Gebruik van de pyrimidine analoge, 5-jood-2′-deoxyuridine (IdU) met celcyclusmarkers om celcyclusfasen vast te stellen in een massacytometrieplatform

Summary

Dit protocol past celcyclusmetingen aan voor gebruik in een massacytometrieplatform. Met de multiparametermogelijkheden van massacytometrie maakt directe meting van jodiumopname identificatie van cellen in S-fase mogelijk, terwijl intracellulaire cyclusmarkers karakterisering van elke celcyclustoestand in een reeks experimentele omstandigheden mogelijk maken.

Abstract

De regulatie van de celcyclusfase is een belangrijk aspect van cellulaire proliferatie en homeostase. Verstoring van de regulerende mechanismen die de celcyclus regelen, is een kenmerk van een aantal ziekten, waaronder kanker. Studie van de celcyclus vereist het vermogen om het aantal cellen in elk deel van de celcyclusprogressie te definiëren en om duidelijk af te bakenen tussen elke celcyclusfase. De komst van massacytometrie (MCM) biedt een enorm potentieel voor single cell-analyse met hoge doorvoer door directe metingen van elementaire isotopen, en de ontwikkeling van een methode om de celcyclustoestand door MCM te meten, breidt het nut van MCM verder uit. Hier beschrijven we een methode die direct 5-jood-2′-deoxyuridine (IdU) meet, vergelijkbaar met 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU), in een MCM-systeem. Het gebruik van deze op IdU gebaseerde MCM biedt verschillende voordelen. Ten eerste wordt IdU snel opgenomen in DNA tijdens de synthese, waardoor betrouwbare metingen van cellen in de S-fase mogelijk zijn met incubaties zo kort als 10-15 minuten. Ten tweede wordt IdU gemeten zonder de noodzaak van secundaire antilichamen of de noodzaak van DNA-afbraak. Ten derde kan IdU-kleuring gemakkelijk worden gecombineerd met meting van cycline B1, gefosforyleerd retinoblastoomeiwit (pRb) en gefosforyleerd histon H3 (pHH3), dat gezamenlijk een duidelijke afbakening van de vijf celcyclusfasen biedt. De combinatie van deze celcyclusmarkers met het grote aantal parameters dat mogelijk is met MCM maakt combinatie met tal van andere statistieken mogelijk.

Introduction

Massacytometrie maakt detectie van ongeveer 40 parameters mogelijk door gebruik te maken van de hoge resolutie en kwantitatieve aard van massaspectroscopie. Metaalgelabelde antilichamen worden gebruikt in plaats van fluorofoor geconjugeerde antilichamen die een groter aantal kanalen mogelijk maken en minimale spillover produceren ^1,2. MCM heeft voor- en nadelen met betrekking tot celcyclusanalyse in vergelijking met flowcytometrie. Een groot voordeel van MCM is dat het grote aantal parameters de gelijktijdige meting van de celcyclustoestand mogelijk maakt over een groot aantal immunofenotypisch verschillende T-celtypen in zeer heterogene monsters. MCM is met succes gebruikt om de celcyclustoestand te meten tijdens normale hematopoëse in humaan beenmerg³ en transgene muizenmodellen van telomerasedeficiëntie⁴. Analyse van de celcyclustoestand bij acute myeloïde leukemie (AML) toonde aan dat de celcyclus correleerde met bekende reacties op klinische therapieën, wat een in vivo inzicht gaf in functionele kenmerken die therapieselecties kunnen informeren⁵. Een tweede voordeel van massacytometrische celcyclusanalyse is de mogelijkheid om een groot aantal andere functionele markers te meten die kunnen worden gecorreleerd met de celcyclustoestand. Recent werk is in staat geweest om eiwit- en RNA-synthese te correleren met de celcyclustoestand door het gebruik van IdU en metaalgelabelde antilichamen tegen BRU en rRNA⁶. Dit soort zeer parametrische analyse die de celcyclustoestand meet over talrijke populaties in een continuüm van differentiatie zou bijna onmogelijk zijn met de huidige flowcytometrietechnologie. Het grote nadeel van MCM is het ontbreken van vergelijkbare DNA- of RNA-vlekken als die worden gebruikt in fluorescerende flowcytometrie (bijv. DAPI, Hoechst, Pyronine Y, enz.). Fluorescerende kleurstoffen kunnen relatief nauwkeurige metingen van DNA- en RNA-gehalte geven, maar deze precisie is alleen mogelijk vanwege de veranderingen in de fluorescerende eigenschappen van deze kleurstoffen die optreden bij intercalatie tussen nucleotidebasen. MCM-analyse is dus niet in staat om DNA- of RNA-inhoud met vergelijkbare precisie te meten. In plaats daarvan is massacytometrische celcyclusanalyse gebaseerd op metingen van eiwitten die verband houden met de celcyclustoestand, zoals cycline B1, gefosforyleerd retinoblastoomeiwit (pRb) en gefosforyleerd histon H3 (pHH3) in combinatie met directe meting van het jodiumatoom van IdU-opname in S-fasecellen. Deze twee meetbenaderingen leveren zeer vergelijkbare resultaten op tijdens normale cellulaire proliferatie, maar kunnen mogelijk dissonant zijn wanneer de progressie van de celcyclus wordt verstoord.

Meting van het aantal cellen in elke celcyclusfase is belangrijk voor het begrijpen van de normale ontwikkeling van de celcyclus en de verstoring van de celcyclus, die vaak wordt waargenomen bij kankers en immunologische ziekten. MCM biedt betrouwbare meting van extracellulaire en intracellulaire factoren met behulp van metaalgelabelde antilichamen; de meting van de S-fase was echter beperkt omdat de op iridium gebaseerde DNA-intercalator geen onderscheid kon maken tussen 2N- en 4N-DNA. Om celcyclusfasen te definiëren, ontwikkelde Behbehani een methode die IdU gebruikt met een massa van 127, die binnen het bereik van de massacytometer valt en directe meting van cellen in S-fase³ mogelijk maakt. Deze directe meting omzeilt de noodzaak van secundaire antilichamen of het gebruik van DNA-denatureringsmiddelen zoals zuur of DNase. In combinatie met intracellulaire cyclusmarkers maakt het een hoge resolutie van celcyclusverdeling in experimentele modellen mogelijk.

Dit protocol past celcyclusmetingen aan van gangbare flowcytometrieprotocollen voor MCM. Onze methoden bieden een handige en eenvoudige manier om celcyclusparameters op te nemen. IdU-opname van in vitro monsters vereist slechts 10 tot 15 minuten incubatie bij 37 °C, wat korter is dan de meeste BrdU-kleuringsprotocollen die incubatietijden van enkele uren aanbevelen ^3,7. IdU- en BrdU-geïncorporeerde monsters kunnen worden gefixeerd met behulp van een proteomische stabilisator en vervolgens enige tijd worden bewaard in een vriezer van -80 °C. Hierdoor kunnen grote aantallen IdU-gekleurde monsters worden gearchiveerd voor batchanalyse zonder dat de monsterkwaliteit wordt verminderd.

Protocol

1. Voorbereiding van IdU-voorraden

1. Los 5-jood-2'-deoxyuridine (IdU) op in DMSO tot een concentratie van 50 mM. Steriel filter, aliquot in buizen van 10-50 μL en bewaren bij -80 °C
2. Haal IdU uit de vriezer en ontdooi bij kamertemperatuur. Verdun IdU in RPMI-1640 om een werkoplossing te maken bij een eindconcentratie van 1 mM. Pipetteer op en neer of vortex om te mengen.
   1. Verdun doorgaans de geconcentreerde IdU in de media waarin de cellen worden gekweekt (bijv. DMEM, IMDM, enz.) of verdund tot PBS voor directe toevoeging aan perifere bloed- of beenmergaspiraatmonsters. Deze voorverdunningsstap vergemakkelijkt het mengen van de DMSO met de waterige media van de cellen van belang.
      OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van IdU tijdens incubatie moet 10 μM zijn; een oplossing van 1 mM kan worden toegevoegd in een verhouding van 10 μL tot elke 1 ml media.

2. IdU-incubatie en monsterconservering

1. Bewaar de monsters in een bevochtigde incubator van 37 °C. Verwijder het monster uit de incubator en verplaats het monster in een bioveiligheidskap.
2. Voeg 10 μL 1 mM IdU toe aan elke 1 ml monster.
   1. Voeg voor een plaat met 6 putten 30 μL 1 mM IdU toe aan de 3 ml kweekmedia in elke put. IdU kan ook direct worden gebruikt in beenmergaspiraten en muizenonderzoek⁴.
3. Plaats het monster gedurende 10-15 minuten terug in de incubator bij 37 °C. Houd cellen onder de optimale groeiomstandigheden van belang tijdens IdU-blootstelling om de meest nauwkeurige meting van de S-fase te krijgen.
4. Verwijder na de IdU-incubatie het monster en breng het over naar een conische buis.
5. Draai het monster gedurende 10 minuten op kamertemperatuur op 400 x g .
6. Zuig het supernatant op en resuspensie in 200 μL PBS.
   1. Voer indien nodig een levende / dode kleuring uit (met behulp van cisplatine) bij deze stap om dode cellen te markeren voordat ze worden gefixeerd en bevroren.
      OPMERKING: Rhodium levend/dood kleuring presteert niet goed na methanolpermeabilisatie, dus het wordt niet aanbevolen voor gebruik in celcyclusanalyses.
7. Voeg 18,75 μL 16% paraformaldehyde (PFA) toe aan de PBS voor een eindconcentratie van 1,5% PFA. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Draai het monster gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur naar beneden op 400 x g .
8. Zuig de PBS/PFA-oplossing aan en suspensie het monster opnieuw in 500 μL celkleuringsmedia (CSM; 1x PBS met 0,5% BSA en 0,02% natriumazide) + 10% DMSO vóór het invriezen.
   1. Als u een commerciële proteomische stabilisator gebruikt, voegt u 280 μl proteomische stabilisator toe aan het monster dat opnieuw wordt gesuspendeerd in 200 μl PBS (1:1.4). Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en plaats ze vervolgens direct in de -80 °C.
      OPMERKING: Van IdU is aangetoond dat het effectief wordt opgenomen binnen 10-15 minuten incubatie bij 37 °C. IdU-incubaties langer dan 10-15 minuten zullen de resolutie van de S- en G2-fasepopulaties geleidelijk verminderen, omdat IdU-gelabelde cellen de S-fase verlaten en doorgaan naar de G2- of M-fase. We hebben ook waargenomen dat langdurige incubatie met IdU celdood en celcyclusartefacten kan veroorzaken. De daaropvolgende celverwerking en antilichaamkleuring na IdU-opname is voldoende om resterende IdU weg te spoelen die niet in S-fasecellen is opgenomen. We hebben geen significante jodiumachtergrond waargenomen bij het gebruik van het hier beschreven in vitro protocol; We hebben echter zeer zelden jodiumbesmetting waargenomen in klinische monsters. Dit kan gebeuren door medische procedures, zoals jodiumcontrast in een CT-scan, of door jodiumbevattende geneesmiddelen. Als grote hoeveelheden IdU-achtergrond worden waargenomen, mag het monster niet worden uitgevoerd om schade aan de detector van de massacytometer te voorkomen.

3. Kleuringsmonsters voor massacytometrie

1. Verwijder de monsters van de -80 °C en laat ontdooien voordat u het oppervlak kleurt.
   1. Als u de SmartTube-fixatiemethode gebruikt, ontdooi de monsters dan bij 0-4 °C om extra fixatie te voorkomen terwijl de monsters opwarmen.
2. Nadat de monsters zijn ontdooid, brengt u ongeveer 1-2 miljoen cellen over in een FACS-buis van 5 ml.
3. Centrifugeer de FACS-buis op 600 x g gedurende 5 minuten en vul de FACS-buis met celkleuringsmedia (CSM) om de cellen te wassen. Herhaal dit nog een keer.
   1. Als bekend is dat cellen aan elkaar plakken, voeg dan 400 U / ml heparine toe aan CSM-wasbeurten om cel-tot-celcontact te voorkomen, maar dit is niet strikt noodzakelijk.
4. Incubeer de cellen met FC-blokkerend middel, 5 μL van het middel per 100 μL cellen, gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
5. Bereid een mengsel van antilichamen dat het oppervlak of het extracellulaire deel van de cellen zal kleuren. Het totale kleuringsmengsel bedraagt 100 μL per 1-2 miljoen cellen in elke test. Het kleuringsmengsel wordt dienovereenkomstig gebalanceerd met CSM en heparine in de cocktail en FACS-buis.
   OPMERKING: Toevoeging van CSM bij deze stap vermindert ook niet-specifieke kleuringsartefacten⁸. Dit kleuringsmengsel is volledig afhankelijk van doelen van belang en oppervlaktefenotype (een studie met T-cellen zal bijvoorbeeld een oppervlaktemengsel van CD45, CD3, CD4, CD8, enz. Gebruiken). Een gedetailleerd protocol van monsterverwerking en kleuring is te vinden in Behbehani en McCarthy et ^al.9,10.
6. Voeg het oppervlaktekleuringsmengsel toe aan de cellen en incubeer bij kamertemperatuur met continu schudden gedurende 30-60 minuten.
7. Vul na het kleuren de FACS-buis met CSM en draai gedurende 5 minuten op 600 x g .
8. Was nog twee keer met CSM, draai het monster gedurende 5 minuten op 600 x g en zuig elke CSM-wasbeurt op.
9. Repareer de extracellulaire antilichamen door 1 ml PBS toe te voegen met 10% CSM en 1,5% PFA.
10. Vul de FACS-buis met het PBS/CSM/PFA-mengsel met CSM. Draai 5 minuten naar beneden op 600 x g en zuig het supernatant op.
11. Voeg methanol toe bij -20 °C.
12. Draai het monster gedurende 1-2 minuten om een enkele celsuspensie te bereiken en controleer of alle celklonters opnieuw zijn gesuspendeerd.
13. Terwijl het monster langzaam vortext, voegt u snel 1 ml ijskoude methanol toe met behulp van een pipet van 1.000 μL met een filterpunt.
14. Houd de FACs-buis tegen het licht en zorg ervoor dat er geen zichtbare klonten zijn; Bewolking is te verwachten. Eventuele klonten maken het monster onbruikbaar voor latere MCM-analyse.
15. Bewaar het monster bij -20 °C gedurende 10-20 minuten.
16. Bereid het intracellulaire kleuringsmengsel gedurende deze tijd voor. Het intracellulaire kleuringsmengsel zal afhankelijk zijn van interessante doelen. Neem voor celcyclusanalyse CyclinB1, pRb, Ki67 en pHH3 op in dit kleuringsmengsel, maar andere intracellulaire markers kunnen indien nodig worden toegevoegd.
17. Verwijder na 10-20 minuten bij -20 °C het monster, voeg 1,5 ml PBS toe en vul de rest met CSM.
18. Centrifugeer het monster 600 x g gedurende 5 minuten en zuig het supernatant op.
19. Was nog twee keer met CSM, draai het monster gedurende 5 minuten op 600 x g en zuig het supernatant elke keer aan.
20. Na de laatste CSM-wasbeurt centrifugeert u het monster en laat u een restvolume van ongeveer 50 μL achter.
21. Voeg het bereide antilichaammengsel (voeg meestal 50 μL antilichaamkleuringscocktail toe om een uiteindelijk kleuringsvolume van 100 μl te bereiken) toe aan het monster en incubeer op een schudplatform gedurende 30 tot 60 minuten bij kamertemperatuur.
22. Voeg na het kleuren CSM toe en centrifugeer op 600 x g gedurende 5 minuten.
23. Zuig de CSM aan, was opnieuw met CSM, draai gedurende 5 minuten op 600 x g , zuig de CSM aan en voeg vervolgens PBS toe.
24. Na de voltooiing van de intracellulaire kleuring, plaats cellen in een intercalatoroplossing die de antilichamen tegen de cellen fixeert en het DNA van elke cel kleurt om identificatie mogelijk te maken. De intercalatoroplossing bevat niet-isotopisch zuivere iridiumintercalator (pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine) toegevoegd uit de stamoplossing van de fabrikant in een concentratie van 500 μM. Verdun de iridiumvoorraad 1:4000 in een oplossing van PBS en 1,5% PFA. Voeg de iridium intercalatoroplossing toe met 100-200 μL per miljoen cellen om gelijkmatig te kleuren en overkleuring te voorkomen.
    OPMERKING: Het iridium in deze intercalatoroplossing is bedoeld om cellen te identificeren voor singlet gating, het mag niet worden gebruikt voor levende / dode vlekken. Als levende/dode vlekken gewenst zijn, moeten ze worden uitgevoerd vóór fixatie zoals hierboven en in McCarthy et ^al.9 vermeld.
25. Bewaar de monsters in een intercalatoroplossing in een koelkast van 4 °C gedurende maximaal twee weken voordat het monster op de CyTOF wordt verkregen.

4. Werking van de massacytometer

OPMERKING: De werking van massacytometrie kan machinespecifiek zijn. Het is altijd raadzaam om de CyTOF-gebruikershandleiding voor gebruik te controleren. Daarnaast zijn er momenteel twee JoVE-artikelen over het opstarten en onderhouden van machines ^9,11.

1. Controleer de vernevelaar op eventuele verstoppingen, scheuren en andere onregelmatigheden voordat u de massacytometer gebruikt.
2. Sluit de vernevelaar aan op de cytometer en begin met de opwarmprocedure. Start de massacytometer niet zonder de vernevelaar op zijn plaats.
3. Laat water door de monsterlijnen lopen zodra de massacytometer klaar is met opwarmen. De sproeikamer moet ongeveer 200 °C bereiken voordat afstemming of monsteranalyse wordt uitgevoerd.
4. Laat water 5-10 minuten lopen. Laad na 5-10 minuten de tuningoplossing en selecteer de tuning manager. De afstemoplossing is een oplossing die vaste concentraties metalen bevat en wordt gebruikt om de massacytometer te optimaliseren voordat het monster wordt verkregen
5. Selecteer in de tuningmanager Preview zodra de tuningoplossing een steady state hitrecord heeft bereikt om het geautomatiseerde afstemmingsproces te starten.
6. Zodra het afstemmen is voltooid, laadt u de monsternemer met water en laat u water door de monsterlijnen lopen tijdens de monsterverwerking. Gedetailleerd protocol voor de dagelijkse werking en afstemming van de cytometer is te vinden op Leipold¹¹.
7. Af en toe zal de geautomatiseerde afstemming niet afstemmen op optimale machineprestaties. Herhaal de afstemmingsprocedure om dit te corrigeren.
8. Was het monster eenmaal met CSM en tweemaal met zuiver gedeïoniseerd water voordat het monster wordt verkregen. Wassen met water is belangrijk om restzout uit de PBS/CSM te verwijderen.
9. Controleer de gevoeligheid en monsterstroom met behulp van door de fabrikant geleverde equilibratieparels, polystyreenparels geladen met bekende metaalconcentraties.
10. Wijzig de acquisitiemodus van afstemming naar gebeurtenisopnamemodus. Stel de tijdslimiet om de acquisitie te stoppen in op 120 s. Wacht 45 s voordat u Opnemen selecteert.
11. De massacytometer stopt automatisch met monsteracquisitie na 120 seconden. Gebruik de regenplotviewer om de intensiteit van Eu151 en Eu153 te controleren.
12. Verdun evenwichtskralen in zuiver gedeïoniseerd water in een verhouding van 1:20.
13. Controleer voordat u de steekproef verwerft de experimentmanager. Gebruik de experimentmanager om namen toe te wijzen aan kanalen en om kanalen toe te voegen die moeten worden opgenomen.
    1. Zorg ervoor dat het 127-I-kanaal is toegevoegd als u IdU gebruikt.
    2. Merk op dat het essentieel is om de massacytometer in te stellen om de benodigde parameters (bijv. IdU) te meten voorafgaand aan het verzamelen van het monster. Als kanalen niet van tevoren zijn geselecteerd, worden er geen gegevens verzameld van een niet-geselecteerd kanaal en kunnen ze niet worden hersteld.
14. Verdun de cellen tot een concentratie van ongeveer 1-2 x 10⁶/ml met behulp van het 1:20 zuivere gedeïoniseerde water- en evenwichtsparelmengsel. Laat de cellen door de FACS-buis met filter lopen om eventuele resterende klonten te verwijderen.
15. Laad het monster en wijzig de acquisitietijd.
16. Druk op Voorbeeld en wacht tot het aantal gebeurtenissen per seconde is gestabiliseerd.
    1. Voer geen gebeurtenissen uit van meer dan 400 gebeurtenissen per seconde, dit zal leiden tot aanzienlijke hoeveelheden doubletten en puin. We verzamelen meestal minstens 20.000 tot 50.000 celgebeurtenissen, maar het optimale aantal hangt af van het experimentele ontwerp. Kleuring van maximaal 2 miljoen cellen levert doorgaans 300.000 tot 400.000 celgebeurtenissen op. Houd er rekening mee dat niet alle gebeurtenissen cellen zijn (er zijn puin- en kraalgebeurtenissen opgenomen in het aantal gebeurtenissen).
17. Zodra de monsteracquisitie is voltooid, laadt u een wasoplossing, start u de monsterinductie en laat u deze 5-10 minuten lopen. Stop na 5-10 minuten met de inductie van het monster en laat water gedurende 10-20 minuten lopen. Wasoplossing is een zwakke oplossing van fluorwaterstofzuur die is ontworpen om restmetaal uit de monsterleidingen te verwijderen.
18. Schakel de massacytometer uit en verwijder de vernevelaar. De vernevelaar zal heet zijn, wees voorzichtig tijdens het hanteren.

5. Data-analyse

1. Om kralen te verwijderen en ook om te corrigeren voor signaaldrift tijdens monsteracquisitie, normaliseert u de FCS-bestanden met behulp van Fluidigm-software of de applicatie ontwikkeld door Finck¹².
2. Upload de FCS naar Cytobank of andere flowcytometrie-analysesoftware. FCS-bestanden kunnen worden gebruikt in elke compatibele software, voor de doeleinden van dit protocol is alle gating en verdere analyse uitgevoerd in Cytobank¹³.
3. Voordat celcycluspoorten kunnen worden getekend, sluit u doubletten of celresten uit van downstream-analyse, dit kan worden gedaan met behulp van de biaxiale plot van Event Length vs 191-Ir (Figuur 1a). Cellen zullen een duidelijke, heldere populatie Ir^hoog vormen die kan worden gebruikt om doubletten en puin uit te sluiten. Dit is de singlet gate. Deze gating-methode verwijdert meestal ongeveer 50-60% van de doubletcelgebeurtenissen, dus aanvullende strategieën kunnen nodig zijn om resterende doubletcelgebeurtenissen te verwijderen.
   1. Wijzig de lengteschaal van de gebeurtenis (minimum en maximum) om de cellen prominenter te laten lijken om te helpen bij singlet gating.
   2. Verwijder verder doubletten en puin door gebruik te maken van Gaussische parameters, Residueel en Offset. Een hoger residu met lagere offset is ook puin en doubletten, en gating rond deze populatie kan doubletten en puin verder verwijderen (figuur 1b,c).
4. S-fase gating – S-fase is de gemakkelijkste poort om te tekenen, maar ook de belangrijkste. Teken deze poort met behulp van een biaxiale plot van IdU versus pRb, Ki67 of cyclinB1. S-fase IdU⁺ cellen zullen een aparte populatie vormen wanneer naar deze biaxiale plots wordt gekeken (figuur 2b).
5. G0/G1-fase, G2/M-fase gating – Stel de G0/G1- en G2/M-fasepoorten vast op de IdU vs CyclinB1-plot en het gebruik van IdU-incorporatie is cruciaal om de grens tussen de G0/G1- en G2/M-fasepoorten vast te stellen. G0/G1-fase wordt CyclinB1^laag/IdU^- en G2/M-fase is CyclinB1^hoog/IdU^-. Goede CyclinB1-kleuring zal een natuurlijke populatie laten zien tussen de G0-G1- en G2-M-populaties; dit zal echter variëren tussen monster- en celtypen onder experimentele omstandigheden. In experimentele omstandigheden waar de celcyclusverdeling kan worden beïnvloed en er minder scheiding is tussen de CyclinB1, G0 / G1-fase en G2 / M-fase, zal het gebruik van de S-fase consistente gating voor bepaalde celtypen in elk specifiek experiment mogelijk maken. Deze methode wordt hieronder beschreven.
   1. Plot alleen de S-fase cellen op de CyclinB1 vs IdU om de scheiding tussen G0/G1-fase en G2/M-fase te helpen vaststellen. Teken een poort op de CyclinB1^hoge populatie en pas aan totdat ongeveer de bovenste 5% van de S-fase populatie zich binnen de poort bevindt (Figuur 2c). Hiermee wordt het breekpunt tussen de G0/G1- en G2/M-fasepoorten vastgesteld (figuur 2e,f). De actieve populatie zal worden veranderd in de populatie van belang en het deel dat binnen de vorige poort woont, zal de G2 / M-fasepopulatie zijn, terwijl de rest de G0 / G1-fasepopulatie zal zijn.
6. G0-fase gating – Stel de G0-fase vast op de pRb vs IdU plot. De G0-fase wordt weergegeven door een pRb^{lage/IdU-populatie}. De actieve fietsende populatie zal een hoge expressie van pRb en IdU-opname hebben, de G0-fase gate kan op deze grens worden getrokken zoals deze meestal uitdrukt op twee verschillende populaties (figuur 2g,i).
   1. Definieer de G0-fase door de eerder getekende S-fase populatie (figuur 2b) de actieve populatie te maken en een poort te tekenen met de bovenste 90-100% van de pRb^hoge populatie. Dit is de pRb+ fietspopulatie (figuur 2i), de pRb^lage populatie buiten deze poort is de G0-populatie (figuur 2j).
   2. Als pRb niet beschikbaar is of niet kan worden geregistreerd, gebruikt u Ki67 vs IdU om de G0-fasepopulatie vast te stellen. Door een poort te tekenen die de meerderheid van de S-fase populatie vertegenwoordigt en die poort te gebruiken als de grens voor de Ki67 vs IdU zal de rest van de populatie de G0-fase zijn (Figuur 3a).
7. M-fase gating – Stel de M-fase vast in de IdU vs pH3 biaxiale plot. De M-fase vertegenwoordigt een zeer kleine fractie van de cellen en is afgesloten op de pH3^hoge populatie (figuur 2d).
8. IdU-opname is mislukt of was niet mogelijk – Als IdU niet beschikbaar is, definieert u celcycli en geen cyclusfracties met Ki67 en pRb. Ki67 en pRb vormen onder normale omstandigheden twee verschillende populaties, een Ki67 hoog/pRb^hoog en een Ki67 laag/pRb^laag. De dubbel positieve populatie vertegenwoordigt de actieve fietsende populatie, correlerend met G1-fase, S-fase, G2-fase en M-fase. De dubbel lage populatie vertegenwoordigt de niet-fietsende populatie, correlerend met de G0-fase (figuur 3b).
   OPMERKING: Het is niet mogelijk om elke afzonderlijke fase af te bakenen met behulp van de Ki67 vs pRb, maar experimentele effecten op de relatieve cyclische / niet-fietsende populaties kunnen worden bepaald.
9. Celcyclusanalyse - Zodra de poorten zijn vastgesteld, exporteert u de numerieke waarden van de poorten voor verdere analyse. De percentages in elke cyclus kunnen worden bereikt door de afzonderlijke populaties af te trekken van de gecombineerde populaties. De G0-fase, getekend op de pRb lage IdU^lage, gate percentage kan worden afgetrokken van de G0/G1-fase, getekend op CyclinB1^lageIdU^neg, om het G1-fase percentage te vinden. Op dezelfde manier wordt het G2-fasepercentage afgeleid van het aftrekken van de M-fase poort van de G2/M-fase poort. Dit genereert numerieke waarden voor elke afzonderlijke celcyclusfase; G0, G1, S, G2 en M. De numerieke waarden die voor elke afzonderlijke celcyclusfase worden gegenereerd, kunnen worden gebruikt voor verdere analyse, zoals grafieken en statistische analyse.

Representative Results

Met behulp van HL-60-cellen en een menselijk beenmergaspiraat is het mogelijk om te laten zien hoe experimentele omstandigheden de distributie en analyse van de celcyclus kunnen beïnvloeden. Ten eerste moet de gating-strategie worden vastgesteld om aan te tonen hoe de celcyclusfasen worden afgeleid. In figuur 1 tonen we de oprichting van de singletpoort, die belangrijk is bij het scheiden van cellulair puin en doubletten, waardoor een enkele celpopulatie ontstaat. Voor cellijnen is de singletpoort alles wat nodig is om over te gaan tot celcyclusanalyse (figuur 2a). Voor menselijke monsters moeten immunofenotypische populaties meestal worden vastgesteld voorafgaand aan de analyse van de celcyclus, omdat de exacte grenzen van elke celcycluspoort kunnen variëren tussen verschillende celtypen. Zodra de populaties zijn vastgesteld (meestal door gating op oppervlaktemarkeringen die die populatie definiëren), moeten de celcycluspoorten worden vastgesteld. Figuur 2b toont de vaststelling van de S-fase op de IdU vs CyclinB1 biaxiale plot. Dit waarnemingspunt wordt ook gebruikt om de grens van de G2/M-fasepoort vast te stellen (figuur 2f). Zodra de G2/M-fase is vastgesteld, is de rest de G0/G1-fase gate (figuur 2f). De IdU vs pRb wordt gebruikt om eerst de pRb⁺ fietsende populatie vast te stellen door een poort op IdU met cellen in te stellen (Figuur 2g,i). De pRb⁺/IdU^neg populatie buiten deze poort is de G0-fase (Figuur 2j). M-fase wordt vastgesteld op de IdU versus pHH3 waar M-fase cellen hoge niveaus van pHH3 tot expressie brengen en geen IdU-opname vertonen (figuur 2k). In het geval dat pRb niet is opgenomen, kan de G0-fase worden gerepliceerd met Ki67 op een vergelijkbare manier als de hierboven beschreven methode (figuur 3a). Als de IdU-opname mislukte of niet werd uitgevoerd, is het nog steeds mogelijk om relatieve cyclusfracties te bepalen met behulp van Ki67 en pRb. Door gebruik te maken van de Ki67 en pRb biaxiale vormen zich twee verschillende populaties, een pRb+/Ki67⁺ dubbel positief en een pRb^laag/Ki67^lage populatie. De dubbele positieve populatie vertegenwoordigt cellen in cyclus, terwijl de lage cellen vertegenwoordigt die niet in cyclus zijn (figuur 3b). Met behulp van IdU-cellen en pRb-lage cellen zonder IdU-opname laten we zien dat de S-fase voornamelijk in de pRb + / Ki67 ⁺ -populatie is, terwijl de G0-fase voornamelijk in de pRb-lage ^/ Ki67-lage populatie is.

Celcyclusanalyse is gebaseerd op een goede experimentele techniek, vooral tijdens de IdU-incubatiestap. Hoewel IdU-incorporatie flexibel is (toepasbaar in celkweek, beenmergaspiraten en zelfs muizenstudies), is het noodzakelijk om IdU-incorporatie en fixatie uit te voeren zonder de celcyclustoestand van experimenteel belang te verstoren. IdU-etikettering en dus downstream celcyclusanalyse kunnen aanzienlijk worden beïnvloed door tijd en temperatuur, zoals aangegeven in figuur 4. Cellen die te lang in gesloten vaten blijven of die kunnen worden aangetroffen bij monsterverzending of monstertransport tussen locaties, hebben een verminderde S-fasefractie en zijn niet nauwkeurig voor celcyclusanalyse (figuur 4a). Korte tijdsperioden, die in totaal minder dan een uur duren, zullen echter een normale celcyclusverdeling hebben, wat aangeeft dat snel transport mogelijk geen negatieve celcyclusanalyse heeft (figuur 4b). Een andere belangrijke modifier is cryopreservatie die routinematig wordt gebruikt in de meeste laboratoria. Bij het onderzoeken van de celcyclustoestand in gecryopreserveerde cellen kan een lange evenwichtsperiode nodig zijn voordat cellen terugkeren naar actieve celcyclus, die mogelijk nog steeds niet de toestand van de pre-cyroreservatiecelcyclus weerspiegelt (figuur 4c).

Primaire menselijke monsters zijn vaak samenstellingen van meerdere verschillende celtypen, deze verschillende celtypen kunnen verschillende gevoeligheden hebben voor verwerking, wat leidt tot verschillende celcyclusgating. In twee beenmergaspiraten die onmiddellijk IdU-gelabeld waren, gedurende 30 minuten vóór IdU-etikettering werden bewaard of cryogeen werden opgeslagen na Ficoll-scheiding, zijn er verschillen tussen elk monster en elke populatie (figuur 5a,b). Twee immunofenotypische populaties werden onderzocht op verschillen in IdU-incorporatie; T-cellen (CD45 hoog/CD3^hoog) en monoblasten (CD33+, HLADR⁺, CD11b^laag, CD14^neg). Met de juiste combinatie van oppervlaktemarkeringen is het mogelijk om verdere immunofenotypische populaties te onderzoeken. In merg #2 was er een merkbaar T-celactivatie-effect na 30 minuten opslag dat niet werd gezien in de monoblasten van dezelfde patiënt (figuur 5b). Net als gekweekte cellen waren er merkbare veranderingen in IdU-etikettering na cryogene opslag die ook afhankelijk was van de populatie. Merg #1 had een afname van de T-celpopulatie, maar een toename van monoblasten IdU gelabelde fracties in vergelijking met baseline (Figuur 5 a,b), Marrow #2 toonde een afname van zowel T-cellen als monoblasten in vergelijking met baseline (Figuur 5a,b). Bevroren cellen hebben dan een opmerkelijke incubatietijd nodig voordat ze terugkeren naar de normale celcyclustoestand en dit kan van invloed zijn op studies die afhankelijk zijn van het wijzigen van de celcyclustoestand of celcyclustoestand als een metriek van geneesmiddel of experimenteel effect.

Een ander voordeel van MCM is het vermogen om cellen te onderscheiden in celcyclusstilstand of die abnormale celcyclusverdeling hebben. Hoewel DNA-kleurstoffen die vaak worden gebruikt in flowcytometrie in staat zijn om onderscheid te maken tussen 2N- en 4N-DNA-inhoud, zijn ze erg helder, wat het meten van andere parameters van die laser aanzienlijk kan bemoeilijken. IdU neemt echter slechts één massakanaal en heeft minimale spill-over, waardoor andere markers kunnen worden gebruikt bij de bepaling van de celcyclus. MOLM13-cellen die werden bestraald, vertonen een verminderde IdU-opname en afname van de M-fase in vergelijking met controlecellen (figuur 6). Verstoring van de normale celcycluscontrolepunten kan de schijnbare celcyclustoestand door MCM veranderen. Kijkend naar pH2AX- en cPARP-populaties in de niet-bestraalde cellen, toont de pH2AX-lage en cPARP-lage populatie een normale celcyclusverdeling, terwijl cellen die hogere niveaus^{van pH2AX} of cPARP tot expressie brengen, voornamelijk lokaliseren in de G0 / G1-fase die wordt verwacht (figuur 6a). In de bestraalde cellen zijn de pH2AX laag en cPARP^laag, de cellen zijn echter bijna volledig gelokaliseerd in de G0-fase, terwijl de pH2AX^hoge en cPARP^lage cellen een celcyclusstopfenotype vertonen met IdU-incorporatie en lokalisatie naar de G0 / G1-fase en G2-fase met een afwezigheid van M-fase. De pH2AX hoge en cPARP^hoge cellen tonen ook cellen die wat IdU bevatten en lokaliseren naar de G0/G1-fase die wijst op stralingsschade (figuur 6b).

Figuur 1: Het vaststellen van de singletpoorten met behulp van 191-Ir op gebeurtenislengte en ook Gaussische parameters, residueel en offset.
De verschillen in T-cel (CD45+/CD3+) en S-fase (IdU⁺) tussen een ongeateerd monster (a), een gebeurtenislengte vs 191-Ir singlet gate (b), of een singlet gate gecombineerd met Gaussische parameters, residueel en offset (c). Singlet gating verwijdert puin, doubletten en kralen die worden getoond in het verlies van de^pRb-hoge populatie in de rechterhoek van het biaxiale. Deze singletpoort kan verder worden geoptimaliseerd door Gaussische parameters zoals residu en offset op te nemen, waardoor meer puin wordt verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Het gatingschema voor het instellen van celcycluspoorten voor G0-, G1-, S-, G2- en M-fasen met behulp van IdU, CyclinB1, pRb en pHH3.
De singletpoort is ingesteld om doubletten en puin (a) te verwijderen. De S-fase moet worden vastgesteld (b), zodra de S-fase is vastgesteld, kan de IdU⁺-populatie worden gebruikt om de G2/M-fasegrens (c,d) vast te stellen. De vaststelling van de G2/M-fasegrens bepaalt de grenzen van de G0/G1-fasepopulatie (f). De pRb⁺ en G0-fase populatie worden vastgesteld op de IdU vs pRb biaxiaal. De IdU+-cellen (h) worden gebruikt om de grens voor de pRb⁺-populatie (i) vast te stellen. De grens van de pRb⁺-populatie bepaalt de grens van de G0-fasepopulatie (j). De M-fase wordt vastgesteld op pHH3⁺ cellen die IdU^- (k) zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Het opzetten van celcycluspoorten zonder het gebruik van pRb of zonder het gebruik van IdU-incorporatie.
Het tekenen van de G0-fase kan ook worden gedaan met Ki-67 volgens dezelfde gating-strategie die werd gebruikt met pRb, als pRb niet is opgenomen in het experiment (a). Als de IdU-opname mislukte of niet werd uitgevoerd, was het mogelijk om de relatieve celcyclusfracties alsnog te herstellen door het gebruik van Ki67 en pRb. Ki67 en pRb dubbele positieve expressie is correlatief met cellen in cyclus, zoals blijkt uit het aantonen van de IdU ⁺ -cellen worden voornamelijk gevonden in de dubbel positieve populatie (b). De Ki67- en pRb-lage populatie correleert met de G0-fase of niet-fietsende populatie die wordt aangetoond door pRb-lage /^{IdU-neg-cellen} die worden gevonden in de Ki67- en^pRb-lage populatie. Deze methode kan geen onderscheid maken tussen individuele celcyclusfasen, maar kan nog steeds worden gebruikt om relatieve cyclusfracties in experimentele omstandigheden te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatieve cijfers van het effect van verschillende opslagcondities op de celcyclusverdeling van HL-60-cellen.
Cellen werden gedurende een uur geïncubeerd, gevolgd door een uur rust bij de aangegeven temperatuuromstandigheden in afgesloten buizen (a). Er zijn merkbare effecten op de celcyclusverdeling in vergelijking met de controle. HL60-cellen werden gedurende 30 minuten in afgesloten buizen bij kamertemperatuur bewaard, een situatie die zich in een klinische omgeving kan voordoen, vóór idu-opname (b). Verzegelde buizen die gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur werden bewaard, vertoonden geen merkbare verschillen in de celcyclus. Het effect van cryogene opslag werd onderzocht op de celcyclus in HL60-cellen, waarbij een monster werd genomen vóór cryogene opslag en een monster werd genomen na een uur rust na een week in cryogene opslag (c). Een uur na het ontdooien wordt de celcyclusverdeling beïnvloed en keert de celcyclusverdeling pas ongeveer een week na het ontdooien terug naar normaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Verwerking kan een effect hebben op patiëntenmonsters en er worden representatieve beelden getoond tussen twee verschillende patiënten met de (a) T-cellen (CD45 hoog/CD3^hoog) en (b) Monoblasten (CD33+, HLADR⁺, CD11b^laag, CD14^neg).
Tussen merg één en merg twee is het duidelijk dat er in merg 2 een T-cel activatie-effect was tijdens de 30 minuten rust, terwijl merg één geen dergelijk effect had. Merg één vertoonde na 30 minuten een mogelijk activeringseffect in de monoblastenpopulatie, terwijl merg twee dat niet deed. In beide mergen was het echter duidelijk dat cryogene opslag de celcyclusverdeling beïnvloedde, ongeacht het celtype. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: MOLM13-cellen werden ofwel als controle achtergelaten of bestraald met behulp van een röntgenbestraling bij 10Gy.
MOLM13-cellen tonen de celcyclusverdeling in vier verschillende populaties van pH2AX en cPARP-expressie. Controlecellen vertonen minimale pH2AX- en cPARP-kleuring, waarbij normale celcycluskenmerken worden getoond in^{de pH2AX-lage} en cPARP-lage populatie (a). Terwijl de bestraalde cellen een abnormale celcyclusverdeling vertonen, waarbij de meerderheid van de fietsende cellen zich in de pH2AX hoog en cPARP^hoog bevindt, wat wijst op verstoring van de celcyclus (b). De niet-beschadigde, pH2AX^lage en cPARP^lage, cellen vertonen een gebrek aan fietseigenschappen en worden voornamelijk aangetroffen in de G0-fase. Zonder deze markers zouden deze cellen verschijnen als 4N- en 2N-cellen in normale flowcytometrie, mogelijk verstorend downstream celcyclusanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De hier gepresenteerde voorbeelden laten zien hoe u een MCM-platform kunt gebruiken om de distributie van de celcyclus te analyseren. Het is ook aangetoond dat celcyclusanalyse gevoelig is voor experimentele omstandigheden zoals tijd en temperatuur, wat een belangrijke overweging is die onderzoekers moeten nemen bij het overwegen van MCM voor hun celcyclusanalyse¹⁴. Monsters die gedurende een korte periode in opslag worden achtergelaten, niet langer dan een uur, hebben een IdU-opname die vergelijkbaar is met hun normale toestand. Monsters in een gesloten systeem gedurende lange perioden, ongeveer 2 uur, zullen een verminderde IdU-opname hebben, maar de relatieve cyclische en niet-cyclische fracties zullen niet veranderen, waardoor analyse van de grove celcyclus mogelijk is. Cryogene opslag en daaropvolgende ontdooiing verstoren de normale celcyclusverdeling gedurende een aanzienlijke periode. Van cryogene opslag is eerder opgemerkt dat het de eiwit- en RNA-distributie verstoort, maar pas onlangs is aangetoond dat het de celcyclus^14,15,16,17 verstoort. Samen geven deze aan dat als lange opslagtijden worden verwacht of cryogene conservering van monsters, het beter zou zijn om de cellen te kleuren met IdU vóór opslag of cryogene opslag, de cellen te fixeren en op te slaan totdat analyse kan worden uitgevoerd. Aangezien celcyclusanalyse door MCM geen levende cellen vereist, zou dit onderzoekers in staat stellen kostbare monsters op te slaan en nauwkeurige downstream-celcyclusanalyses uit te voeren.

Celcyclusanalyse door MCM is een robuust systeem dat in staat is tot diepgaande ondervraging van experimentele modellen. Vanwege het hoge aantal parameters van MCM, ongeveer 40-50 massakanalen, kan celcyclusanalyse worden samengesteld met andere intracellulaire of extracellulaire markers die de noodzaak omzeilen om cellen te sorteren op basis van immunofenotype, waardoor significante celcycluseffecten verloren kunnen gaan. Het hoge parameterkarakter van MCM leent zich voor het onderzoeken van effecten in hoogdimensionale mappingtoepassingen zoals SPADE en viSNE. Hoewel SPADE en viSNE meestal worden gebruikt om immunofenotypische populaties te definiëren die vervolgens kunnen worden onderzocht op veranderingen in de celcyclus, zou het ook mogelijk zijn om celcyclusmarkers in kaart te brengen. Afhankelijk van de experimentele omstandigheden kan het in kaart brengen van celcyclusmarkers in een hoogdimensionale ruimte de celcycluscorrelatie met het geneesmiddeleffect aantonen of welke immunofenotypische populaties zich kunnen lokaliseren voor elke cyclustoestand ^3,5. Hoewel MCM kan worden beperkt door het ontbreken van DNA-bindende fluorescerende kleurstoffen, wordt dit gecompenseerd door directe IdU-opname tijdens S-fase cellen en intracellulaire celcycluseiwitten kunnen worden gebruikt om de celcyclustoestand te bepalen. Deze celcycluseiwitten kunnen ook helpen onderscheid te maken tussen stadia van celcyclusstilstand die anders als 3N of 4N zouden verschijnen in traditionele stroom met behulp van DNA-bindende kleurstoffen. Dergelijke zeer parametrische systemen zijn echter niet zonder nadelen en het is gevoelig voor verstoringen in de celcyclus. We hebben aangetoond dat lange opslagtijden en cryogene opslag de celcyclusverdeling aanzienlijk kunnen beïnvloeden. Dit is vooral belangrijk bij het rationaliseren van experimentele effecten voor geneesmiddelen die de celcyclusdistributie kunnen beïnvloeden. Behandeling van geneesmiddelen die zijn ontworpen om de celcyclus op bevroren primaire monsters te beïnvloeden, kan onjuiste gegevens over het effect van de celcyclus opleveren wanneer ze onmiddellijk na het ontdooien uit cryogene opslag worden gebruikt. MCM is een veelzijdige technologie voor celcyclusanalyse die kan worden toegepast op een aantal experimentele modellen en is vooral geschikt voor diepe profilering van heterogene systemen. Net als bij andere zeer parametrische methoden is het noodzakelijk om een zorgvuldig ontworpen experiment te hebben met passende overwegingen voor hoe verwerking en experimentele effecten de analyse van de celcyclus zullen beïnvloeden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3059	Component of CSM
Centrifuge	Thermo Scientific	75-217-420	Sample centrifugation
Cleaved-PARP (D214)	BD Biosciences	F21-852	Identification of apoptotic cells
Cyclin B1	BD Biosciences	GNS-1	G2 Resolution
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650	Cryopreservative
EQ Four Element Calibration Beads	Fluidigm	201078	Internal metal standard for CyTOF performance
FACS Tube w/ mesh strainer	Corning	08-771-23	Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	97068-085	Cell culture growth supplement
Helios	Fluidigm		CyTOF System/Platform
Heparin	Sigma	H3393	Staining additive to prevent non-specific staining
IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine)	Sigma	I7125	Incorporates in S-phase
Ki-67	eBiosciences	SolA15	Confirmation of G0/G1
MaxPar Multi Label Kit	Fluidigm	201300	Metal labeling kit, attaches metals to antibodies
Microplate Shaker	Thermo Scientific	88880023	Mixing samples during staining
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Services	15710	Fixative
pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine	Fluidigm	201192	Cell identification during CyTOF acquisition
p-H2AX (S139)	Millipore	JBW301	Detection of DNA damage
p-HH3 (S28)	Biolegend	HTA28	M-phase Resolution
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Wash solution for cell culture and component of fixative solution
p-Rb (S807/811)	BD Biosciences	J112906	G0/G1 Resolution
Proteomic Stabilizer	SmartTube Inc	PROT1	Sample fixative
RPMI 1640	Gibco	21870-076	Cell culture growth medium
Sodium Azide	Acros Organics	AC447810250	Component of CSM/Antibody buffer, biocide