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Genetics

मास साइटोमेट्री प्लेटफॉर्म में सेल चक्र चरणस्थापित करने के लिए सेल चक्र मार्करों के साथ पाइरिमिडीन एनालॉग, 5-आयोडो-2'-डीऑक्स्यूरिडाइन (आईडीयू) का उपयोग

Published: October 22, 2021 doi: 10.3791/60556
Automatic Translation
1, 1
1Ohio State Comprehensive Cancer Center, Division of Hematology, The Ohio State University

Summary

यह प्रोटोकॉल मास साइटोमेट्री प्लेटफॉर्म में उपयोग के लिए सेल चक्र माप को अनुकूलित करता है। मास साइटोमेट्री की बहु-पैरामीटर क्षमताओं के साथ, आयोडीन निगमन का प्रत्यक्ष माप एस-चरण में कोशिकाओं की पहचान की अनुमति देता है जबकि इंट्रासेल्युलर साइक्लिंग मार्कर प्रयोगात्मक स्थितियों की एक श्रृंखला में प्रत्येक सेल चक्र अवस्था के लक्षण वर्णन को सक्षम करते हैं।

Abstract

सेल चक्र चरण का विनियमन सेलुलर प्रसार और होमियोस्टैसिस का एक महत्वपूर्ण पहलू है। कोशिका चक्र को नियंत्रित करने वाले नियामक तंत्र का विघटन कैंसर सहित कई बीमारियों की एक विशेषता है। सेल चक्र के अध्ययन के लिए सेल चक्र प्रगति के प्रत्येक भाग में कोशिकाओं की संख्या को परिभाषित करने के साथ-साथ प्रत्येक सेल चक्र चरण के बीच स्पष्ट रूप से चित्रित करने की क्षमता की आवश्यकता होती है। मास साइटोमेट्री (एमसीएम) का आगमन मौलिक आइसोटोप के प्रत्यक्ष माप के माध्यम से उच्च थ्रूपुट एकल कोशिका विश्लेषण के लिए जबरदस्त क्षमता प्रदान करता है, और एमसीएम द्वारा सेल चक्र स्थिति को मापने के लिए एक विधि का विकास एमसीएम की उपयोगिता को और बढ़ाता है। यहां हम एक ऐसी विधि का वर्णन करते हैं जो सीधे एमसीएम प्रणाली में 5-ब्रोमो-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन (बीआरडीयू) के समान 5-आयोडो-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन (आईडीयू) को मापता है। इस आईडीयू-आधारित एमसीएम का उपयोग कई फायदे प्रदान करता है। सबसे पहले, आईडीयू को इसके संश्लेषण के दौरान डीएनए में तेजी से शामिल किया जाता है, जिससे एस-चरण में कोशिकाओं के विश्वसनीय माप की अनुमति मिलती है, जिसमें 10-15 मिनट तक ऊष्मायन होता है। दूसरा, आईडीयू को द्वितीयक एंटीबॉडी की आवश्यकता या डीएनए क्षरण की आवश्यकता के बिना मापा जाता है। तीसरा, आईडीयू धुंधला पन को साइक्लिन बी 1, फॉस्फोराइलेटेड रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन (आरबी), और फॉस्फोराइलेटेड हिस्टोन एच 3 (पीएचएच 3) के माप के साथ आसानी से जोड़ा जा सकता है, जो सामूहिक रूप से पांच सेल चक्र चरणों का स्पष्ट चित्रण प्रदान करता है। एमसीएम के साथ संभव मापदंडों की उच्च संख्या के साथ इन सेल चक्र मार्करों का संयोजन कई अन्य मैट्रिक्स के साथ संयोजन की अनुमति देता है।

Introduction

मास साइटोमेट्री मास स्पेक्ट्रोस्कोपी के उच्च रिज़ॉल्यूशन और मात्रात्मक प्रकृति का लाभ उठाकर लगभग 40 मापदंडों का पता लगाने में सक्षम बनाता है। फ्लोरोफोर संयुग्मित एंटीबॉडी के बजाय धातु-लेबल एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है जो अधिक संख्या में चैनलों की अनुमति देते हैं और न्यूनतम स्पिलओवर 1,2 का उत्पादन करते हैं। प्रवाह साइटोमेट्री की तुलना में सेल चक्र विश्लेषण के संबंध में एमसीएम के फायदे और नुकसान हैं। एमसीएम का एक प्रमुख लाभ यह है कि बड़ी संख्या में पैरामीटर अत्यधिक विषम नमूनों में बड़ी संख्या में इम्यूनोफेनोटाइपिक रूप से अलग टी-सेल प्रकारों में सेल चक्र स्थिति के एक साथ माप को सक्षम बनाते हैं। एमसीएम का उपयोग मानव अस्थि मज्जा 3 में सामान्य हेमटोपोइजिस और टेलोमेरेज़ की कमीके ट्रांसजेनिक मुराइन मॉडल के दौरान कोशिका चक्र की स्थिति को मापने के लिए सफलतापूर्वक किया गयाहै। तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) में सेल चक्र की स्थिति के विश्लेषण से पता चला है कि सेल चक्र नैदानिक उपचारों के लिए ज्ञात प्रतिक्रियाओं से संबंधित है, कार्यात्मक विशेषताओं में एक इनविवो अंतर्दृष्टि प्रदान करता है जो चिकित्सा चयनको सूचित कर सकता है। मास साइटोमेट्रिक सेल चक्र विश्लेषण का दूसरा लाभ बड़ी संख्या में अन्य कार्यात्मक मार्करों को मापने की क्षमता है जो सेल चक्र स्थिति के साथ सहसंबद्ध हो सकते हैं। हाल के काम में आईडीयू और धातु टैग किए गए एंटीबॉडी के उपयोग के माध्यम से सेल चक्र अवस्था के साथ प्रोटीन और आरएनए संश्लेषण को सहसंबंधित करने में सक्षम किया गयाहै। भेदभाव की निरंतरता में कई आबादी में सेल चक्र की स्थिति को मापने वाला इस तरह का अत्यधिक पैरामीट्रिक विश्लेषण वर्तमान प्रवाह साइटोमेट्री तकनीक के साथ लगभग असंभव होगा। एमसीएम का प्रमुख नुकसान फ्लोरोसेंट फ्लो साइटोमेट्री (जैसे, DAPI, Hoechst, Pyronin Y, आदि) में उपयोग किए जाने वाले तुलनीय डीएनए या आरएनए दाग की कमी है। फ्लोरोसेंट रंजक डीएनए और आरएनए सामग्री के अपेक्षाकृत सटीक माप दे सकते हैं, लेकिन यह परिशुद्धता केवल इन रंगों के फ्लोरोसेंट गुणों में परिवर्तन के कारण संभव है जो न्यूक्लियोटाइड बेस के बीच इंटरकेलेशन पर होते हैं। एमसीएम विश्लेषण इस प्रकार समान परिशुद्धता के साथ डीएनए या आरएनए सामग्री को मापने में असमर्थ है। इसके बजाय, मास साइटोमेट्रिक सेल चक्र विश्लेषण सेल चक्र अवस्था से संबंधित प्रोटीन के माप पर निर्भर करता है जैसे साइक्लिन बी 1, फॉस्फोराइलेटेड रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन (पीबी), और फॉस्फोराइलेटेड हिस्टोन एच 3 (पीएचएच 3) आईडीयू निगमन से आयोडीन परमाणु के प्रत्यक्ष माप के साथ संयुक्त एस-चरण कोशिकाओं में। ये दो माप दृष्टिकोण सामान्य सेलुलर प्रसार के दौरान अत्यधिक समान परिणाम देते हैं, लेकिन सेल चक्र की प्रगति बाधित होने पर संभावित रूप से अलग हो सकते हैं।

प्रत्येक सेल चक्र चरण में कोशिकाओं की संख्या का मापन सामान्य सेल चक्र विकास के साथ-साथ सेल चक्र व्यवधान को समझने में महत्वपूर्ण है, जो आमतौर पर कैंसर और प्रतिरक्षाविज्ञानी रोगों में देखा जाता है। एमसीएम धातु-टैग किए गए एंटीबॉडी का उपयोग करके बाह्य और इंट्रासेल्युलर कारकों का विश्वसनीय माप प्रदान करता है; हालांकि, एस-चरण का माप सीमित था क्योंकि इरिडियम-आधारित डीएनए इंटरकैलेटर 2 एन और 4 एन डीएनए के बीच अंतर करने में असमर्थ था। सेल चक्र चरणों को परिभाषित करने के लिए, बेहबेहानी ने एक विधि विकसित की जो 127 के द्रव्यमान के साथ आईडीयू का उपयोग करती है, जो द्रव्यमान साइटोमीटर की सीमा के भीतर आती है और एस-चरण3 में कोशिकाओं के प्रत्यक्ष माप की अनुमति देती है। यह प्रत्यक्ष माप द्वितीयक एंटीबॉडी या एसिड या डीएनएस जैसे डीएनए विकृत एजेंटों के उपयोग की आवश्यकता को दरकिनार करता है। इंट्रासेल्युलर साइक्लिंग मार्करों के साथ संयोजन में, यह प्रयोगात्मक मॉडल में सेल चक्र वितरण के उच्च रिज़ॉल्यूशन की अनुमति देता है।

यह प्रोटोकॉल एमसीएम के लिए सामान्य प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल से सेल चक्र माप को अनुकूलित करता है। हमारे तरीके सेल चक्र मापदंडों को शामिल करने के लिए एक सुविधाजनक और सरल तरीका प्रदान करते हैं। इन विट्रो नमूनों के आईडीयू निगमन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर केवल 10 से 15 मिनट की इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है, जो अधिकांश बीआरडीयू स्टेनिंग प्रोटोकॉल की तुलना में कम है जो कई घंटों 3,7 के इनक्यूबेशन बार की सलाह देते हैं। आईडीयू और बीआरडीयू शामिल नमूने को प्रोटिओमिक स्टेबलाइजर का उपयोग करके तय किया जा सकता है और फिर -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में कुछ समय के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। यह नमूना गुणवत्ता में कमी के बिना बैच विश्लेषण के लिए बड़ी संख्या में आईडीयू दाग वाले नमूनों को संग्रहीत करने की अनुमति देता है।

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Protocol

1. आईडीयू स्टॉक की तैयारी

  1. डीएमएसओ में 5-आयोडो-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन (आईडीयू) को 50 एमएम की एकाग्रता में भंग करें। बाँझ फ़िल्टर, 10-50 μL ट्यूबों में एलिकोट करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
  2. फ्रीजर से आईडीयू निकालें, और कमरे के तापमान पर पिघल जाएं। 1 mM की अंतिम एकाग्रता पर एक कामकाजी समाधान बनाने के लिए RPMI-1640 में IDU को पतला करें। पिपेट ऊपर और नीचे या भंवर को मिलाने के लिए।
    1. आमतौर पर, केंद्रित आईडीयू को मीडिया में पतला करें जिसमें कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया जा रहा है (जैसे डीएमईएम, आईएमडीएम, आदि) या इसे परिधीय रक्त या अस्थि मज्जा एस्पिरेट नमूनों के अलावा सीधे पीबीएस में पतला किया है। यह पूर्व-कमजोर पड़ने वाला कदम डीएमएसओ को रुचि की कोशिकाओं के जलीय मीडिया के साथ मिलाने की सुविधा प्रदान करता है।
      नोट: इनक्यूबेशन के दौरान आईडीयू की अंतिम एकाग्रता 10 μM होनी चाहिए; 1 mM का एक समाधान मीडिया के प्रत्येक 1 mL के लिए 10 μL के अनुपात में जोड़ा जा सकता है।

2. आईडीयू इनक्यूबेशन और नमूना संरक्षण

  1. एक ह्यूमिडिफाइड 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में नमूने बनाए रखें। इनक्यूबेटर से नमूना निकालें और नमूने को जैव सुरक्षा हुड में ले जाएं।
  2. नमूने के प्रत्येक 1 एमएल में 1 mM IDU का 10 μL जोड़ें।
    1. 6-वेल प्लेट के लिए, प्रत्येक कुएं में कल्चर मीडिया के 3 एमएल में 1 एमएम आईडीयू का 30 μL जोड़ें। आईडीयू का उपयोग अस्थि मज्जा एस्पिरेट्स के साथ-साथ मुराइन अध्ययन में भी किया जा सकताहै।
  3. नमूने को 10-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में वापस रखें। एस-चरण का सबसे सटीक माप प्राप्त करने के लिए आईडीयू एक्सपोजर के दौरान रुचि की इष्टतम विकास स्थितियों के तहत कोशिकाओं को बनाए रखें।
  4. आईडीयू इनक्यूबेशन के बाद, नमूना हटा दें और शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए नमूने को 400 x g पर घुमाएं ।
  6. सतह पर तैरने वाला और पीबीएस के 200 μL में पुन: निलंबन करें।
    1. यदि आवश्यक हो, तो निर्धारण और ठंड से पहले मृत कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए इस चरण में एक जीवित / मृत दाग (सिस्प्लैटिन का उपयोग करके) करें।
      मृत धुंधलापन मेथनॉल परमेबिलाइजेशन के बाद अच्छी तरह से प्रदर्शन नहीं करता है, इसलिए इसे सेल चक्र विश्लेषण में उपयोग के लिए अनुशंसित नहीं किया जाता है।
  7. 1.5% पीएफए की अंतिम एकाग्रता के लिए पीबीएस में 16% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) का 18.75 μL जोड़ें। 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए नमूने को 400 x g पर घुमाएं।
  8. पीबीएस/पीएफए समाधान को एस्पिरेट करें और फ्रीजिंग से पहले सेल स्टेनिंग मीडिया (सीएसएम; 0.5% बीएसए और 0.02% सोडियम एज़ाइड के साथ 1x PBS) + 10% DMSO के 500 μL में नमूने को फिर से निलंबित करें।
    1. वाणिज्यिक प्रोटिओमिक स्टेबलाइजर का उपयोग करते समय, पीबीएस (1: 1.4) के 200 μL में फिर से निलंबित नमूने के लिए 280 μL प्रोटिओमिक स्टेबलाइजर जोड़ें। 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने इनक्यूबेट करें और फिर सीधे -80 डिग्री सेल्सियस में रखें।
      नोट: आईडीयू को 10-15 मिनट के भीतर प्रभावी ढंग से शामिल करने के लिए दिखाया गया है इनक्यूबेशन 37 डिग्री सेल्सियस पर। 10-15 मिनट से अधिक समय तक आईडीयू ऊष्मायन उत्तरोत्तर एस और जी 2-चरण आबादी के संकल्प को कम कर देगा, क्योंकि आईडीयू-लेबल कोशिकाएं एस चरण छोड़ देती हैं और जी 2 या एम चरण में प्रगति करती हैं। हमने यह भी देखा है कि आईडीयू के साथ दीर्घकालिक इनक्यूबेशन कोशिका मृत्यु और कोशिका चक्र कलाकृतियों का कारण बन सकती है। आईडीयू निगमन के बाद बाद में सेल प्रोसेसिंग और एंटीबॉडी धुंधला होना अवशिष्ट आईडीयू को धोने के लिए पर्याप्त है जिसे एस-चरण कोशिकाओं में शामिल नहीं किया गया था। हमने यहां वर्णित इन विट्रो प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय महत्वपूर्ण आयोडीन पृष्ठभूमि नहीं देखी है; हालांकि, हमने नैदानिक नमूनों में आयोडीन संदूषण को बहुत कम देखा है। यह चिकित्सा प्रक्रियाओं से हो सकता है, जैसे कि सीटी स्कैन में आयोडीन कंट्रास्ट, या आयोडीन युक्त फार्मास्यूटिकल्स से। क्या बड़ी मात्रा में आईडीयू पृष्ठभूमि देखी जानी चाहिए, द्रव्यमान साइटोमीटर डिटेक्टर को नुकसान से बचने के लिए नमूना नहीं चलाया जाना चाहिए।

3. मास साइटोमेट्री के लिए धुंधला नमूने

  1. -80 डिग्री सेल्सियस से नमूने निकालें और सतह धुंधला होने से पहले पिघलने दें।
    1. यदि निर्धारण की स्मार्टट्यूब विधि का उपयोग कर रहे हैं, तो नमूने गर्म होने पर अतिरिक्त निर्धारण से बचने के लिए नमूने को 0-4 डिग्री सेल्सियस पर पिघलाएं।
  2. नमूने पिघलने के बाद, लगभग 1-2 मिलियन कोशिकाओं को 5 एमएल एफएसीएस ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. 5 मिनट के लिए 600 x g पर FACS ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें, और कोशिकाओं को धोने के लिए सेल स्टेनिंग मीडिया (CSM) के साथ FACS ट्यूब भरें। एक अतिरिक्त बार दोहराएं।
    1. यदि कोशिकाओं को एक साथ चिपकने के लिए जाना जाता है, तो सेल से सेल संपर्क को रोकने के लिए सीएसएम वॉश में हेपरिन के 400 यू / एमएल जोड़ें लेकिन यह सख्ती से आवश्यक नहीं है।
  4. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एफसी-ब्लॉकिंग एजेंट, प्रति 100 μL कोशिकाओं के एजेंट के 5 μL के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  5. एंटीबॉडी का एक मिश्रण तैयार करें जो कोशिकाओं की सतह, या बाह्य भाग को दाग देगा। प्रत्येक परीक्षण में कुल धुंधला मिश्रण प्रति 1-2 मिलियन कोशिकाओं में 100 μL की मात्रा होगी। धुंधला मिश्रण कॉकटेल और एफएसीएस ट्यूब में सीएसएम और हेपरिन के साथ तदनुसार संतुलित होगा।
    नोट: इस चरण में सीएसएम को जोड़ने से गैर-विशिष्ट धुंधला कलाकृतियों को भी कम किया जासकेगा। यह धुंधला मिश्रण पूरी तरह से रुचि और सतह फेनोटाइप के लक्ष्यों पर निर्भर है (उदाहरण के लिए, टी-कोशिकाओं से जुड़े एक अध्ययन में सीडी 45, सीडी 3, सीडी 4, सीडी 8, आदि के सतह मिश्रण का उपयोग किया जाएगा)। नमूना प्रसंस्करण और धुंधला होने का एक विस्तृत प्रोटोकॉल बेहबेहानी और मैकार्थी एट अल.9,10 में पाया जा सकता है।
  6. कोशिकाओं में सतह धुंधला मिश्रण जोड़ें और 30-60 मिनट के लिए लगातार झटकों के साथ कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  7. धुंधला होने के बाद, सीएसएम के साथ एफएसीएस ट्यूब भरें, और 5 मिनट के लिए 600 x g पर स्पिन करें।
  8. सीएसएम के साथ दो बार और धोएं, नमूने को 5 मिनट के लिए 600 x ग्राम पर घुमाएं और प्रत्येक सीएसएम धोने को उत्तेजित करें।
  9. 10% सीएसएम और 1.5% पीएफए के साथ पीबीएस के 1 एमएल जोड़कर बाह्य एंटीबॉडी को ठीक करें।
  10. पीबीएस/सीएसएम/पीएफए मिश्रण युक्त एफएसीएस ट्यूब को सीएसएम से भरें। 5 मिनट के लिए 600 x g पर स्पिन करें और सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें।
  11. -20 डिग्री सेल्सियस पर मेथनॉल जोड़ें।
  12. एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए 1-2 मिनट के लिए भंवर नमूना और यह सत्यापित करें कि सभी सेल क्लंप को फिर से निलंबित कर दिया गया है।
  13. जबकि नमूना धीरे-धीरे भंवर कर रहा है, तेजी से फ़िल्टर टिप के साथ 1,000 μL पिपेट का उपयोग करके 1 एमएल बर्फ-ठंडा मेथनॉल जोड़ें।
  14. एफएसी ट्यूब को प्रकाश तक रखें और सुनिश्चित करें कि कोई दिखाई देने वाला झुरमुट नहीं है; बादल छाए रहने की उम्मीद की जा रही है। कोई भी झुरमुट बाद के एमसीएम विश्लेषण के लिए नमूने को अनुपयोगी बना देगा।
  15. 10-20 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्टोर करें।
  16. इस समय के दौरान इंट्रासेल्युलर धुंधला मिश्रण तैयार करें। इंट्रासेल्युलर धुंधला मिश्रण ब्याज के लक्ष्यों पर निर्भर होगा। सेल चक्र विश्लेषण के लिए, इस धुंधला मिश्रण में साइक्लिनबी 1, आरबी, केआई 67 और पीएचएच 3 शामिल करें, लेकिन अन्य इंट्रासेल्युलर मार्करों को आवश्यकतानुसार जोड़ा जा सकता है।
  17. -20 डिग्री सेल्सियस पर 10-20 मिनट के बाद, नमूना हटा दें, पीबीएस के 1.5 एमएल जोड़ें और शेष को सीएसएम के साथ भरें।
  18. नमूने को 5 मिनट के लिए 600 x g सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें।
  19. सीएसएम के साथ दो बार और धोएं, नमूने को 5 मिनट के लिए 600 x g पर घुमाएं और हर बार सतह पर तैरने वाले को सुखाएं।
  20. अंतिम सीएसएम धोने के बाद, नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें और लगभग 50 μL की अवशिष्ट मात्रा छोड़ दें।
  21. नमूने में तैयार एंटीबॉडी मिश्रण जोड़ें (आमतौर पर 100 μL की अंतिम धुंधला मात्रा प्राप्त करने के लिए एंटीबॉडी धुंधला कॉकटेल का 50 μL जोड़ें) और कमरे के तापमान पर 30 से 60 मिनट के लिए एक हिलाने वाले मंच पर इनक्यूबेट करें।
  22. धुंधला होने के बाद 5 मिनट के लिए 600 x g पर CSM और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें।
  23. सीएसएम को एस्पिरेट करें, सीएसएम के साथ फिर से धोएं, 5 मिनट के लिए 600 x g पर घूमें, सीएसएम को एस्पिरेटेड करें, फिर पीबीएस जोड़ें।
  24. इंट्रासेल्युलर धुंधलापन के पूरा होने के बाद, कोशिकाओं को एक इंटरकैलेटर समाधान में रखें जो कोशिकाओं के एंटीबॉडी को ठीक करता है और पहचान को सक्षम करने के लिए प्रत्येक कोशिकाओं के डीएनए को दाग देता है। इंटरकैलेटर समाधान में नॉनआइसोटोपिक रूप से शुद्ध इरिडियम इंटरकैलेटर (पेंटामेथिलसाइक्लोपेंटाडीनाइल-आईआर (III)-डिपिरिडोफेनाज़िन) होता है जिसे निर्माता के स्टॉक समाधान से 500 μM की एकाग्रता पर जोड़ा जाता है। समान रूप से दाग लगाने और ओवरस्टेनिंग को रोकने के लिए 100-200 μL प्रति मिलियन कोशिकाओं पर इरिडियम इंटरकैलेटर समाधान जोड़ें।
    नोट: इस इंटरकैलेटर समाधान में इरिडियम का उद्देश्य एकल गेटिंग के लिए कोशिकाओं की पहचान करना है, इसका उपयोग जीवित / मृत दाग के लिए नहीं किया जाना चाहिए। यदि जीवित / मृत दाग वांछित हैं, तो उन्हें निर्धारण से पहले किया जाना चाहिए जैसा कि ऊपर और मैकार्थी एट अल 9 में उल्लेख किया गया है।
  25. साइटोफ़ पर नमूना अधिग्रहण से पहले दो सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में इंटरकैलेटर समाधान में नमूने स्टोर करें।

4. मास साइटोमीटर ऑपरेशन

नोट: मास साइटोमेट्री ऑपरेशन मशीन विशिष्ट हो सकता है। ऑपरेशन से पहले CyTOF उपयोगकर्ता के मैनुअल की जांच करना हमेशा उचित होता है। इसके अतिरिक्त, वर्तमान में मशीन स्टार्ट अप और रखरखाव 9,11 से निपटने वाले दो जोव लेख हैं।

  1. मास साइटोमीटर के संचालन से पहले किसी भी क्लोग, दरारें और अन्य अनियमितताओं के लिए नेब्युलाइज़र की जांच करें।
  2. नेब्युलाइज़र को साइटोमीटर से कनेक्ट करें और वार्मअप प्रक्रिया शुरू करें। नेब्युलाइज़र के बिना मास साइटोमीटर शुरू न करें।
  3. द्रव्यमान साइटोमीटर के गर्म होने के बाद नमूना लाइनों के माध्यम से पानी चलाएं। ट्यूनिंग या नमूना विश्लेषण करने से पहले स्प्रे कक्ष को लगभग 200 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने की आवश्यकता होती है।
  4. 5-10 मिनट के लिए पानी चलाएं। 5-10 मिनट के बाद, ट्यूनिंग समाधान लोड करें और ट्यूनिंग प्रबंधक का चयन करें। ट्यूनिंग समाधान धातुओं की निश्चित सांद्रता वाला एक समाधान है और नमूना अधिग्रहण से पहले द्रव्यमान साइटोमीटर को अनुकूलित करने के लिए उपयोग किया जाता है
  5. ट्यूनिंग प्रबंधक में, स्वचालित ट्यूनिंग प्रक्रिया शुरू करने के लिए ट्यूनिंग समाधान एक स्थिर स्थिति हिट रिकॉर्ड तक पहुंचने के बाद पूर्वावलोकन का चयन करें।
  6. एक बार ट्यूनिंग समाप्त हो जाने के बाद सैंपलर को पानी के साथ लोड करें और नमूना प्रसंस्करण के दौरान नमूना लाइनों के माध्यम से पानी को चलाने की अनुमति दें। दैनिक साइटोमीटर ऑपरेशन और ट्यूनिंग के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल लीपोल्ड11 में पाया जा सकता है।
  7. कभी-कभी, स्वचालित ट्यूनिंग इष्टतम मशीन प्रदर्शन के अनुरूप नहीं होगी। इसे ठीक करने के लिए ट्यूनिंग प्रक्रिया दोहराएं।
  8. नमूना अधिग्रहण से पहले नमूने को एक बार सीएसएम के साथ और दो बार शुद्ध विआयनीकृत पानी से धोएं। पीबीएस / सीएसएम से अवशिष्ट नमक को हटाने के लिए पानी से धोना महत्वपूर्ण है।
  9. ज्ञात धातु सांद्रता से भरे निर्माता द्वारा आपूर्ति किए गए संतुलन मोती, पॉलीस्टाइनिन मोती का उपयोग करके संवेदनशीलता और नमूना प्रवाह की जांच करें।
  10. अधिग्रहण मोड को ट्यूनिंग से इवेंट कैप्चर मोड में बदलें। अधिग्रहण को रोकने के लिए 120 सेकंड की समय सीमा निर्धारित करें। रिकॉर्ड का चयन करने से पहले 45 सेकंड प्रतीक्षा करें।
  11. मास साइटोमीटर 120 सेकंड के बाद स्वचालित रूप से नमूना अधिग्रहण बंद कर देगा। Eu151 और Eu153 तीव्रता की जांच करने के लिए वर्षा प्लॉट दर्शक का उपयोग करें।
  12. शुद्ध विआयनीकृत पानी में 1: 20 के अनुपात में पतला करें।
  13. नमूना अधिग्रहण से पहले प्रयोग प्रबंधक की जांच करें। चैनलों को नाम असाइन करने और रिकॉर्ड किए जाने वाले चैनलों को जोड़ने के लिए प्रयोग प्रबंधक का उपयोग करें।
    1. सुनिश्चित करें कि आईडीयू का उपयोग करते समय 127-आई चैनल जोड़ा गया है।
    2. ध्यान दें कि नमूना अधिग्रहण से पहले आवश्यक मापदंडों (जैसे, आईडीयू) को मापने के लिए मास साइटोमीटर सेट करना आवश्यक है। यदि चैनलों को अग्रिम में नहीं चुना जाता है, तो डेटा किसी भी अचयनित चैनल से एकत्र नहीं किया जाएगा और पुनर्प्राप्त नहीं किया जा सकता है।
  14. 1:20 शुद्ध विआयनीकृत पानी और संतुलन मोती मिश्रण का उपयोग करके कोशिकाओं को लगभग 1-2 x 106/एमएल की एकाग्रता में पतला करें। किसी भी अवशिष्ट झुरमुट को हटाने के लिए फिल्टर टॉप एफएसीएस ट्यूब के माध्यम से कोशिकाओं को पास करें।
  15. नमूना लोड करें और अधिग्रहण समय बदलें।
  16. पूर्वावलोकन दबाएं और स्थिर होने के लिए प्रति सेकंड ईवेंट गणना की प्रतीक्षा करें।
    1. प्रति सेकंड 400 से अधिक घटनाओं को न चलाएं, इससे डबल्स और मलबे की महत्वपूर्ण मात्रा होगी। हम आम तौर पर कम से कम 20,000 से 50,000 सेल घटनाओं को एकत्र करते हैं, लेकिन इष्टतम संख्या प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करेगी। 2 मिलियन कोशिकाओं तक धुंधला होने से आमतौर पर 300,000 से 400,000 सेल घटनाएं होंगी। ध्यान दें कि सभी घटनाएं कोशिकाएं नहीं होंगी (घटना गणना में शामिल मलबे और मोती की घटनाएं होंगी)।
  17. एक बार नमूना अधिग्रहण पूरा हो जाने के बाद एक धुलाई समाधान लोड हो जाता है, नमूना प्रेरण शुरू करें और 5-10 मिनट तक चलाएं। 5-10 मिनट के बाद नमूना प्रेरण बंद करें और 10-20 मिनट के लिए पानी चलाएं। वॉश समाधान हाइड्रोफ्लोरिक एसिड का एक कमजोर समाधान है जिसे नमूना लाइनों से अवशिष्ट धातु को स्ट्रिप करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
  18. मास साइटोमीटर को बंद करें और नेब्युलाइज़र को हटा दें। नेब्युलाइज़र गर्म होगा, हैंडलिंग के दौरान ध्यान रखें।

5. डेटा विश्लेषण

  1. मोतियों को हटाने के लिए और नमूना अधिग्रहण के दौरान सिग्नल बहाव को सही करने के लिए, फ्लूडिगम सॉफ्टवेयर या फिंक12 द्वारा विकसित एप्लिकेशन का उपयोग करके एफसीएस फ़ाइलों को सामान्य करें।
  2. एफसीएस को साइटोबैंक या अन्य फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर अपलोड करें। एफसीएस फ़ाइलों का उपयोग किसी भी संगत सॉफ़्टवेयर में किया जा सकता है, इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए साइटोबैंक13 में सभी गेटिंग और आगे का विश्लेषण किया गया है।
  3. सेल चक्र द्वार खींचे जाने से पहले, डाउनस्ट्रीम विश्लेषण से किसी भी डबल्स या सेल मलबे को बाहर करें, यह इवेंट लेंथ बनाम 191-आईआर (चित्रा 1 ए) के द्विअक्षीय भूखंड का उपयोग करके किया जा सकता है। कोशिकाएं एक अलग, उज्ज्वल आबादीका निर्माण करेंगी, जिसका उपयोग डबल्स और मलबे को बाहर करने के लिए किया जा सकता है। यह एकल द्वार है। यह गेटिंग विधि आमतौर पर डबल सेल घटनाओं के लगभग 50-60% को हटा देती है, इसलिए शेष डबल सेल घटनाओं को हटाने के लिए अतिरिक्त रणनीतियों की आवश्यकता हो सकती है।
    1. एकल गेटिंग में सहायता के लिए कोशिकाओं को अधिक प्रमुख दिखाने के लिए घटना लंबाई पैमाने (न्यूनतम और अधिकतम) को बदलें।
    2. गॉसियन मापदंडों, अवशिष्ट और ऑफसेट का उपयोग करके डबल्स और मलबे को हटा दें। कम ऑफसेट के साथ एक उच्च अवशिष्ट भी मलबे और डबल्स है, और इस आबादी के चारों ओर गेटिंग करने से डबल्स और मलबे को और हटाया जा सकता है (चित्रा 1बी, सी)।
  4. एस-फेज गेटिंग - एस-फेज ड्राइंग के लिए सबसे आसान गेट है लेकिन सबसे महत्वपूर्ण भी है। इस गेट को आईडीयू बनाम आरबी, केआई 67, या साइक्लिन बी 1 के द्विअक्षीय प्लॉट का उपयोग करके खींचें। इन द्विअक्षीय भूखंडों को देखते समय एस-फेज आईडीयू + कोशिकाएं एक अलग आबादी का निर्माण करेंगी (चित्रा 2 बी)।
  5. G0/G1-चरण, G2/M-चरण गेटिंग - IDU बनाम CyclineB1 प्लॉट पर G0/G1 और G2/M चरण द्वार स्थापित करें और G0/G1 और G2/M चरण द्वारों के बीच सीमा स्थापित करने के लिए IDU निगमन का उपयोग महत्वपूर्ण है। G0/G1-चरण साइक्लिनB1निम्न/IDU- और G2/M-चरण साइक्लिनB1उच्च/आईडीयू-होगा। अच्छा साइक्लिन बी 1 धुंधला जी 0-जी 1 और जी 2-एम आबादी के बीच एक प्राकृतिक आबादी दिखाएगा; हालांकि, यह प्रयोगात्मक परिस्थितियों में नमूना और सेल प्रकारों में भिन्न होगा। प्रयोगात्मक स्थितियों में जहां सेल चक्र वितरण प्रभावित हो सकता है और एस-चरण का उपयोग करके साइक्लिनबी 1 जी 0 / जी 1-चरण और जी 2 / एम-चरण के बीच कम पृथक्करण होता है, प्रत्येक विशिष्ट प्रयोग में विशेष सेल प्रकारों के लिए लगातार गेटिंग की अनुमति देगा। यह विधि नीचे विस्तृत है।
    1. G0/G1-चरण और G2/M-चरण के बीच पृथक्करण स्थापित करने में मदद करने के लिए CyclineB1 बनाम IDU पर केवल S-चरण कोशिकाओं को प्लॉट करें। साइक्लिनबी 1उच्च आबादी पर एक गेट खींचें और तब तक समायोजित करें जब तक कि एस-चरण की आबादी का लगभग शीर्ष 5% गेट के अंदर न हो (चित्रा 2 सी)। यह G0/G1 और G2/M चरण द्वार (चित्रा 2e,f) के बीच ब्रेकपॉइंट स्थापित करता है। सक्रिय आबादी को रुचि की आबादी में बदल दिया जाएगा और पिछले गेट के अंदर रहने वाला हिस्सा जी 2 / एम-चरण की आबादी होगी जबकि शेष जी 0 / जी 1-चरण की आबादी होगी।
  6. जी0-चरण गेटिंग - पीआरबी बनाम आईडीयू प्लॉट पर जी 0-चरण स्थापित करें। जी0-चरण का प्रतिनिधित्व पीआरबीकम/आईडीयू-जनसंख्या द्वारा किया जाएगा। सक्रिय साइकिल िंग आबादी में आरबी और आईडीयू निगमन की उच्च अभिव्यक्ति होगी, जी 0-चरण गेट को इस सीमा पर खींचा जा सकता है क्योंकि यह आमतौर पर दो अलग-अलग आबादी (चित्रा 2जी, आई) पर व्यक्त होता है।
    1. पहले खींची गई एस-चरण आबादी (चित्रा 2 बी) को सक्रिय आबादी बनाकर और पीबीउच्च आबादी के शीर्ष 90-100% को शामिल करते हुए एक गेट खींचकर जी 0-चरण को परिभाषित करें। यह pRb + साइकिल िंग आबादी है (चित्रा 2i), इस गेट के बाहर pRBकम आबादी G0 जनसंख्या (चित्रा 2j) है।
    2. यदि pRb अनुपलब्ध है या रिकॉर्ड करने में सक्षम नहीं है, तो G0-चरण की आबादी स्थापित करने के लिए Ki67 बनाम IDU का उपयोग करें। एस-चरण आबादी के बहुमत का प्रतिनिधित्व करने वाला एक गेट खींचना और उस गेट को Ki67 बनाम आईडीयू के लिए सीमा के रूप में उपयोग करके शेष आबादी जी0-चरण होगी (चित्रा 3 ए)।
  7. एम-फेज गेटिंग - आईडीयू बनाम पीएच 3 द्विअक्षीय प्लॉट में एम-चरण स्थापित करें। एम-चरण कोशिकाओं के एक बहुत छोटे अंश का प्रतिनिधित्व करता है और पीएच 3उच्च आबादी (चित्रा 2 डी) पर गेट किया जाता है।
  8. आईडीयू निगमन विफल रहा या संभव नहीं था - यदि आईडीयू अनुपलब्ध है, तो सेल साइक्लिंग को परिभाषित करें और केआई 67 और आरबी का उपयोग करके साइकिल चलाने वाले अंशों को नहीं। सामान्य परिस्थितियों में Ki67 और pRb, दो अलग-अलग आबादी बनाते हैं: Ki67उच्च / pRbउच्च और एक Ki67निम्न / pRbकम। डबल पॉजिटिव आबादी सक्रिय साइकिलिंग आबादी का प्रतिनिधित्व करती है, जो जी 1-चरण, एस-चरण, जी 2-चरण और एम-चरण से संबंधित है। डबल कम आबादी साइकिल चलाने वाली आबादी का प्रतिनिधित्व नहीं करती है, जो जी 0-चरण (चित्रा 3 बी) से संबंधित है।
    नोट: Ki67 बनाम pRb का उपयोग करके प्रत्येक व्यक्तिगत चरण को चित्रित करना संभव नहीं है, लेकिन सापेक्ष साइकिल चलाने / नहीं साइकिल चलाने वाली आबादी पर प्रयोगात्मक प्रभाव निर्धारित किए जा सकते हैं।
  9. सेल चक्र विश्लेषण - एक बार गेट स्थापित हो जाने के बाद, आगे के विश्लेषण के लिए गेट से संख्यात्मक मूल्यों का निर्यात करें। प्रत्येक चक्र में प्रतिशत संयुक्त आबादी से एकल आबादी को घटाकर प्राप्त किया जा सकता है। जी 1-चरण प्रतिशत खोजने के लिए, पीआरबीकमआईडीयूकम, गेट प्रतिशत को जी0/जी 1-चरण से घटाया जा सकता है, जिसे साइक्लिन बी 1कमआईडीयूएनईजी पर खींचा गया है। इसी तरह जी 2-चरण प्रतिशत जी 2 / एम-चरण गेट से एम-चरण गेट के घटाव से प्राप्त होता है। यह प्रत्येक व्यक्तिगत सेल चक्र चरण के लिए संख्यात्मक मान उत्पन्न करेगा; G0, G1, S, G2, और M। प्रत्येक व्यक्तिगत सेल चक्र चरण के लिए उत्पन्न संख्यात्मक मूल्यों का उपयोग आगे के विश्लेषण जैसे ग्राफिंग और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

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Representative Results

एचएल -60 कोशिकाओं और मानव अस्थि मज्जा एस्पिरेट का उपयोग करके यह दिखाना संभव है कि प्रयोगात्मक स्थितियां सेल चक्र वितरण और विश्लेषण को कैसे प्रभावित कर सकती हैं। सबसे पहले, गेटिंग रणनीति को यह प्रदर्शित करने के लिए स्थापित किया जाना चाहिए कि सेल चक्र चरण कैसे प्राप्त होते हैं। चित्रा 1 में हम एकल गेट की स्थापना दिखाते हैं, जो सेलुलर मलबे और डबल्स को अलग करने में महत्वपूर्ण है, एक एकल कोशिका आबादी स्थापित करता है। सेल लाइनों के लिए सिंगलेट गेट वह सब है जो सेल चक्र विश्लेषण (चित्रा 2 ए) पर जाने के लिए आवश्यक है। मानव नमूनों के लिए इम्यूनोफेनोटाइपिक आबादी को आमतौर पर सेल चक्र विश्लेषण से पहले स्थापित करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि प्रत्येक सेल चक्र गेट की सटीक सीमाएं विभिन्न सेल प्रकारों में भिन्न हो सकती हैं। एक बार आबादी स्थापित हो जाने के बाद (आमतौर पर उस आबादी को परिभाषित करने वाले सतह मार्करों पर गेटिंग करके) सेल चक्र द्वार स्थापित करने की आवश्यकता होगी। चित्रा 2 बी आईडीयू बनाम साइक्लिन बी 1 द्विअक्षीय भूखंड पर एस-चरण की स्थापना को दर्शाता है। इस भूखंड का उपयोग जी 2 / एम-चरण गेट (चित्रा 2 एफ) की सीमा स्थापित करने के लिए भी किया जाता है। एक बार जब G2/M-चरण स्थापित हो जाता है तो शेष G0/G1-चरण गेट (चित्रा 2f) होता है। आईडीयू बनाम आरबी का उपयोग कोशिकाओं को शामिल करने वाले आईडीयू पर एक गेट स्थापित करके पहले आरबी + साइकिलिंग आबादी को स्थापित करने के लिए किया जाता है (चित्रा 2जी, आई)। इस गेट के बाहर pRB+/IDUneg आबादी G0-चरण (चित्रा 2j) है। एम-चरण आईडीयू बनाम पीएचएच 3 पर स्थापित किया गया है जहां एम-चरण कोशिकाएं पीएचएच 3 के उच्च स्तर को व्यक्त करती हैं और कोई आईडीयू निगमन प्रदर्शित नहीं करती हैं (चित्रा 2 के)। यदि pRb शामिल नहीं है, तो G0-चरण को ऊपर वर्णित विधि (चित्रा 3a) के समान तरीके से Ki67 का उपयोग करके दोहराया जा सकता है। यदि आईडीयू निगमन विफल रहा या नहीं किया गया था, तो केआई 67 और आरबी का उपयोग करके सापेक्ष साइकिल िंग अंशों को निर्धारित करना अभी भी संभव है। Ki67 और pRb द्विअक्षीय दो अलग-अलग आबादी का उपयोग करके, एक pRb +/ Ki67+ डबल पॉजिटिव और एक pRbकम / Ki67कम आबादी का निर्माण करता है। डबल पॉजिटिव आबादी चक्र में कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती है, जबकि निम्न चक्र में कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व नहीं करती है (चित्रा 3 बी)। आईडीयू का उपयोग करके बिना आईडीयू निगमन के कोशिकाओं और पीआरबीकम कोशिकाओं को शामिल करते हुए हम दिखाते हैं कि एस-चरण मुख्य रूप से pRb +/ Ki67+ आबादी में है जबकि G0-चरण मुख्य रूप से pRBकम / Ki67कम आबादी में है।

सेल चक्र विश्लेषण विशेष रूप से आईडीयू इनक्यूबेशन चरण के दौरान अच्छी प्रयोगात्मक तकनीक पर निर्भर करता है। जबकि आईडीयू निगमन लचीला है (सेल संस्कृति, अस्थि मज्जा एस्पिरेट्स और यहां तक कि मुराइन अध्ययन में लागू होने के नाते), प्रयोगात्मक रुचि के सेल चक्र की स्थिति को बाधित किए बिना आईडीयू निगमन और निर्धारण करना आवश्यक है। आईडीयू लेबलिंग और इस प्रकार डाउनस्ट्रीम सेल चक्र विश्लेषण समय और तापमान से काफी प्रभावित हो सकता है जैसा कि चित्रा 4 द्वारा इंगित किया गया है। संलग्न जहाजों में बहुत लंबे समय तक रहने वाली कोशिकाएं या उस पर नमूना शिपमेंट या स्थानों के बीच नमूना परिवहन में सामना किया जा सकता है, एस-चरण अंश कम हो जाएगा और सेल चक्र विश्लेषण के लिए सटीक नहीं होगा (चित्रा 4 ए)। हालांकि, कम समय अवधि, कुल मिलाकर एक घंटे से कम, सामान्य सेल चक्र वितरण होगा जो दर्शाता है कि त्वरित परिवहन नकारात्मक रूप से सेल चक्र विश्लेषण नहीं कर सकता है (चित्रा 4 बी)। एक और महत्वपूर्ण संशोधक क्रायोप्रिजर्वेशन है जो नियमित रूप से अधिकांश प्रयोगशालाओं में उपयोग किया जाता है। क्रायोप्रिजर्व्ड कोशिकाओं में सेल चक्र की स्थिति की जांच करते समय कोशिकाओं को सक्रिय सेल साइकिलिंग में लौटने से पहले एक लंबी संतुलन अवधि की आवश्यकता हो सकती है, जो अभी भी पूर्व-साइरोप्रिजर्वेशन सेल चक्र स्थिति को प्रतिबिंबित नहीं कर सकती है (चित्रा 4 सी)।

प्राथमिक मानव नमूने अक्सर कई अलग-अलग सेल प्रकारों के कंपोजिट होते हैं, इन विभिन्न सेल प्रकारों में प्रसंस्करण के लिए अलग-अलग संवेदनशीलता हो सकती है जिससे विभिन्न सेल चक्र गेटिंग हो सकती है। दो अस्थि मज्जा एस्पाइरेट्स में जिन्हें तुरंत आईडीयू लेबल किया गया था, आईडीयू लेबलिंग से पहले 30 मिनट तक संग्रहीत किया गया था, या फिकोल पृथक्करण के बाद क्रायोजेनिक रूप से संग्रहीत किया गया था, प्रत्येक नमूने और आबादी के बीच अंतर हैं (चित्रा 5ए, बी)। आईडीयू निगमन में अंतर के लिए दो इम्यूनोफेनोटाइपिक आबादी की जांच की गई; टी-कोशिकाएं (सीडी 45उच्च / सीडी 3उच्च) और मोनोब्लास्ट (सीडी 33 +, एचएलएडीआर +, सीडी 11 बीकम, सीडी 14एनईजी)। सतह के निशान के सही संयोजन के साथ, आगे इम्यूनोफेनोटाइपिक आबादी की जांच करना संभव है। मज्जा # 2 में 30 मिनट के भंडारण के बाद एक ध्यान देने योग्य टी-सेल सक्रियण प्रभाव था जो एक ही रोगी से मोनोब्लास्ट में नहीं देखा गया था (चित्रा 5 बी)। सुसंस्कृत कोशिकाओं की तरह क्रायोजेनिक भंडारण के बाद आईडीयू लेबलिंग में ध्यान देने योग्य परिवर्तन थे जो जनसंख्या पर भी निर्भर थे। मज्जा # 1 में टी-सेल आबादी में कमी आई थी, लेकिन बेसलाइन (चित्रा 5ए, बी) की तुलना में मोनोब्लास्ट आईडीयू लेबल अंशों में वृद्धि हुई थी, मज्जा # 2 ने बेसलाइन की तुलना में टी-कोशिकाओं और मोनोब्लास्ट दोनों में कमी दिखाई (चित्रा 5ए, बी)। जमे हुए कोशिकाओं को तब सामान्य सेल चक्र स्थिति में लौटने से पहले एक उल्लेखनीय इनक्यूबेशन अवधि की आवश्यकता होती है और यह उन अध्ययनों को प्रभावित कर सकता है जो दवा या प्रयोगात्मक प्रभाव के मीट्रिक के रूप में सेल चक्र स्थिति या सेल चक्र स्थिति को संशोधित करने पर भरोसा करते हैं।

एमसीएम का एक अन्य लाभ सेल चक्र गिरफ्तारी में कोशिकाओं को भेदभाव करने की क्षमता है या जिनके पास असामान्य सेल चक्र वितरण है। जबकि आमतौर पर फ्लो साइटोमेट्री में उपयोग किए जाने वाले डीएनए रंजक 2 एन और 4 एन डीएनए सामग्री के बीच भेदभाव करने में सक्षम हैं, वे बहुत उज्ज्वल हैं, जो उस लेजर से अन्य मापदंडों को मापने को बहुत जटिल कर सकते हैं। हालांकि, आईडीयू केवल एक द्रव्यमान चैनल लेता है और सेल चक्र निर्धारण में अन्य मार्करों का उपयोग करने की अनुमति देने के लिए न्यूनतम स्पिल ओवर होता है। एमओएलएम 13 कोशिकाएं जिन्हें विकिरणित किया गया था, नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में आईडीयू निगमन में कमी और एम-चरण में कमी दिखाते हैं (चित्रा 6)। सामान्य सेल चक्र चौकियों का विघटन एमसीएम द्वारा स्पष्ट सेल चक्र स्थिति को बदल सकता है। गैर-विकिरणित कोशिकाओं में pH2AX और cPARP आबादी को देखते हुए pH2AXकम और cPARPकम आबादी सामान्य सेल चक्र वितरण दिखाती है जबकि pH2AX या cPARP के उच्च स्तर को व्यक्त करने वाली कोशिकाएं मुख्य रूप से G0/G1-चरण में स्थानीयकृत होती हैं जो अपेक्षित है (चित्रा 6a)। विकिरणित कोशिकाओं में पीएच 2 ए एक्सकम और सीपीआरपीकम, हालांकि, कोशिकाएं लगभग पूरी तरह से जी 0-चरण में स्थानीयकृत होती हैं, जबकि पीएच 2 ए एक्सउच्च और सीपीआरपीकम कोशिकाएं आईडीयू निगमन के साथ सेल चक्र गिरफ्तारी फेनोटाइप दिखाती हैं और एम-चरण की अनुपस्थिति के साथ जी0 / जी 1-चरण और जी 2-चरण के लिए स्थानीयकरण करती हैं। पीएच 2 ए एक्सउच्च और सीपीआरपीउच्च कोशिकाएं भी कोशिकाओं को कुछ आईडीयू को शामिल करती हैं और विकिरण क्षति के जी0 / जी 1-चरण संकेत के लिए स्थानीयकरण करती हैं (चित्रा 6 बी)।

Figure 1
चित्र 1: इवेंट लेंथ और गॉसियन मापदंडों, अवशिष्ट और ऑफसेट द्वारा 191-आईआर का उपयोग करके एकल द्वार स्थापित करना।
टी-सेल (सीडी 45 +/सीडी 3+) और एस-फेज (आईडीयू +) में अंतर एक अनगेटेड नमूना (ए), एक घटना की लंबाई बनाम 191-आईआर सिंगलेट गेट (बी), या गॉसियन मापदंडों, अवशिष्ट और ऑफसेट (सी) के साथ संयुक्त एकल गेट। सिंगलेट गेटिंग द्विअक्षीय के दाहिने कोने पर आरबीउच्च आबादी के नुकसान में दिखाए गए मलबे, डबल्स और मोतियों को हटा देता है। इस एकल गेट को गॉसियन मापदंडों जैसे अवशिष्ट और ऑफसेट को शामिल करके, अधिक मलबे को हटाकर और अनुकूलित किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: आईडीयू, साइक्लिनबी 1, आरबी और पीएचएच 3 का उपयोग करके जी 0, जी 1, एस, जी 2 और एम चरणों के लिए सेल चक्र द्वार स्थापित करने के लिए गेटिंग स्कीमा।
सिंगलेट गेट डबल्स और मलबे (ए) को हटाने के लिए स्थापित किया गया है। एस-चरण स्थापित किया जाना चाहिए (बी), एक बार एस-चरण स्थापित होने के बाद आईडीयू + आबादी का उपयोग जी 2 / एम-चरण सीमा (सी, डी) स्थापित करने के लिए किया जा सकता है। जी 2 / एम-चरण सीमा की स्थापना जी 0 / जी 1-चरण आबादी (एफ) की सीमा स्थापित करती है। pRb+ और G0-चरण की आबादी को IDU बनाम pRb द्विअक्षीय पर स्थापित किया गया है। आईडीयू + कोशिकाओं (एच) का उपयोग आरबी + आबादी (आई) के लिए सीमा स्थापित करने के लिए किया जाता है। pRb+ जनसंख्या की सीमा G0-चरण जनसंख्या (j) की सीमा स्थापित करती है। एम-चरण पीएचएच 3 + कोशिकाओं पर स्थापित किया जाता है जो आईडीयू- (के) हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: आरबी के उपयोग के बिना या आईडीयू निगमन के उपयोग के बिना सेल चक्र द्वार स्थापित करना।
जी 0-चरण को चित्रित करना भी उसी गेटिंग रणनीति का पालन करते हुए केआई -67 का उपयोग करके किया जा सकता है जिसका उपयोग आरबी के साथ किया गया था, अगर पीआरबी को प्रयोग में शामिल नहीं किया गया है (ए)। यदि आईडीयू निगमन विफल हो गया या प्रदर्शन नहीं किया गया, तो केआई 67 और आरबी के उपयोग के माध्यम से सापेक्ष सेल साइक्लिंग अंशों को पुनर्प्राप्त करना संभव है। Ki67 और pRb डबल पॉजिटिव अभिव्यक्ति चक्र में कोशिकाओं के सापेक्ष है जैसा कि यह दर्शाता है कि आईडीयू + कोशिकाएं मुख्य रूप से डबल पॉजिटिव आबादी (बी) में पाई जाती हैं। Ki67 और pRB कम जनसंख्या G0-चरण या साइकिल िंग आबादी के साथ संबंधित है, जो Ki67 और pRB कम आबादी में पाए जाने वाले pRBकम / IDUनेग कोशिकाओं द्वारा प्रदर्शित होती है। यह विधि व्यक्तिगत सेल चक्र चरणों में भेदभाव नहीं कर सकती है लेकिन अभी भी प्रयोगात्मक स्थितियों में सापेक्ष साइकिलिंग अंशों को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एचएल -60 कोशिकाओं के सेल चक्र वितरण पर विभिन्न भंडारण स्थितियों के प्रभाव के प्रतिनिधि आंकड़े।
कोशिकाओं को सील ट्यूबों (ए) में निर्दिष्ट तापमान की स्थिति पर एक घंटे के आराम के बाद एक घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था। नियंत्रण की तुलना में सेल चक्र वितरण पर ध्यान देने योग्य प्रभाव हैं। एचएल 60 कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सील ट्यूबों में रखा गया था, एक ऐसी स्थिति जो आईडीयू निगमन से पहले नैदानिक सेटिंग में हो सकती है (बी)। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखी गई सील ट्यूबों ने सराहनीय सेल चक्र अंतर नहीं दिखाया। क्रायोजेनिक भंडारण के प्रभाव की जांच एचएल 60 कोशिकाओं में सेल चक्र पर की गई थी, जहां क्रायोजेनिक भंडारण से पहले एक नमूना लिया गया था और क्रायोजेनिक भंडारण (सी) में एक सप्ताह के बाद एक घंटे के आराम के बाद एक नमूना लिया गया था। पिघलने के एक घंटे बाद सेल चक्र वितरण प्रभावित होता है और पिघलने के लगभग एक सप्ताह बाद तक सेल चक्र वितरण सामान्य नहीं होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: प्रसंस्करण का रोगी के नमूनों पर प्रभाव पड़ सकता है और प्रतिनिधि छवियों को दो अलग-अलग रोगियों के बीच दिखाया जाताहै जो (ए) टी-कोशिकाओं (सीडी 45 उच्च / सीडी 3उच्च) और (बी) मोनोब्लास्ट्स (सीडी 33 +, एचएलएडीआर +, सीडी 11 बीकम, सीडी 14एनईजी) दिखाते हैं।
मज्जा एक और मज्जा दो के बीच यह स्पष्ट है कि मज्जा 2 में 30 मिनट के आराम के दौरान टी-सेल सक्रियण प्रभाव था जबकि मज्जा एक का ऐसा कोई प्रभाव नहीं था। मज्जा एक ने 30 मिनट के बाद मोनोब्लास्ट आबादी में संभावित सक्रियण प्रभाव दिखाया जबकि मज्जा दो ने नहीं किया। दोनों मज्जाओं में, हालांकि, यह स्पष्ट था कि क्रायोजेनिक भंडारण ने सेल प्रकार की परवाह किए बिना सेल चक्र वितरण को प्रभावित किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: एमओएलएम 13 कोशिकाओं को या तो नियंत्रण के रूप में छोड़ दिया गया था या 10 जीवाई पर एक्स-रे विकिरणक का उपयोग करके विकिरणित किया गया था।
MOLM13 कोशिकाएं pH2AX और cPARP अभिव्यक्ति की चार अलग-अलग आबादी में सेल चक्र वितरण दिखाती हैं। नियंत्रण कोशिकाएं न्यूनतम पीएच 2 ए एक्स और सीपीआरपी धुंधला दिखाती हैं, सामान्य सेल चक्र विशेषताओं को पीएच 2 ए एक्सकम और सीपीआरपीकम आबादी (ए) में दिखाया जाता है। जबकि विकिरणित कोशिकाएं एक असामान्य कोशिका चक्र वितरण दिखाती हैं, जिसमें अधिकांश साइकिल िंग कोशिकाएं पीएच 2 ए एक्स उच्च और सीपीआरपीउच्च में स्थित होतीहैं, जो सेल चक्र व्यवधान (बी) का संकेत देती हैं। गैर-क्षतिग्रस्त, पीएच 2 ए एक्सकम और सीपीएआरपीकम, कोशिकाएं साइकिल िंग विशेषताओं की कमी दिखाती हैं जो मुख्य रूप से जी 0-चरण में पाई जाती हैं। इन मार्करों के बिना ये कोशिकाएं सामान्य प्रवाह साइटोमेट्री में 4 एन और 2 एन कोशिकाओं के रूप में दिखाई देंगी जो संभवतः डाउनस्ट्रीम सेल चक्र विश्लेषण को भ्रमित करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां प्रस्तुत उदाहरण प्रदर्शित करते हैं कि सेल चक्र वितरण का विश्लेषण करने के लिए एमसीएम प्लेटफॉर्म का उपयोग कैसे करें। यह भी प्रदर्शित किया गया है कि सेल चक्र विश्लेषण प्रयोगात्मक स्थितियों जैसे समय और तापमान के प्रति संवेदनशील है, जो एक महत्वपूर्ण विचार है जो शोधकर्ताओं को अपने सेल चक्र विश्लेषण14 के लिए एमसीएम पर विचार करते समय लेना चाहिए। थोड़े समय के लिए भंडारण में छोड़े गए नमूने, एक घंटे से अधिक नहीं, उनकी सामान्य स्थिति के बराबर आईडीयू निगमन होगा। लंबे समय तक बंद प्रणाली में नमूने, लगभग 2 घंटे, आईडीयू निगमन को कम कर देंगे, हालांकि, सापेक्ष साइकिल चलाना और गैर-साइकिल िंग अंश मोटे सेल चक्र विश्लेषण की अनुमति देने में बदलाव नहीं करेंगे। क्रायोजेनिक भंडारण और बाद में पिघलना एक महत्वपूर्ण अवधि के लिए सामान्य सेल चक्र वितरण के लिए विघटनकारी हैं। क्रायोजेनिक भंडारण को पहले प्रोटीन और आरएनए वितरण को बाधित करने के लिए नोट किया गया है, लेकिन हाल ही में सेल चक्र 14,15,16,17 को बाधित करने के लिए दिखाया गया है। एक साथ लेने से संकेत मिलता है कि यदि लंबे भंडारण समय या नमूनों के क्रायोजेनिक संरक्षण का अनुमान लगाया जाता है, तो भंडारण या क्रायोजेनिक भंडारण से पहले कोशिकाओं को आईडीयू के साथ दाग देना बेहतर होगा, कोशिकाओं को ठीक करें और विश्लेषण किए जाने तक उन्हें स्टोर करें। चूंकि एमसीएम द्वारा सेल चक्र विश्लेषण को जीवित कोशिकाओं की आवश्यकता नहीं होती है, इसलिए यह शोधकर्ताओं को कीमती नमूने बैंक करने और सटीक डाउनस्ट्रीम सेल चक्र विश्लेषण करने में सक्षम करेगा।

एमसीएम द्वारा सेल चक्र विश्लेषण एक मजबूत प्रणाली है जो प्रयोगात्मक मॉडल की गहरी पूछताछ में सक्षम है। एमसीएम उच्च पैरामीटर गणना के कारण, लगभग 40-50 द्रव्यमान चैनल, सेल चक्र विश्लेषण को इम्यूनोफेनोटाइप के आधार पर कोशिकाओं की छंटाई की आवश्यकता को दरकिनार करते हुए अन्य इंट्रासेल्युलर या बाह्य मार्करों के साथ संयोजित किया जा सकता है जो महत्वपूर्ण सेल चक्र प्रभाव खो सकता है। एमसीएम की उच्च पैरामीटर प्रकृति उच्च आयामी मानचित्रण अनुप्रयोगों जैसे कि स्पेड और विसएनई में प्रभावों की जांच करने के लिए खुद को उधार देती है। जबकि स्पेड और वीआईएसएनई का उपयोग आमतौर पर इम्यूनोफेनोटाइपिक आबादी को परिभाषित करने के लिए किया जाता है, जिसे तब सेल चक्र परिवर्तनों के लिए जांच की जा सकती है, सेल चक्र मार्करों पर मैप करना भी संभव होगा। प्रयोगात्मक स्थितियों के आधार पर एक उच्च-आयामी स्थान में सेल चक्र मार्करों का मानचित्रण दवा प्रभाव के साथ सेल चक्र सहसंबंध दिखा सकता है या इम्यूनोफेनोटाइपिक आबादी प्रत्येक चक्र अवस्था 3,5 के लिए स्थानीयकृत हो सकती है। जबकि एमसीएम डीएनए बाइंडिंग फ्लोरोसेंट रंगों की कमी से सीमित हो सकता है, यह एस-चरण कोशिकाओं के दौरान प्रत्यक्ष आईडीयू निगमन द्वारा क्षतिपूर्ति की जाती है और इंट्रासेल्युलर सेल चक्र प्रोटीन का उपयोग सेल चक्र स्थिति निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। ये सेल चक्र प्रोटीन सेल चक्र गिरफ्तारी के चरणों के बीच भेदभाव करने में भी मदद कर सकते हैं जो अन्यथा डीएनए बाइंडिंग रंगों का उपयोग करके पारंपरिक प्रवाह में 3 एन या 4 एन के रूप में दिखाई देंगे। इस तरह के अत्यधिक पैरामीट्रिक सिस्टम नुकसान के बिना नहीं हैं, और यह सेल चक्र में व्यवधान के प्रति संवेदनशील है। हमने दिखाया है कि लंबे भंडारण समय और क्रायोजेनिक भंडारण सेल चक्र वितरण को काफी प्रभावित कर सकते हैं। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब दवाओं के लिए प्रयोगात्मक प्रभावों को तर्कसंगत बनाने की कोशिश की जाती है जो सेल चक्र वितरण को प्रभावित कर सकते हैं। जमे हुए प्राथमिक नमूनों पर सेल चक्र को प्रभावित करने के लिए डिज़ाइन की गई दवाओं का उपचार क्रायोजेनिक भंडारण से पिघलने के तुरंत बाद उपयोग किए जाने पर सेल चक्र प्रभाव पर गलत डेटा दे सकता है। एमसीएम सेल चक्र विश्लेषण के लिए एक बहुमुखी तकनीक है जिसे कई प्रयोगात्मक मॉडलों पर लागू किया जा सकता है और विशेष रूप से विषम प्रणालियों की गहरी प्रोफाइलिंग के लिए अनुकूल है। अन्य अत्यधिक पैरामीट्रिक विधियों के साथ यह आवश्यक है कि प्रसंस्करण और प्रयोगात्मक प्रभाव सेल चक्र विश्लेषण को कैसे प्रभावित करेंगे, इसके लिए उचित विचारों के साथ सावधानीपूर्वक डिज़ाइन किया गया प्रयोग होना आवश्यक है।

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Disclosures

बेहबेहानी को फ्लूडिगम से यात्रा सहायता प्राप्त होती है। फ्लुइडिग्म ने प्रयोगशाला उपयोग के लिए अभिकर्मकों और सामग्रियों को भी खरीदा है।

Acknowledgments

लेखक अपने प्रयोगात्मक समर्थन के लिए पलक सेखरी, हुसाम अलखलाइलेह, सियाओची चांग और जस्टिन ल्यबर्गर के प्रयासों को धन्यवाद देना चाहते हैं। यह काम पेलोटोनिया फैलोशिप प्रोग्राम द्वारा समर्थित था। इस सामग्री में व्यक्त की गई कोई भी राय, निष्कर्ष और निष्कर्ष लेखक (ओं) के हैं और जरूरी नहीं कि पेलोटोनिया फैलोशिप प्रोग्राम को प्रतिबिंबित करें।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A3059 Component of CSM
Centrifuge Thermo Scientific 75-217-420 Sample centrifugation
Cleaved-PARP (D214) BD Biosciences F21-852 Identification of apoptotic cells
Cyclin B1 BD Biosciences GNS-1 G2 Resolution
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma D2650 Cryopreservative
EQ Four Element Calibration Beads Fluidigm 201078 Internal metal standard for CyTOF performance
FACS Tube w/ mesh strainer Corning 08-771-23 Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 97068-085 Cell culture growth supplement
Helios Fluidigm CyTOF System/Platform
Heparin Sigma H3393 Staining additive to prevent non-specific staining
IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine) Sigma I7125 Incorporates in S-phase
Ki-67 eBiosciences SolA15 Confirmation of G0/G1
MaxPar Multi Label Kit Fluidigm 201300 Metal labeling kit, attaches metals to antibodies
Microplate Shaker Thermo Scientific 88880023 Mixing samples during staining
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Services 15710 Fixative
pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine Fluidigm 201192 Cell identification during CyTOF acquisition
p-H2AX (S139) Millipore JBW301 Detection of DNA damage
p-HH3 (S28) Biolegend HTA28 M-phase Resolution
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190-144 Wash solution for cell culture and component of fixative solution
p-Rb (S807/811) BD Biosciences J112906 G0/G1 Resolution
Proteomic Stabilizer SmartTube Inc PROT1 Sample fixative
RPMI 1640 Gibco 21870-076 Cell culture growth medium
Sodium Azide Acros Organics AC447810250 Component of CSM/Antibody buffer, biocide

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References

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वापसी अंक 176 मास साइटोमेट्री सेल चक्र आयोडो-डीऑक्सीयूरिडिन विकिरण डीएनए क्षति प्रतिक्रिया सेल लाइन प्रतिरक्षा कोशिकाएं
मास साइटोमेट्री प्लेटफॉर्म में सेल चक्र चरणस्थापित करने के लिए सेल चक्र मार्करों के साथ पाइरिमिडीन एनालॉग, 5-आयोडो-2'-डीऑक्स्यूरिडाइन (आईडीयू) का उपयोग
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Devine, R. D., Behbehani, G. K. Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2′-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform. J. Vis. Exp. (176), e60556, doi:10.3791/60556 (2021).

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