expanden en números para su uso posterior. Las poblaciones de neuroesfera primaria no se utilizan para estos experimentos, ya que pueden contener células contaminantes que no tienen propiedades de células madre y pueden agruparse junto con las neuroesferas. - Para el passaging, transfiera las neuroesferas primarias junto con los medios de cultivo utilizando puntas de pipeta de 1,0 ml a un tubo de centrífuga estéril de 15 ml. Pellet las neuroesferas por centrifugación a 300 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
- Resuspenda el pellet en 5 ml de medios de disociación tisular que contenga papaína o solución de trippsina al 0,05%. Incubar a 37oC durante 10 min.
- Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min. Resuspender las células en 5 ml de medio de la neurosfera y disociar las células mecánicamente utilizando una pipeta Pasteur de plástico y pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo 10x.
- Placa las células (de nuevo) en los medios de la neuroesfera como se describió anteriormente. Después de 7-10 días en el cultivo, la placa debe enriquecerse con neuroesferas secundarias.
NOTA: Estos cultivos se pueden pasar hasta 8 veces con buena eficiencia, después de lo cual el tamaño de la neuroesfera tiende a ser más pequeño y sugiere una disminución en la proliferación. - Cuente las células en el hemocitómetro y placa el número óptimo para futuros experimentos en placas recubiertas de poli-D-lisina (6 o 12 pozos).
- Para diferenciar las células madre, recoger las neuroesferas del segundo al octavo pasaje por centrifugación como se describió anteriormente, excepto añadir medio de diferenciación al pellet.
NOTA: Después de 7 días in vitro, las células madre se diferencian en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, como se demuestra mediante la tinción con el marcador neuronal de la tubulina,III marcador astrocítico GFAP y el fabricante de oligodendrocitos O4.
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Representative Results
Las células madre cerebelosas posnatales promininas-1 positivas formaron neuroesferas en neuroesferas medianas ricas en factores de crecimiento (EGF y bFGF). Estas neuroesferas fueron positivas para la prominina-1-tinción, el marcador utilizado para el aislamiento, y también como una mancha para otros marcadores de células madre como Nestin y GFAP13 (Figura 1). La expresión del marcador de células madre se mantuvo durante todo el cultivo y hasta por lo menos ocho pasajes20. Tras la retirada de los factores de crecimiento y en presencia de LIF y PDGF-AA (que son factores que apoyan la diferenciación neuronal y glial21,,22), las neuroesferas diferenciadas en linajes neuronales y gliales(Figura 2).
Figura 1: Aislamiento de las células madre prominina-1 del cerebelo postnatal. (A) Las células madre cerebelosas se aislaron utilizando cuentas inmunomagnéticas de prominina-1. Panel superior: Las células madre purificadas (enlazadas a columnas) formaron neuroesferas con una amplia proliferación y propiedades de auto-renovación. Las células no enlazadas a la columna (flujo) no podían formar neuroesferas; en su lugar, se convirtieron en células mixtas neuronales/gliales cerebelosas (tubulina-III/GFAP). Panel inferior: las neuroesferas formadas a partir de prominina-1+ células que expresan marcadores específicos de células madre: Nestin, prominina-1 y GFAP. (B) Células en el flujo a través de teñidas negativas para marcadores de células madre prominina-1 y nestina y positivas para el marcador neuronal de la tubulina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diferenciación de las neuroesferas positivas de prominina-1. En presencia de factores de diferenciación (PDGF-AA o LIF), las neurosferas protina-1 positivas diferenciadas en neuronas (tubulina -III), astrocitos (GFAP) y oligodendrocitos (O4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las células madre cerebelosas promininas-1 que expresan residen en la materia blanca prospectiva durante las primeras 3 semanas de vida postnatal. Su proliferación está estrechamente controlada por la vía sónica del erizo apoyada por las células de Purkinje17. Estas células madre / progenitores contribuyen a las interneuronas GABAérgicas de nacimiento posterior llamadas células de la cesta y células estelares. Estas interneuronas residen en la capa molecular, donde sinapsis en las células de Purkinje y esculpen la topografía del PC y funcionan a través de la inhibición GABAérgica13,,17,23. Además de formar interneuronas, esta población de células madre también genera todos los astrocitos cerebelosos de origen posnatal17,,24.
Este protocolo describe un método fácil y rentable para purificar las células madre prominina-1/CD133 del cerebelo del ratón postnatal. Las células madre deben ser cultivadas en placas de fijación ultrabajas. La cultuación de estas células madre en placas normales puede hacer que las neuroesferas se adhieran a la superficie y conducir a una baja proliferación y diferenciación de células madre. Aquí, el rendimiento de 200–300 neuroesferas por cada 5.000 células corresponde a un rendimiento de células madre de alrededor de 1 x 107 células de un solo cerebelo. Esto es comparable a lo que se ha descrito para una estrategia basada en FACS que es 10 veces más cara. Además, los equipos FACS requieren un personal costoso y altamente capacitado, y no está fácilmente disponible.
Estas células madre también están ganando cada vez más importancia traslacional en la investigación sobre el cáncer, así como trastornos neurodesarrollo y neurodegenerativos25,,26,27. La proliferación incontrolada de estas células madre en la primera vida conduce al medulloblastoma28,mientras que la investigación de nuestro propio laboratorio sugiere que su proliferación y diferenciación anormal puede contribuir a la degeneración cerebelosa posterior en la enfermedad genética de la ataxia espinosa tipo 120. Estos nuevos protocolos serán valiosos para estudiar estas células y proporcionarán una visión novedosa de sus funciones en salud y enfermedades. Estos métodos también pueden conducir a avances en terapias regenerativas después de accidente cerebrovascular o trauma y otros insultos al cerebro que justificarían la neuroregeneración. Es concebible que estas técnicas se puedan generalizar para extraer células madre promininas-1-expresas de otros tejidos, como el intestino y la médula ósea, donde también se expresan15,,29.
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Disclosures
No se declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros del laboratorio Opal por sus sugerencias. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NIH 1RO1 NS062051 y 1RO1NS08251 (Opal P)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2 mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Culture plates ultra - low attachment | Corning | 3473 | |
| Cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/mL |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/mL |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/mL) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/mL |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40 μm |
References
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