Användning av pyrimidinanalogen, 5-jod-2′-deoxiuridin (IdU) med cellcykelmarkörer för att upprätta cellcykelfaser i en masscytometriplattform

Summary

Detta protokoll anpassar cellcykelmätningar för användning i en masscytometriplattform. Med multiparameterfunktionerna för masscytometri möjliggör direkt mätning av jodinkorporering identifiering av celler i S-fas medan intracellulära cykelmarkörer möjliggör karakterisering av varje cellcykeltillstånd under en rad experimentella förhållanden.

Abstract

Regleringen av cellcykelfasen är en viktig aspekt av cellulär proliferation och homeostas. Störning av de regleringsmekanismer som styr cellcykeln är en egenskap hos ett antal sjukdomar, inklusive cancer. Studier av cellcykeln kräver förmågan att definiera antalet celler i varje del av cellcykelprogressionen samt att tydligt avgränsa mellan varje cellcykelfas. Tillkomsten av masscytometri (MCM) ger enorm potential för encellsanalys med hög genomströmning genom direkta mätningar av elementära isotoper, och utvecklingen av en metod för att mäta cellcykeltillståndet med MCM utökar ytterligare användbarheten av MCM. Här beskriver vi en metod som direkt mäter 5-jod-2′-deoxiuridin (IdU), liknande 5-brom-2'-deoxiuridin (BrdU), i ett MCM-system. Användning av denna IdU-baserade MCM ger flera fördelar. Först införlivas IdU snabbt i DNA under syntesen, vilket möjliggör tillförlitlig mätning av celler i S-fasen med inkubationer så korta som 10-15 minuter. För det andra mäts IdU utan behov av sekundära antikroppar eller behov av DNA-nedbrytning. För det tredje kan IdU-färgning enkelt kombineras med mätning av cyklin B1, fosforylerat retinoblastomprotein (pRb) och fosforylerad histon H3 (pHH3), vilket tillsammans ger tydlig avgränsning av de fem cellcykelfaserna. Kombination av dessa cellcykelmarkörer med det stora antalet parametrar som är möjliga med MCM möjliggör kombination med många andra mätvärden.

Introduction

Masscytometri möjliggör detektion av cirka 40 parametrar genom att dra nytta av masspektroskopins höga upplösning och kvantitativa natur. Metallmärkta antikroppar används istället för fluoroforkonjugerade antikroppar som möjliggör ett högre antal kanaler och ger minimal spillover ^1,2. MCM har fördelar och nackdelar när det gäller cellcykelanalys jämfört med flödescytometri. En stor fördel med MCM är att det stora antalet parametrar möjliggör samtidig mätning av cellcykeltillstånd över ett stort antal immunofenotypiskt distinkta T-celltyper i mycket heterogena prover. MCM har framgångsrikt använts för att mäta cellcykelns tillstånd under normal hematopoes i human benmärg³ och transgena murina modeller av telomerasbrist⁴. Analys av cellcykeltillstånd vid akut myeloisk leukemi (AML) visade att cellcykeln korrelerade med kända svar på kliniska terapier, vilket gav en in vivo-insikt i funktionella egenskaper som kan informera terapival⁵. En andra fördel med masscytometrisk cellcykelanalys är möjligheten att mäta ett stort antal andra funktionella markörer som kan korreleras med cellcykeltillstånd. Nyligen arbete har kunnat korrelera protein- och RNA-syntes med cellcykeltillstånd genom användning av IdU och metallmärkta antikroppar mot BRU och rRNA⁶. Denna typ av mycket parametrisk analys som mäter cellcykeltillstånd över många populationer i ett kontinuum av differentiering skulle vara nästan omöjligt med nuvarande flödescytometriteknik. Den största nackdelen med MCM är bristen på jämförbara DNA- eller RNA-fläckar som de som används i fluorescerande flödescytometri (t.ex. DAPI, Hoechst, Pyronin Y, etc.). Fluorescerande färgämnen kan ge relativt exakta mätningar av DNA- och RNA-innehåll, men denna precision är endast möjlig på grund av förändringarna i de fluorescerande egenskaperna hos dessa färgämnen som uppstår vid interkalering mellan nukleotidbaser. MCM-analys kan därför inte mäta DNA- eller RNA-innehåll med liknande precision. Istället bygger masscytometrisk cellcykelanalys på mätningar av proteiner relaterade till cellcykeltillstånd såsom cyklin B1, fosforylerat retinoblastomprotein (pRb) och fosforylerad histon H3 (pHH3) kombinerat med direkt mätning av jodatomen från IdU-inkorporering i S-fasceller. Dessa två mätmetoder ger mycket liknande resultat under normal cellulär proliferation, men kan potentiellt vara diskordanta när cellcykelprogressionen störs.

Mätning av antalet celler i varje cellcykelfas är viktigt för att förstå normal cellcykelutveckling samt cellcykelstörningar, vilket vanligtvis observeras vid cancer och immunologiska sjukdomar. MCM ger tillförlitlig mätning av extracellulära och intracellulära faktorer med användning av metallmärkta antikroppar; mätningen av S-fasen var dock begränsad eftersom den iridiumbaserade DNA-interkalatorn inte kunde skilja mellan 2N och 4N DNA. För att definiera cellcykelfaser utvecklade Behbehani en metod som använder IdU med en massa på 127, vilket faller inom masscytometerns intervall och möjliggör direkt mätning av celler i S-fas³. Denna direkta mätning kringgår behovet av sekundära antikroppar eller användning av DNA-denatureringsmedel såsom syra eller DNas. I kombination med intracellulära cykelmarkörer möjliggör det hög upplösning av cellcykelfördelning i experimentella modeller.

Detta protokoll anpassar cellcykelmätningar från vanliga flödescytometriprotokoll för MCM. Våra metoder ger ett bekvämt och enkelt sätt att inkludera cellcykelparametrar. IdU-inblandning av in vitro-prover kräver endast 10 till 15 minuters inkubation vid 37 °C, vilket är kortare än de flesta BrdU-färgningsprotokoll som rekommenderar inkubationstider på flera timmar ^3,7. IdU- och BrdU-införlivade prover kan fixeras med hjälp av en proteomisk stabilisator och sedan lagras under en tid i en frys på -80 °C. Detta gör att ett stort antal IdU-färgade prover kan arkiveras för batchanalys utan att provkvaliteten försämras.

Protocol

1. Beredning av lager av IdU

1. Lös 5-jod-2'-deoxiuridin (IdU) i DMSO till en koncentration av 50 mM. Sterilfiltrera, alikvot i 10–50 μl rör och förvara vid -80 °C
2. Ta ut IdU ur frysen och tina i rumstemperatur. Späd IdU i RPMI-1640 för att göra en arbetslösning vid en slutlig koncentration av 1 mM. Pipettera upp och ner eller virvel att blanda.
   1. Späd vanligtvis ut den koncentrerade IdU i det medium där cellerna odlas (t.ex. DMEM, IMDM, etc.) eller låt det spädas till PBS för tillsats direkt till perifert blod eller benmärgsprover. Detta steg före utspädning underlättar blandning av DMSO med vattenmediet i cellerna av intresse.
      Anmärkning: Den slutliga koncentrationen av IdU under inkubation bör vara 10 μM. en lösning av 1 mM will kan tillsättas i ett förhållande av 10 μL till varje 1 ml media.

2. Inkubation och konservering av idU

1. Förvara proverna i en fuktad 37 °C inkubator. Ta ut provet ur inkubatorn och flytta provet till en biosäkerhetshuv.
2. Tillsätt 10 μl 1 mM IdU till varje 1 ml prov.
   1. För en platta med 6 brunnar, tillsätt 30 μl 1 mM IdU till de 3 ml odlingsmedier som finns i varje brunn. IdU kan också användas direkt i benmärgsaspirat samt murina studier⁴.
3. Lägg tillbaka provet i inkubatorn vid 37 °C i 10-15 minuter. Underhåll cellerna under optimala tillväxtförhållanden av intresse under IdU-exponering för att få den mest exakta mätningen av S-fas.
4. Efter IdU-inkubationen, ta bort provet och överför till ett koniskt rör.
5. Snurra provet vid 400 x g i 10 minuter vid rumstemperatur.
6. Aspirera supernatanten och suspendera igen i 200 μl PBS.
   1. Om det behövs, utför en levande / död fläck (med cisplatin) i detta steg för att markera döda celler före fixering och frysning.
      OBS: Rhodium levande / död färgning fungerar inte bra efter metanolpermeabilisering, så det rekommenderas inte för användning i cellcykelanalyser.
7. Tillsätt 18,75 μL 16% paraformaldehyd (PFA) till PBS för en slutlig koncentration av 1,5% PFA. Inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter. Snurra provet nedåt vid 400 x g i 10 minuter vid rumstemperatur.
8. Aspirera PBS/PFA-lösningen och suspendera provet igen i 500 μL cellfärgningsmedium (CSM; 1x PBS med 0,5% BSA och 0,02% natriumazid) + 10% DMSO före frysning.
   1. Om kommersiell proteomisk stabilisator används, tillsätt 280 μL proteomisk stabilisator till provet återsuspenderat i 200 μL PBS (1:1.4). Inkubera proverna vid rumstemperatur i 10 minuter och placera dem sedan direkt i -80 °C.
      OBS: IdU har visat sig inkorporera effektivt inom 10-15 min inkubation vid 37 °C. IdU-inkubationer längre än 10-15 minuter kommer gradvis att minska upplösningen av S- och G2-faspopulationerna, eftersom IdU-märkta celler lämnar S-fasen och går vidare till G2- eller M-fas. Vi har också observerat att långvarig inkubation med IdU kan orsaka celldöd och cellcykelartefakter. Den efterföljande cellbearbetningen och antikroppsfärgningen efter IdU-inkorporering är tillräcklig för att tvätta bort kvarvarande IdU som inte införlivades i S-fasceller. Vi har inte observerat betydande jod bakgrund när du använder in vitro- protokollet som beskrivs här; Vi har dock mycket sällan observerat jodkontaminering i kliniska prover. Detta kan inträffa från medicinska förfaranden, såsom jodkontrast i en CT-skanning, eller från jodhaltiga läkemedel. Om stora mängder IdU-bakgrund observeras bör provet inte köras för att undvika skador på masscytometerns detektor.

3. Färgningsprover för masscytometri

1. Ta bort proverna från -80 °C och låt tina före ytfärgning.
   1. Om du använder SmartTube-fixeringsmetoden, tina proverna vid 0-4 °C för att undvika ytterligare fixering när proverna värms upp.
2. Efter att proverna har tinats, överför cirka 1-2 miljoner celler till ett 5 ml FACS-rör.
3. Centrifugera FACS-röret vid 600 x g i 5 minuter och fyll FACS-röret med cellfärgningsmedia (CSM) för att tvätta cellerna. Upprepa en gång till.
   1. Om celler är kända för att hålla ihop, tillsätt 400 U / ml heparin till CSM-tvättar för att förhindra cell till cellkontakt, men detta är inte absolut nödvändigt.
4. Inkubera cellerna med FC-blockerande medel, 5 μl av medlet per 100 μl celler, i 10 minuter vid rumstemperatur.
5. Förbered en blandning av antikroppar som kommer att fläcka ytan eller extracellulär del av cellerna. Den totala färgningsblandningen kommer att uppgå till 100 μL per 1-2 miljoner celler i varje test. Färgningsblandningen balanseras i enlighet därmed med CSM och heparin i cocktail- och FACS-röret.
   OBS: Tillägg av CSM i det här steget minskar också ospecifika färgningsartefakter⁸. Denna färgningsblandning är helt beroende av mål av intresse och ytfenotyp (t.ex. en studie med T-celler kommer att använda en ytblandning av CD45, CD3, CD4, CD8, etc.). Ett detaljerat protokoll för provbearbetning och färgning finns i Behbehani och McCarthy et al.9,10.
6. Tillsätt ytfärgningsblandningen till cellerna och inkubera vid rumstemperatur med kontinuerlig skakning i 30-60 minuter.
7. Efter färgning, fyll FACS-röret med CSM och snurra ner vid 600 x g i 5 minuter.
8. Tvätta ytterligare två gånger med CSM, snurra provet vid 600 x g i 5 minuter och aspirera varje CSM-tvätt.
9. Fixera de extracellulära antikropparna genom att tillsätta 1 ml PBS med 10% CSM och 1,5% PFA.
10. Fyll FACS-röret som innehåller PBS/CSM/PFA-blandningen med CSM. Snurra ner vid 600 x g i 5 minuter och aspirera supernatanten.
11. Tillsätt metanol vid -20 °C.
12. Virvla provet i 1-2 minuter för att uppnå en enda cellsuspension och verifiera att alla cellklumpar har återsuspenderats.
13. Medan provet virvlar långsamt, tillsätt snabbt 1 ml iskall metanol med en 1000 μL pipett med en filterspets.
14. Håll FAC-röret upp mot ljuset och se till att det inte finns några synliga klumpar; Molnighet kan förväntas. Eventuella klumpar gör provet oanvändbart för efterföljande MCM-analys.
15. Förvara provet vid -20 °C i 10-20 minuter.
16. Förbered den intracellulära färgningsblandningen under denna tid. Den intracellulära färgningsblandningen kommer att vara beroende av mål av intresse. För cellcykelanalys, inkludera CyclinB1, pRb, Ki67 och pHH3 i denna färgningsblandning, men andra intracellulära markörer kan tillsättas efter behov.
17. Efter 10-20 min vid -20 °C, ta bort provet, tillsätt 1,5 ml PBS och fyll resten med CSM.
18. Centrifugera provet 600 x g i 5 minuter och aspirera supernatanten.
19. Tvätta ytterligare två gånger med CSM, snurra provet ner vid 600 x g i 5 minuter och aspirera supernatanten varje gång.
20. Efter den sista CSM-tvätten, centrifugera provet och lämna en restvolym på ca 50 μl.
21. Tillsätt den beredda antikroppsblandningen (tillsätt vanligtvis 50 μL antikroppsfärgningscocktail för att uppnå en slutlig färgningsvolym på 100 μl) till provet och inkubera på en skakplattform i 30 till 60 minuter vid rumstemperatur.
22. Efter färgning tillsätt CSM och centrifugera vid 600 x g i 5 min.
23. Aspirera CSM, tvätta igen med CSM, snurra vid 600 x g i 5 minuter, aspirera CSM och tillsätt sedan PBS.
24. Efter avslutad intracellulär färgning, placera celler i en interkalatorlösning som fixerar antikropparna mot cellerna och fläckar DNA i varje cell för att möjliggöra identifiering. Interkalatorlösningen innehåller icke-isotopiskt ren iridiuminterkalator (pentametylcyklopentadienyl-Ir(III)-dipyridofenazin) tillsatt från tillverkarens stamlösning i en koncentration av 500 μM. Späd Iridiumstammen 1:4000 i en lösning av PBS och 1,5 % PFA. Tillsätt iridiuminterkalatorlösningen vid 100-200 μL per miljon celler för att färga jämnt och förhindra överfärgning.
    OBS: Iridium i denna interkalatorlösning är avsedd att identifiera celler för singlettgrind, det ska inte användas för levande / döda fläckar. Om levande / döda fläckar önskas måste de utföras före fixering som nämnts ovan och i McCarthy et ^al.9.
25. Förvara proverna i interkalatorlösning i ett kylskåp på 4 °C i upp till två veckor innan provtagningen sker på CyTOF.

4. Masscytometeroperation

OBS: Masscytometrioperation kan vara maskinspecifik. Det är alltid lämpligt att kontrollera CyTOF bruksanvisning före användning. Dessutom finns det för närvarande två JoVE-artiklar som handlar om maskinstart och underhåll ^9,11.

1. Kontrollera nebulisatorn för eventuella träskor, sprickor och andra oegentligheter innan du använder masscytometern.
2. Anslut nebulisatorn till cytometern och börja uppvärmningsproceduren. Starta inte masscytometern utan nebulisatorn på plats.
3. Kör vatten genom provlinjerna när masscytometern har värmts upp. Spraykammaren måste nå cirka 200 °C innan trimning eller provanalys utförs.
4. Kör vatten i 5-10 min. Efter 5-10 minuter laddar du justeringslösningen och väljer justeringshanteraren. Inställningslösningen är en lösning som innehåller fasta koncentrationer av metaller och används för att optimera masscytometern före provförvärv
5. I justeringshanteraren väljer du Förhandsgranska när justeringslösningen har nått en post för stabilt tillstånd för att starta den automatiska justeringsprocessen.
6. När avstämningen är klar, fyll provtagaren med vatten och låt vatten rinna genom provlinjerna under provbearbetningen. Detaljerat protokoll för daglig cytometeroperation och inställning finns på Leipold¹¹.
7. Ibland kommer den automatiska inställningen inte att anpassas till optimal maskinprestanda. Upprepa inställningsproceduren för att korrigera detta.
8. Tvätta provet med CSM en gång och med rent avjoniserat vatten två gånger före provförvärvet. Tvättning med vatten är viktigt för att avlägsna kvarvarande salt från PBS / CSM.
9. Kontrollera känsligheten och provflödet med hjälp av tillverkarens levererade jämviktspärlor, polystyrenpärlor laddade med kända metallkoncentrationer.
10. Ändra förvärvsläget från justering till händelseinspelningsläge. Ställ in tidsgränsen för att stoppa förvärvet på 120 s. Vänta 45 sekunder innan du väljer Spela in.
11. Masscytometern stoppar provförvärvet automatiskt efter 120 sekunder. Använd regnplottvisaren för att kontrollera Eu151 och Eu153 intensitet.
12. Späd jämviktspärlor i rent avjoniserat vatten i förhållandet 1:20.
13. Kontrollera experimenthanteraren före provförvärvet. Använd experimenthanteraren för att tilldela namn till kanaler och lägga till kanaler som ska spelas in.
    1. Kontrollera att 127-I-kanalen har lagts till om du använder IdU.
    2. Observera att det är viktigt att ställa in masscytometern för att mäta de nödvändiga parametrarna (t.ex. IdU) före provförvärv. Om kanaler inte väljs i förväg samlas data inte in från någon ovald kanal och kan inte återställas.
14. Späd cellerna till en koncentration av ca 1-2 x 10⁶/ml med hjälp av 1:20 rent avjoniserat vatten och jämviktspärlblandning. För cellerna genom det filtertoppade FACS-röret för att avlägsna eventuella kvarvarande klumpar.
15. Läs in exemplet och ändra förvärvstiden.
16. Tryck på Förhandsgranska och vänta tills antalet händelser per sekund har stabiliserats.
    1. Kör inte händelser som överstiger 400 händelser per sekund, detta kommer att leda till betydande mängder dubbletter och skräp. Vi samlar vanligtvis in minst 20 000 till 50 000 cellhändelser, men det optimala antalet beror på den experimentella designen. Färgning av upp till 2 miljoner celler ger vanligtvis 300 000 till 400 000 cellhändelser. Observera att inte alla händelser kommer att vara celler (det kommer att finnas skräp och pärlhändelser som ingår i händelseräkningen).
17. När provförvärvet är klart, ladda en tvättlösning, starta provinduktionen och kör i 5-10 minuter. Efter 5-10 minuter, stoppa provinduktionen och kör vatten i 10-20 minuter. Tvättlösning är en svag lösning av fluorvätesyra utformad för att avlägsna kvarvarande metall från provlinjerna.
18. Stäng av masscytometern och ta bort nebulisatorn. Nebulisatorn blir varm, var försiktig under hanteringen.

5. Analys av data

1. För att ta bort pärlor och även för att korrigera för signaldrift under provförvärv, normalisera FCS-filerna med hjälp av Fluidigm-programvaran eller applikationen som utvecklats av Finck¹².
2. Ladda upp FCS till Cytobank eller annan programvara för flödescytometrianalys. FCS-filer kan användas i all kompatibel programvara, för detta protokoll har all grind och vidare analys gjorts i Cytobank¹³.
3. Innan cellcykelgrindar kan dras, utesluta dubbletter eller cellskräp från nedströmsanalys, kan detta göras genom att använda det biaxiella diagrammet för händelselängd vs 191-Ir (figur 1a). Celler kommer att bilda en distinkt, ljus population Ir^hög som kan användas för att utesluta dubbletter och skräp. Detta är singletporten. Denna grindningsmetod tar vanligtvis bort cirka 50-60% av dubblettcellhändelserna, så ytterligare strategier kan krävas för att ta bort återstående dubblettcellhändelser.
   1. Ändra händelselängdskalan (minimum och maximum) så att cellerna ser mer framträdande ut för att underlätta singlettgrinden.
   2. Ta bort dubbletter och skräp ytterligare med hjälp av gaussiska parametrar, Residual och Offset. En högre rest med lägre förskjutning är också skräp och dubbletter, och grindar runt denna population kan ytterligare ta bort dubbletter och skräp (figur 1b, c).
4. S-fas grind - S-fas är den enklaste grinden att rita men också den viktigaste. Rita denna grind med hjälp av en biaxiell plot av IdU vs pRb, Ki67 eller cyclinB1. S-fas IdU ⁺ -celler kommer att bilda en distinkt population när man tittar på dessa biaxiella tomter (figur 2b).
5. G0 / G1-fas, G2 / M-fasgrind - Upprätta G0 / G1 och G2 / M fasgrindar på IdU vs CyclinB1-tomten och användningen av IdU-inkorporering är avgörande för att fastställa gränsen mellan G0 / G1 och G2 / M-fasgrindarna. G0/G1-fas kommer att vara CyclinB1^låg/IdU- och G2/M-fas kommer att vara CyclinB1^hög/IdU^-. Bra CyclinB1-färgning visar en naturlig population mellan G0-G1- och G2-M-populationerna; Detta kommer dock att variera mellan prov- och celltyper under experimentella förhållanden. Under experimentella förhållanden där cellcykelfördelningen kan påverkas och det finns mindre separation mellan CyclinB1 G0 / G1-fas och G2 / M-fas med användning av S-fasen möjliggör konsekvent grindning för specifika celltyper i varje specifikt experiment. Denna metod beskrivs nedan.
   1. Plotta endast S-fascellerna på CyclinB1 vs IdU för att hjälpa till att fastställa separationen mellan G0 / G1-fas och G2 / M-fas. Rita en grind på CyclinB1^{högpopulationen} och justera tills ungefär de översta 5% av S-faspopulationen är innanför porten (figur 2c). Detta fastställer brytpunkten mellan fasgrindarna G0/G1 och G2/M (figur 2e,f). Den aktiva populationen kommer att ändras till den population som är av intresse och den del som bor innanför den tidigare porten kommer att vara G2/M-faspopulationen medan resten kommer att vara G0/G1-faspopulationen.
6. G0-fas grind - Upprätta G0-fasen på pRb vs IdU-diagrammet. G0-fasen kommer att representeras av en pRb^låg/^{IdU-population} . Den aktiva cykelpopulationen kommer att ha högt uttryck av pRb och IdU-inkorporering, G0-fasporten kan dras på denna gräns eftersom den vanligtvis uttrycker vid två distinkta populationer (figur 2g, i).
   1. Definiera G0-fasen genom att göra S-faspopulationen som ritats tidigare (figur 2b) till den aktiva populationen och rita en grind som innehåller de översta 90-100% av den^höga pRb-populationen. Detta är pRb + cykelpopulationen (figur 2i), den^{pRb låga} befolkningen utanför denna grind är G0-populationen (figur 2j).
   2. Om pRb inte är tillgängligt eller inte kan registreras, använd Ki67 vs IdU för att fastställa G0-faspopulationen. Genom att rita en grind som representerar majoriteten av S-faspopulationen och använda den grinden som gräns för Ki67 vs IdU kommer resten av befolkningen att vara G0-fasen (figur 3a).
7. M-fas grind - Upprätta M-fasen i IdU vs pH3 biaxial plot. M-fasen representerar en mycket liten del av cellerna och är gated på pH3^hög population (figur 2d).
8. IdU-inkorporering misslyckades eller var inte möjlig - Om IdU inte är tillgänglig, definiera cellcykling och inte cykelfraktioner med Ki67 och pRb. Ki67 och pRb bildar under normala förhållanden två distinkta populationer: en Ki67 hög/pRb^hög och en Ki67 låg/pRb^låg. Den dubbla positiva populationen representerar den aktiva cykelpopulationen, korrelerar med G1-fas, S-fas, G2-fas och M-fas. Den dubbelt låga populationen representerar den icke-cyklande populationen, korrelerar med G0-fasen (figur 3b).
   OBS: Det är inte möjligt att avgränsa varje enskild fas med hjälp av Ki67 vs pRb men experimentella effekter på de relativa cykel- / inte cykelpopulationerna kan bestämmas.
9. Cellcykelanalys - När grindarna har etablerats, exportera de numeriska värdena från grindarna för vidare analys. Procentsatserna i varje cykel kan uppnås genom att subtrahera de enskilda populationerna från de kombinerade populationerna. G0-fasen, ritad på pRb låg IdU låg, grindprocent kan subtraheras från G0 / G1-fasen, ritad på CyclinB1^lågIdU^neg, för att hitta G1-fasprocenten. På liknande sätt härleds G2-fasprocenten från subtraktionen av M-fasgrinden från G2/M-fasgrinden. Detta kommer att generera numeriska värden för varje enskild cellcykelfas; G0, G1, S, G2 och M. De numeriska värden som genereras för varje enskild cellcykelfas kan användas för vidare analys såsom grafer och statistisk analys.

Representative Results

Med hjälp av HL-60-celler och ett humant benmärgsaspirat är det möjligt att visa hur experimentella förhållanden kan påverka cellcykelfördelning och analys. Först måste grindstrategin upprättas för att visa hur cellcykelfaserna härleds. I figur 1 visar vi etableringen av singletgrinden, vilket är viktigt för att separera cellulärt skräp och dubbletter, vilket skapar en enda cellpopulation. För cellinjer är singlettgrinden allt som behövs för att gå vidare till cellcykelanalys (figur 2a). För humana prover måste immunofenotypiska populationer vanligtvis fastställas före cellcykelanalys, eftersom de exakta gränserna för varje cellcykelgrind kan variera mellan olika celltyper. När populationerna har etablerats (vanligtvis genom grindning på ytmarkörer som definierar den populationen) måste cellcykelgrindarna etableras. Figur 2b visar etableringen av S-fasen på det biaxiella diagrammet IdU vs CyclinB1. Detta diagram används också för att fastställa gränsen för G2/M-fasgrinden (figur 2f). När G2/M-fasen har etablerats är återstoden G0/G1-fasgrinden (figur 2f). IdU vs pRb används för att fastställa pRb ⁺ cykelpopulationen först genom att etablera en grind på IdU som innehåller celler (figur 2g, i). pRb⁺/IdU-negpopulationen utanför denna grind är G0-fasen (figur 2j). M-fas är etablerad på IdU vs pHH3 där M-fasceller uttrycker höga nivåer av pHH3 och uppvisar ingen IdU-inkorporering (figur 2k). Om pRb inte ingår kan G0-fasen replikeras med Ki67 på ett liknande sätt som den metod som beskrivs ovan (figur 3a). Om IdU-inkorporering misslyckades eller inte utfördes är det fortfarande möjligt att bestämma relativa cykelfraktioner med Ki67 och pRb. Genom att använda Ki67 och pRb biaxial bildas två distinkta populationer, en pRb + / Ki67 ⁺ dubbel positiv och en pRb låg / Ki67^låg population. Den dubbla positiva populationen representerar celler i cykel, medan den låga representerar celler som inte är i cykel (figur 3b). Genom att använda IdU som innehåller celler och pRb^låga celler utan IdU-inkorporering visar vi att S-fasen främst är i pRb + / Ki67 ⁺ -populationen medan G0-fasen främst är i pRb låg / Ki67^låg population.

Cellcykelanalys bygger på god experimentell teknik, särskilt under IdU-inkubationssteget. Medan IdU-inkorporering är flexibel (är tillämplig i cellodling, benmärgsaspirater och till och med murina studier), är det nödvändigt att utföra IdU-inkorporering och fixering utan att störa cellcykeltillståndet av experimentellt intresse. IdU-märkning och därmed nedströms cellcykelanalys kan påverkas avsevärt av tid och temperatur, vilket indikeras av figur 4. Celler som förblir för länge i slutna kärl eller som kan påträffas vid provtransport eller provtransport mellan platser, kommer att ha reducerad S-fasfraktion och inte vara korrekt för cellcykelanalys (figur 4a). Korta tidsperioder, de som är under en timme totalt, kommer dock att ha normal cellcykelfördelning vilket indikerar att snabb transport kanske inte negativt cellcykelanalys (figur 4b). En annan viktig modifierare är kryokonservering som rutinmässigt används i de flesta laboratorier. Vid undersökning av cellcykeltillstånd i kryokonserverade celler kan en lång jämviktsperiod krävas innan cellerna återgår till aktiv cellcykling, vilket kanske fortfarande inte återspeglar cellcykeltillståndet före cyrokonservering (figur 4c).

Primära mänskliga prover är ofta kompositer av flera olika celltyper, dessa olika celltyper kan ha olika känslighet för bearbetning som leder till olika cellcykelgrindar. I två benmärgsaspirat som var IdU-märkta omedelbart, lagrade i 30 minuter före IdU-märkning eller kryogeniskt lagrade efter Ficoll-separation finns skillnader mellan varje prov och population (figur 5a, b). Två immunofenotypiska populationer undersöktes för skillnader i IdU-inkorporering; T-celler (CD45 hög/CD3^hög) och monoblaster (CD33+, HLADR⁺, CD11b^låg, CD14^neg). Med rätt kombination av ytmärken är det möjligt att undersöka ytterligare immunofenotypiska populationer. I märg #2 fanns en märkbar T-cellsaktiveringseffekt efter 30 minuters lagring som inte sågs i monoblasterna från samma patient (figur 5b). Liksom odlade celler fanns det märkbara förändringar i IdU-märkning efter kryogen lagring som också var beroende av population. Marrow #1 hade minskning av T-cellspopulationen men ökning av monoblaster IdU-märkta fraktioner jämfört med baslinjen (figur 5 a,b), märg #2 visade minskning av både T-celler och monoblaster jämfört med baslinjen (figur 5a,b). Frysta celler kräver sedan en anmärkningsvärd inkubationsperiod innan de återgår till normalt cellcykeltillstånd och detta kan påverka studier som förlitar sig på att modifiera cellcykeltillstånd eller cellcykeltillstånd som ett mått på läkemedel eller experimentell effekt.

En annan fördel med MCM är förmågan att diskriminera celler i cellcykelstopp eller som har onormal cellcykelfördelning. Medan DNA-färgämnen som vanligtvis används i flödescytometri kan diskriminera mellan 2N och 4N DNA-innehåll, är de mycket ljusa, vilket i hög grad kan komplicera mätningen av andra parametrar från den lasern. IdU tar dock bara en masskanal och har minimal spill över vilket gör att andra markörer kan användas vid cellcykelbestämning. MOLM13-celler som bestrålades visar minskad IdU-inkorporering och minskning av M-fas jämfört med kontrollceller (figur 6). Störningar i de normala cellcykelkontrollpunkterna kan förändra det skenbara cellcykeltillståndet med MCM. Om man tittar på pH2AX- och cPARP-populationer i de icke-bestrålade cellerna visar pH2AX låg och cPARP^låg population normal cellcykelfördelning medan celler som uttrycker högre nivåer av pH2AX eller cPARP lokaliseras huvudsakligen i G0 / G1-fasen som förväntas (figur 6a). I de bestrålade cellerna är pH2AX låg och cPARP låg, men cellerna är nästan helt lokaliserade i G0-fasen, medan pH2AX^hög och cPARP ^låg cell visar en cellcykelstoppfenotyp med IdU-inkorporering och lokalisering till G0 / G1-fas och G2-fas med frånvaro av M-fas. De höga cellerna pH2AX och cPARP^high visar också celler som innehåller viss IdU^och lokaliseras till G0/G1-fasen som indikerar strålningsskador (figur 6b).

Figur 1: Upprättande av singlettgrindarna med 191-Ir efter händelselängd och även Gaussparametrar, Residual och Offset.
Skillnaderna i T-cell (CD45+/CD3+) och S-fas (IdU⁺) mellan ett obehandlat prov (a), en händelselängd jämfört med 191-Ir singlettgrind (b), eller en singlettgrind kombinerad med gaussiska parametrar, residual och offset (c). Singlettgrind tar bort skräp, dubbletter och pärlor som visas i förlusten av pRb^hög befolkning på det högra hörnet av biaxialen. Denna singlettgrind kan optimeras ytterligare genom att inkludera Gaussiska parametrar som rester och förskjutning, vilket tar bort mer skräp. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Bild 2: Grindschemat för att upprätta cellcykelgrindar för G0-, G1-, S-, G2- och M-faser med IdU, CyclinB1, pRb och pHH3.
Singlettgrinden är etablerad för att ta bort dubbletter och skräp (a). S-fasen måste etableras (b), när S-fasen har etablerats kan IdU⁺-populationen användas för att fastställa G2/M-fasgränsen (c,d). Fastställandet av G2/M-fasgränsen fastställer gränserna för G0/G1-faspopulationen (f). Populationen pRb⁺ och G0-fas är etablerade på IdU vs pRb biaxial. IdU + -cellerna (h) används för att fastställa gränsen för pRb ⁺ -populationen (i). Gränsen för pRb⁺-populationen fastställer gränsen för G0-faspopulationen (j). M-fasen är etablerad på pHH3⁺ celler som är IdU^- (k). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Upprättande av cellcykelgrindar utan användning av pRb eller utan användning av IdU-inkorporering.
Ritning av G0-fasen kan också göras med Ki-67 enligt samma grindstrategi som användes med pRb, om pRb inte ingår i experimentet (a). Om IdU-inkorporering misslyckades eller inte utfördes är det möjligt att fortfarande återvinna de relativa cellcykelfraktionerna genom användning av Ki67 och pRb. Ki67 och pRb dubbelt positivt uttryck är korrelerat med celler i cykeln, vilket framgår av att visa att IdU ⁺ -cellerna främst finns i den dubbla positiva populationen (b). Ki67 och pRb låg population korrelerar med G0-fas eller inte cyklande population demonstrerad av pRb låg / IdU^neg celler som finns i Ki67 och pRb^låg population. Denna metod kan inte diskriminera enskilda cellcykelfaser men kan fortfarande användas för att bestämma relativa cykelfraktioner under experimentella förhållanden. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Representativa siffror för effekten av olika lagringsförhållanden på cellcykelfördelningen hos HL-60-celler.
Cellerna inkuberades i en timme följt av en timmes vila vid de angivna temperaturförhållandena i förseglade rör (a). Det finns märkbara effekter på cellcykelfördelningen jämfört med kontrollen. HL60-celler förvarades i förseglade rör vid rumstemperatur i 30 minuter, en situation som kan uppstå i klinisk miljö, före IdU-inkorporering (b). Förseglade rör som hölls vid rumstemperatur i 30 minuter visade inte märkbara cellcykelskillnader. Effekten av kryogen lagring undersöktes på cellcykeln i HL60-celler, där ett prov togs före kryogen lagring och ett prov togs efter en timmes vila efter en vecka i kryogen lagring (c). En timme efter upptining påverkas cellcykelfördelningen och cellcykelfördelningen återgår inte till det normala förrän ungefär en vecka efter upptining. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5: Bearbetning kan ha effekt på patientprover och representativa bilder visas mellan två olika patienter som visar (a) T-cellerna (CD45 hög/CD3^hög) och (b) monoblaster (CD33+, HLADR⁺, CD11b^låg, CD14^neg).
Mellan märg ett och märg två är det tydligt att i märg 2 fanns en T-cellaktiveringseffekt under 30 minuters vila medan märg en inte hade någon sådan effekt. Märg ett visade möjlig aktiveringseffekt i monoblastpopulationen efter 30 minuter medan märg två inte gjorde det. I båda märgarna var det dock tydligt att kryogen lagring påverkade cellcykelfördelningen oavsett celltyp. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6: MOLM13-celler lämnades antingen som kontroller eller bestrålades med hjälp av en röntgenstrålare vid 10Gy.
MOLM13-celler visar cellcykelfördelningen i fyra olika populationer av pH2AX- och cPARP-uttryck. Kontrollceller visar minimal pH2AX- och cPARP-färgning, med normala cellcykelegenskaper som visas i pH2AX låg och cPARP^låg population (a). Medan de bestrålade cellerna visar en onormal cellcykelfördelning med majoriteten av cykelcellerna belägna i pH2AX hög och cPARP^hög, vilket indikerar cellcykelstörning (b). De oskadade, pH2AX^låga och cPARP^låga, cellerna visar brist på cykelegenskaper finns främst i G0-fasen. Utan dessa markörer skulle dessa celler framträda som 4N- och 2N-celler i normal flödescytometri, vilket möjligen kan förvirra nedströms cellcykelanalys. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Exemplen som presenteras här visar hur man använder en MCM-plattform för att analysera cellcykelfördelning. Det har också visats att cellcykelanalys är känslig för experimentella förhållanden som tid och temperatur, vilket är ett viktigt övervägande som forskare måste ta när de överväger MCM för sin cellcykelanalys¹⁴. Prover som lämnas i lager under en kort tidsperiod, inte längre än en timme, kommer att ha IdU-införlivande som är jämförbar med deras normala tillstånd. Prover i ett slutet system under långa tidsperioder, cirka 2 timmar, kommer att ha minskad IdU-inkorporering, men de relativa cykel- och icke-cykelfraktionerna kommer inte att förändras vilket möjliggör grov cellcykelanalys. Kryogen lagring och efterföljande upptining stör den normala cellcykelfördelningen under en betydande tidsperiod. Kryogen lagring har tidigare noterats störa protein- och RNA-distributionen men har först nyligen visat sig störa cellcykeln^14,15,16,17. Sammantaget indikerar dessa att om långa lagringstider förväntas eller kryogen konservering av prover skulle det vara bättre att färga cellerna med IdU före lagring eller kryogen lagring, fixera cellerna och lagra dem tills analys kan göras. Eftersom cellcykelanalys av MCM inte kräver levande celler skulle detta göra det möjligt för forskare att banka värdefulla prover och utföra noggrann nedströms cellcykelanalys.

Cellcykelanalys med MCM är ett robust system som kan djupförhöra experimentella modeller. På grund av MCM högt parameterantal, cirka 40-50 masskanaler, kan cellcykelanalys kombineras med andra intracellulära eller extracellulära markörer som kringgår behovet av sortering av celler baserat på immunofenotyp som kan orsaka att signifikanta cellcykeleffekter går förlorade. MCM:s höga parameterkaraktär lämpar sig för att undersöka effekter i högdimensionella kartläggningsapplikationer som SPADE och viSNE. Medan SPADE och viSNE vanligtvis används för att definiera immunofenotypiska populationer, som sedan kan undersökas för cellcykelförändringar, skulle det också vara möjligt att kartlägga på cellcykelmarkörer. Beroende på experimentella förhållanden kan kartläggning av cellcykelmarkörer i ett högdimensionellt utrymme visa cellcykelkorrelation med läkemedelseffekt eller vilka immunofenotypiska populationer som kan lokaliseras till varje cykeltillstånd ^3,5. Medan MCM kan begränsas av bristen på DNA-bindande fluorescerande färgämnen, kompenseras detta av direkt IdU-inkorporering under S-fasceller och intracellulära cellcykelproteiner kan användas för att bestämma cellcykeltillståndet. Dessa cellcykelproteiner kan också hjälpa till att skilja mellan stadier av cellcykelstopp som annars skulle visas som 3N eller 4N i traditionellt flöde med användning av DNA-bindande färgämnen. Sådana mycket parametriska system är dock inte utan nackdelar, och det är känsligt för störningar i cellcykeln. Vi har visat att långa lagringstider och kryogen lagring kan påverka cellcykelfördelningen avsevärt. Detta är särskilt viktigt när man försöker rationalisera experimentella effekter för läkemedel som kan påverka cellcykelfördelningen. Behandling av läkemedel som är utformade för att påverka cellcykeln på frysta delprov kan ge falska uppgifter om cellcykelns effekt när de används omedelbart efter upptining från kryogen lagring. MCM är en mångsidig teknik för cellcykelanalys som kan tillämpas på ett antal experimentella modeller och är särskilt lämpad för djupprofilering av heterogena system. Som med andra mycket parametriska metoder är det nödvändigt att ha ett noggrant utformat experiment med lämpliga överväganden för hur bearbetning och experimentella effekter kommer att påverka cellcykelanalysen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3059	Component of CSM
Centrifuge	Thermo Scientific	75-217-420	Sample centrifugation
Cleaved-PARP (D214)	BD Biosciences	F21-852	Identification of apoptotic cells
Cyclin B1	BD Biosciences	GNS-1	G2 Resolution
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650	Cryopreservative
EQ Four Element Calibration Beads	Fluidigm	201078	Internal metal standard for CyTOF performance
FACS Tube w/ mesh strainer	Corning	08-771-23	Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	97068-085	Cell culture growth supplement
Helios	Fluidigm		CyTOF System/Platform
Heparin	Sigma	H3393	Staining additive to prevent non-specific staining
IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine)	Sigma	I7125	Incorporates in S-phase
Ki-67	eBiosciences	SolA15	Confirmation of G0/G1
MaxPar Multi Label Kit	Fluidigm	201300	Metal labeling kit, attaches metals to antibodies
Microplate Shaker	Thermo Scientific	88880023	Mixing samples during staining
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Services	15710	Fixative
pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine	Fluidigm	201192	Cell identification during CyTOF acquisition
p-H2AX (S139)	Millipore	JBW301	Detection of DNA damage
p-HH3 (S28)	Biolegend	HTA28	M-phase Resolution
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Wash solution for cell culture and component of fixative solution
p-Rb (S807/811)	BD Biosciences	J112906	G0/G1 Resolution
Proteomic Stabilizer	SmartTube Inc	PROT1	Sample fixative
RPMI 1640	Gibco	21870-076	Cell culture growth medium
Sodium Azide	Acros Organics	AC447810250	Component of CSM/Antibody buffer, biocide