Summary
Demonstrado aqui é um método eficiente e econômico para purificar, cultura e diferenciar células-tronco de matéria branca do cerebelo de rato pós-natal.
Abstract
A maioria dos neurônios cerebelares surge de dois nichos embrionários: um nicho labial rombônico, que gera todos os neurônios glutamatergicos excitatórios cerebelares, e um nicho de zona ventricular, que gera as células purkinje sinógicas inibidoras, que são neurônios que constituem os núcleos cerebelares e a glia de Bergman. Recentemente, um terceiro nicho de células-tronco foi descrito que surge como uma zona germinal secundária do nicho da zona ventricular. As células deste nicho são definidas pelo marcador de superfície celular prominin-1 e são localizadas para a matéria branca em desenvolvimento do cerebelo pós-natal. Este nicho explica a camada molecular de nascimento tardio dos interneurônios GABAergic, juntamente com os astrócitos cerebelares gerados no pós-natal. Além de seu papel de desenvolvimento, esse nicho vem ganhando importância translacional no que diz respeito ao seu envolvimento na neurodegeneração e tumorigênese. A biologia dessas células tem sido difícil de decifrar devido à falta de técnicas eficientes para sua purificação. Aqui estão demonstrados métodos eficientes para purificar, cultura rastamente e diferenciar essas células-tronco cerebelares pós-natal.
Introduction
O cerebelo foi há muito reconhecido como um grande circuito neuronal que coordena o movimento voluntário1. Ele recebe entrada das amplas faixas do neuroeixo, que inclui informações proprioceptivas da periferia, de modo a ajustar a saída do motor e coordenar o movimento. Mais recentemente, também foi implicado na regulação da cognição e das emoções por potencialmente usar redes de processamento de informações semelhantes2,3,4.
O cerebelo adulto é composto por um córtex cerebelar externo e matéria branca interior. Intercalados dentro dessas estruturas são núcleos intracerebelares profundos. Semelhante ao resto do sistema nervoso, o desenvolvimento do cerebelo é impulsionado pela proliferação de células progenitoras multipotentes (células-tronco) que migram e se diferenciam para produzir essa estrutura bem organizada. No desenvolvimento precoce (E10.5-E13.5), um nicho ventricular em torno do quarto ventrículo em desenvolvimento gera neurônios GABAergic (ou seja, células purkinje, células de Lugaro, células Golgi) juntamente com Bergmann glia5,6,7,8.
Mais tarde em desenvolvimento (semana pós-natal um), um segundo nicho de células-tronco no lábio rombico gera progenitores expressivos math1 e nestin que dão origem a neurônios de granulo excitatório9,,10,11,12. Recentemente, um terceiro nicho de células-tronco foi descrito13. Essas células expressam promininina-1 (também conhecida como CD133), uma glicoproteína de membrana que define um subconjunto de células-tronco no intestino e sistemas hematopoiéticos14,15,16. O mapeamento do destino in vivo mostra que essas células-tronco geram interneurônios de camada molecular chave (ou seja, células cestas e células estelares), juntamente com astrócitos, durante as três primeiras semanas pós-natal. No passado, tem sido difícil estudar essas células in vitro porque métodos anteriores exigiram técnicas caras e demoradas (ou seja, classificação celular ativada por fluorescência [FACS]) que dependem da coloração prominin-112,13,17. Este protocolo descreve um método de base imunomagnética para o isolamento dessas células-tronco que podem então ser facilmente cultivadas e diferenciadas.
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Protocol
Todos os experimentos em animais foram realizados em conformidade com o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (2011) do NIH e aprovados pelo IACUC da Universidade northwestern (Protocolo IS00011368).
1. Preparação de Soluções
- Preparar a solução de dissociação tecidual feita a partir do fenol estéril contendo a solução de soro tamponado de dulbecco (DPBS) com papaína (100 U/ml), cisteína (0,2 mg/ml) e DNase (250 U/ml).
- Para preparar a solução DNase diluir 100 mg do pó liofilizado de DNase I (uma garrafa) em 50 mL de H2O. Misture bem e filtre a solução de estoque. Prepare as alíquotas de estoque de 10 mL. Divida um tubo de estoque em alíquotas de uso único de 0,5 mL. Armazene estas alíquotas de uso único a -80 °C.
- Prepare os reagentes de separação magnética preparando o tampão da coluna magnética X: 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e solução EDTA de 2 mM.
- Para preparar a mídia neurosfera, use meio neurobasal contendo penicilina/estreptomicina com L-glutamina e suplemento com 2% B27, 20 ng/mL fator de crescimento epidérmico humano (EGF) e 20 ng/mL fator de crescimento básico de fibroblasto humano recombinante (bFGF).
- Para preparar meios de diferenciação, utilize o meio neurobasal e o suplemento com fator de crescimento derivado de plaquetas de 10 ng/mL (PDGF-AA) ou fator inibidor de leucemia de 10 ng/mL (LIF) e 2% B27.
- Use acessórios ultra-baixos 12 bem (3,5 cm2) e 6 placas de cultura de poço (9,6 cm2).
2. Dissecção de Cerebelo
- Anestesie filhotes de rato (P3-P7) com isoflurano e decapitam usando tesoura cirúrgica.
- Borrife a cabeça separada dos filhotes com 70% de etanol.
- Transfira cada cabeça para um prato de cultura estéril vazio de 10 cm. Separe a pele usando a tesoura de microdissecção e, em seguida, remova o crânio executando a tesoura sagital ao longo da linha média.
- Usando #7 fórceps, retire os ossos do crânio começando caudally do tronco cerebral. Levante cuidadosamente o cérebro usando uma espátula, mantendo o cerebelo intacto, e transfira o cérebro para um prato fresco e estéril de 10,0 cm contendo 15 mL de solução de Sal Balanceado (HBSS) gelada de Hanks.
- Coloque o prato contendo o cérebro sob um microscópio de dissecção. Usando fórceps de #5 fino, remova as meninges e vasos sanguíneos grandes do cerebelo e separe o cerebelo do tronco cerebral usando a espátula.
- Transfira o cerebelo para um tubo centrífuga de 15 mL contendo 5,0 mL de solução HBSS gelada. Lave o cerebelo enxaguando e decantando 3x com 5,0 mL de HBSS.
NOTA: Cada cerebelo deve ser colocado em seu próprio tubo para posterior processamento.
3. Preparação da suspensão celular
- Após a última lavagem, adicione 5 mL de solução de dissociação tecidual à base de papaína (com base no trabalho anterior13,18) que foi pré-aquecido a 37 °C. Incubar o tecido por 15 min a 37 °C em banho-maria. Misture lentamente o conteúdo invertendo o tubo para cima e para baixo 3x-5x a cada 3 min, usando uma batedeira de nozes ou à mão.
- Prepare um diâmetro largo (pipeta de vidro regular) e uma pipeta pasteur de diâmetro estreito (polida pelo fogo por aquecimento sobre um queimador de Bunsen) como descrito anteriormente19.
- Lave o tecido 3x com 5 mL de solução HBSS, evitando a perda do tecido enquanto decanta à mão.
- Remova a última lavagem HBSS e adicione 5 mL de solução DPBS contendo 250 μL de solução DNase ao tecido. Dissociar o tecido triturando 10x-15x usando a pipeta pasteur de diâmetro largo. Realize este passo suavemente para evitar a formação de bolhas.
- Em seguida, incubar o chorume por mais 10 min a 37 °C no banho-maria, misturando-se invertendo e endireitando o tubo.
- Use a pipeta Pasteur de diâmetro reduzido para triturar ainda mais o chorume de tecido 10x. Se permanecerem pedaços grandes de tecido, pressione os pedaços de tecido contra a parte inferior do tubo com a ponta da pipeta suavemente e continue pipetando até que as células atinjam uma suspensão fina.
- Incubar o tecido a 37 °C por mais 10 min, repetindo as etapas de mistura anteriores.
4. Imunorotulagem de Células-Tronco
- Coloque os tubos de centrífuga no gelo e use soluções geladas para os próximos passos. Coe as células dissociadas através de um filtro de células de 40 μm em um tubo de centrífuga de 50 mL. Cubra o filtro com 10,0 mL de solução HBSS para garantir que as células passem pela malha nesta solução adicional.
- Transfira as células filtradas para um tubo de centrífuga fresco de 15 mL e centrifuga a suspensão celular a 300 x g por 10 min a 4 °C. Aspire e descarte o sobrenadante completamente usando cuidadosamente um aspirador de vácuo.
- Resuspenda a pelota em 160 μL de tampão de coluna magnética. Para obter a suspensão unicelular antes da rotulagem magnética, passe as células através de uma malha de nylon de 30 μm para remover aglomerados celulares, que de outra forma podem entupir a coluna.
- Adicione 40 μL de microesferas anti-prominin-1 a cada tubo de 15 mL, misture e incubaem em uma geladeira por 15 min para que o anticorpo se ligue às células expressas de prominin-1.
- Lave as células adicionando 1,0-2,0 mL de tampão de coluna X e centrífuga a 300 x g por 10 min. Aspirar o sobrenadante completamente.
- Ressuspensão da pelota em 1,0 mL do tampão da coluna X.
NOTA: Se pequenas aglomerações forem vistas após a resuspensão da pelota com 1,0 mL de tampão de coluna X, elas devem ser removidas cuidadosamente usando uma ponta da pipeta Pasteur, caso contrário, essas aglomerações podem bloquear a coluna magnética durante a triagem celular.
5. Preparação da coluna magnética, classificação celular e chapeamento
NOTA: A separação magnética de diferentes condições genótipos (doença vs. controle) deve ser realizada ao mesmo tempo, uma vez que qualquer atraso pode afetar a morfologia da neuroesfera.
- Prepare as colunas magnéticas colocando-as no suporte magnético exposto ao campo magnético. Enxágüe a coluna uma vez com 500 μL de tampão X aplicando tampão que escorre em um tubo de centrífuga para ser descartado.
NOTA: Prepare o tampão de coluna magnética X fresco para cada experimento; se não, então o rendimento das células-tronco será baixo. - Aplique a suspensão da célula rotulada na coluna. Coletar o fluxo através de células não rotuladas que consistem principalmente de células mistas neuronais/gliais cerebelares em tubos frescos de 15 mL(Figura 1A).
- Lave a coluna 3x com 500 μL de tampão X (cada lavagem leva em torno de 2-4 min).
NOTA: A cultura mista neuronal/glial cerebelar enriquecida com neurônios granulares cerebelares pode servir como um subproduto útil desta etapa de purificação. - Remova a coluna do campo magnético e coloque em um tubo de 1,5 mL. Adicione 1,0 mL de meio de cultura (meio neurosfera) à coluna e empurre o êmbolo para dentro da coluna para eliminar as células marcadas com contas de prominin-1 em um tubo falcão fresco de 1,5 mL.
- Para aumentar a pureza das células rotuladas prominin-1, passe as células eluidas sobre uma segunda coluna seguindo os passos 5.1-5.4.
- Conte as células com um hemocytometer. O rendimento típico é de 107 células por cerebelo. Emplacaas as células em placas de fixação ultra-baixas (6 ou 12 bem, com base na densidade necessária para experimentos a jusante).
6. Passização de Neuroesferas e Diferenciação
- Emplacaas as células-tronco com rótulo de prominin1 em fixação ultra-baixa 12 placas de poço no meio neurosfera (5.000 células/bem).
- Após 7-10 dias, as células se dividem para produzir neuroesferas flutuantes em forma de bola (neuroesferas primárias).
NOTA: Neste experimento, as neuroesferas secundárias que se expandem em números são geradas para uso posterior. As populações de neuroesferas primárias não são utilizadas para esses experimentos, pois podem conter células contaminantes que não possuem propriedades de células-tronco e podem se agrupar com as neuroesferas. - Para passar, transfira as neuroesferas primárias junto com a mídia de cultura usando pontas de pipeta de 1,0 mL para um tubo de centrífuga estéril de 15 mL. Pelota as neuroesferas por centrifugação a 300 x g por 5 min e descarte o sobrenadante.
- Resuspender a pelota em 5 mL de meios de dissociação tecidual que contenham papaína ou solução de tripsina de 0,05%. Incubar a 37 °C por 10 min.
- Centrifugar a suspensão celular a 300 x g por 5 min. Resuspender as células em 5 mL de meio neurosfera e dissociar as células mecanicamente usando uma pipeta pasteur de plástico e lentamente pipetando para cima e para baixo 10x.
- Placas as células (novamente) na mídia neurosfera como descrito anteriormente. Após 7-10 dias na cultura, a placa deve ser enriquecida com neuroesferas secundárias.
NOTA: Essas culturas podem ser passar até 8x com boa eficiência, após a qual o tamanho da neurosfera tende a ser menor e sugestivo de uma diminuição da proliferação. - Conte as células no hemocytometro e emplacre o número ideal para experimentos futuros em placas revestidas de poli-lysina (6 ou 12 poços).
- Para diferenciar as células-tronco, coletar neuroesferas da segunda à oitava passagem por centrifugação como descrito anteriormente, exceto adicionar meio de diferenciação à pelota.
NOTA: Após 7 dias in vitro, as células-tronco se diferenciam em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos, como demonstrado pela coloração com o marcador neuronal β-III túbulina, marcador ascóctico GFAP e fabricante de oligodendrocyte O4.
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Representative Results
As células-tronco cerebelares pós-natal prominin-1-positivas formaram neuroesferas na média neurosfera rica em fatores de crescimento (EGF e bFGF). Estas neuroesferas foram positivas para a coloração de prominin-1, o marcador usado para o isolamento, e também como uma mancha para outros marcadores de células-tronco como Nestin e GFAP13 (Figura 1). A expressão do marcador de células-tronco foi mantida em toda a cultura e por pelo menos oito passagens20. Após a retirada dos fatores de crescimento e na presença de LIF e PDGF-AA (fatores que suportam diferenciação neuronal e glial21,22), as neuroesferas diferenciadas em linhagens neuronais e gliais(Figura 2).
Figura 1: Isolamento das células-tronco prominin-1 do cerebelo pós-natal. (A) Ascélulas-tronco cerebelares foram isoladas usando contas de promininin-1 imunomagnéticas. Painel superior: Células-tronco purificadas (ligadas à coluna) formaram neuroesferas com extensa supressão de proliferação e auto-renovação. As células desvinculadas da coluna (fluindo) não foram capazes de formar neuroesferas; em vez disso, tornaram-se células mistas neuronares/gliais cerebelares (β-III tubbulin/GFAP). Painel inferior: as neuroesferas formadas a partir de prominin-1+ células expressando marcadores específicos de células-tronco: Nestin, prominin-1 e GFAP. (B) Células no fluxo através de manchas negativas para marcadores de células-tronco prominin-1 e nestin e positivo para o marcador neuronal β-III tubbulina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diferenciação das neuroesferas positivas prominin-1. Na presença de fatores de diferenciação (PDGF-AA ou LIF), as neuroesferas promininin-1-positivas diferenciadas em neurônios (β-III tubbulina), astrócitos (GFAP) e oligodendrócitos (O4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As células-tronco cerebelares expressas em prominin-1 residem na matéria branca em potencial durante as primeiras 3 semanas de vida pós-natal. Sua proliferação é fortemente controlada pela via de ouriço sônico apoiada pelas células Purkinje17. Essas células-tronco/progenitores contribuem para interneurônios GABAergic os nascidos posteriormente chamados células cestas e células estelares. Estes interneurônios residem na camada molecular, onde sinapse nas células purkinje e esculpe a topografia do PC e funcionam via inibição GABAergica 13,17,23. Além de formar interneurônios, essa população de células-tronco também gera todos os astrócitos cerebelares derivados do pós-natal17,24.
Este protocolo descreve um método fácil e econômico para purificar as células-tronco prominin-1/CD133 do cerebelo do rato pós-natal. As células-tronco devem ser cultivadas em placas de fixação ultra-baixas. A cultura dessas células-tronco em placas normais pode fazer com que as neuroesferas se conectem à superfície e levem à baixa proliferação e diferenciação de células-tronco. Aqui, o rendimento de 200-300 neuroesferas por 5.000 células corresponde a um rendimento de células-tronco de cerca de 1 x107 células de um único cerebelo. Isso é comparável ao que foi descrito para uma estratégia baseada em FACS que é 10x mais cara. Além disso, os equipamentos FACS exigem uma configuração cara e pessoal altamente treinado, e não está prontamente disponível.
Essas células-tronco também estão ganhando cada vez mais significado translacional nas pesquisas sobre o câncer, bem como distúrbios neurodesenvolvimentísticos e neurodegenerativos25,26,27. A proliferação descontrolada dessas células-tronco no início da vida leva ao meduloblastoma28, enquanto pesquisas do nosso próprio laboratório sugerem que sua proliferação e diferenciação anormal podem contribuir para a degeneração cerebelar posterior na doença genética ataxia spinocerebellar tipo 120. Esses novos protocolos serão valiosos para estudar essas células e fornecer novas informações sobre seus papéis na saúde e na doença. Esses métodos também podem levar a avanços em terapias regenerativas após acidente vascular cerebral ou trauma e outros insultos ao cérebro que justificariam a neuroregeneração. É concebível que essas técnicas possam ser generalizadas para extrair células-tronco expressas de prominin-1 de outros tecidos, como intestino e medula óssea, onde também são expressas15,29.
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Disclosures
Não são declarados conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos aos membros do laboratório opala por suas sugestões. Este trabalho foi apoiado pelas subvenções do NIH 1RO1 NS062051 e 1RO1NS08251 (Opal P)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05%Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 0.05% |
| 2% B27 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| 2 mM EDTA solution | Corning | 46-034-CI | |
| Anti- Prominin-1 microbeads | Miltenyi Biote | 130-092-333 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| Column MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Culture plates ultra - low attachment | Corning | 3473 | |
| Cysteine | Sigma | C7880 | |
| DNase | Sigma | D4513-1VL | 250 U/ml |
| Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline | Thermo Fisher Scientific | 14040141 | |
| Hank's balanced salt solution-HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| Human recombinant Basic Fibroblast Growth Factor | Promega | G507A | 20 ng/mL |
| Human recombinant Epidermal Growth Factor | Promega | G502A | 20 ng/mL |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | |
| l-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Microscopy | Lieca TCS SP5 confocal microscopes | ||
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-Prominin-1 | Affymetrix eBioscience | 14-1331 | 1 in 100 |
| Nestin | Abcam | ab27952 | 1 in 200 |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 25030081 | |
| O4 | Millopore | MAB345 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | (100 U/mL) |
| Platelet- Derived Growth Factor | Sigma | H8291 | 10 ng/mL |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Rabbit anti-tubulin, b-III | Sigma | T2200 | 1 in 500 |
| Rabit anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1 in 500 |
| Separation columns-MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Sterile cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40 μm |
References
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