Bruk av pyrimidinanalog, 5-jod-2'-deoksyuridin (IdU) med cellesyklusmarkører for å etablere cellesyklusfaser i en massecytometriplattform

Summary

Denne protokollen tilpasser cellesyklusmålinger for bruk i en massecytometriplattform. Med multiparameteregenskapene til massecytometri tillater direkte måling av jodinkorporering identifisering av celler i S-fase mens intracellulære syklusmarkører muliggjør karakterisering av hver cellesyklustilstand under en rekke eksperimentelle forhold.

Abstract

Reguleringen av cellesyklusfase er et viktig aspekt ved cellulær proliferasjon og homeostase. Forstyrrelse av reguleringsmekanismene som styrer cellesyklusen er en funksjon av en rekke sykdommer, inkludert kreft. Studier av cellesyklusen nødvendiggjør evnen til å definere antall celler i hver del av cellesyklusprogresjonen, samt å tydelig avgrense mellom hver cellesyklusfase. Fremkomsten av massecytometri (MCM) gir et enormt potensial for enkeltcelleanalyse med høy gjennomstrømning gjennom direkte målinger av elementære isotoper, og utviklingen av en metode for å måle cellesyklustilstanden ved MCM utvider nytten av MCM ytterligere. Her beskriver vi en metode som direkte måler 5-jod-2'-deoksyuridin (IdU), tilsvarende 5-brom-2'-deoksyuridin (BrdU), i et MCM-system. Bruk av denne IdU-baserte MCM-en gir flere fordeler. For det første blir IdU raskt inkorporert i DNA under syntesen, noe som muliggjør pålitelig måling av celler i S-fasen med inkubasjoner så korte som 10-15 minutter. For det andre måles IdU uten behov for sekundære antistoffer eller behov for DNA-nedbrytning. For det tredje kan IdU-farging enkelt kombineres med måling av cyklin B1, fosforylert retinoblastomprotein (pRb) og fosforylert histon H3 (pHH3), som samlet gir klar avgrensning av de fem cellesyklusfasene. Kombinasjon av disse cellesyklusmarkørene med det høye antallet parametere som er mulig med MCM, tillater kombinasjon med mange andre beregninger.

Introduction

Massecytometri gjør det mulig å detektere ca. 40 parametere ved å utnytte massespektroskopiens høyoppløselige og kvantitative natur. Metallmerkede antistoffer brukes i stedet for fluoroforkonjugerte antistoffer som tillater et høyere antall kanaler og gir minimal spillover ^1,2. MCM har fordeler og ulemper med hensyn til cellesyklusanalyse sammenlignet med flowcytometri. En stor fordel med MCM er at det store antallet parametere muliggjør samtidig måling av cellesyklustilstand over et stort antall immunfenotypisk distinkte T-celletyper i svært heterogene prøver. MCM har blitt brukt til å måle cellesyklustilstanden under normal hematopoiese i humant benmarg³ og transgene murine modeller av telomerasemangel⁴. Analyse av cellesyklustilstand ved akutt myelogen leukemi (AML) viste at cellesyklus korrelerte med kjente responser på kliniske terapier, noe som gir en in vivo innsikt i funksjonelle egenskaper som kan informere terapivalg⁵. En annen fordel med massecytometrisk cellesyklusanalyse er evnen til å måle et stort antall andre funksjonelle markører som kan være korrelert med cellesyklustilstand. Nylig arbeid har vært i stand til å korrelere protein- og RNA-syntese med cellesyklustilstand ved bruk av IdU og metallmerkede antistoffer mot BRU og rRNA⁶. Denne typen svært parametrisk analyse som måler cellesyklustilstand over mange populasjoner i et kontinuum av differensiering, ville være nesten umulig med dagens flowcytometriteknologi. Den største ulempen med MCM er mangelen på sammenlignbare DNA- eller RNA-flekker som de som brukes i fluorescerende flowcytometri (f.eks. DAPI, Hoechst, Pyronin Y, etc.). Fluorescerende fargestoffer kan gi relativt nøyaktige målinger av DNA- og RNA-innhold, men denne presisjonen er bare mulig på grunn av endringene i fluorescerende egenskaper av disse fargestoffene som oppstår ved interkalering mellom nukleotidbaser. MCM-analyse er dermed ikke i stand til å måle DNA- eller RNA-innhold med tilsvarende presisjon. I stedet er massecytometrisk cellesyklusanalyse avhengig av målinger av proteiner relatert til cellesyklustilstand som cyklin B1, fosforylert retinoblastomprotein (pRb) og fosforylert histon H3 (pHH3) kombinert med direkte måling av jodatomet fra IdU-inkorporering i S-faseceller. Disse to målemetodene gir svært like resultater under normal cellulær proliferasjon, men kan potensielt være uoverensstemmende når cellesyklusprogresjonen forstyrres.

Måling av antall celler i hver cellesyklusfase er viktig for å forstå normal cellesyklusutvikling samt cellesyklusforstyrrelser, som ofte observeres ved kreft og immunologiske sykdommer. MCM gir pålitelig måling av ekstracellulære og intracellulære faktorer ved bruk av metallmerkede antistoffer; Måling av S-fasen var imidlertid begrenset da den iridiumbaserte DNA-interkalatoren ikke klarte å skille mellom 2N og 4N DNA. For å definere cellesyklusfaser utviklet Behbehani en metode som benytter IdU med en masse på 127, som faller innenfor massecytometerets område og tillater direkte måling av celler i S-fase³. Denne direkte målingen omgår behovet for sekundære antistoffer eller bruk av DNA-denatureringsmidler som syre eller DNase. I forbindelse med intracellulære syklusmarkører tillater det høy oppløsning av cellesyklusfordeling i eksperimentelle modeller.

Denne protokollen tilpasser cellesyklusmålinger fra vanlige flowcytometriprotokoller for MCM. Våre metoder gir en praktisk og enkel måte å inkludere cellesyklusparametere på. IdU-inkorporering av in vitro-prøver krever bare 10 til 15 minutters inkubasjon ved 37 °C, noe som er kortere enn de fleste BrdU-fargeprotokoller som anbefaler inkubasjonstider på flere timer ^3,7. IdU- og BrdU-inkorporerte prøver kan festes ved hjelp av en proteomisk stabilisator og deretter lagres i en fryser på -80 °C. Dette gjør at et stort antall IdU-fargede prøver kan arkiveres for batchanalyse uten reduksjon i prøvekvalitet.

Protocol

1. Utarbeidelse av IdU-aksjer

1. Løs opp 5-jod-2'-deoksyuridin (IdU) i DMSO til en konsentrasjon på 50 mM. Sterilt filter, alikot i 10-50 μL rør, og oppbevares ved -80 °C
2. Ta IdU ut av fryseren, og tine ved romtemperatur. Fortynn IdU i RPMI-1640 for å lage en arbeidsløsning ved en endelig konsentrasjon på 1 mM. Pipette opp og ned eller virvel å blande.
   1. Vanligvis fortynnes den konsentrerte IdU i mediet der cellene dyrkes (f.eks. DMEM, IMDM, etc.) eller har fortynnet den til PBS for tilsetning direkte til perifert blod eller benmargsaspiratprøver. Dette fortynningstrinnet letter blandingen av DMSO med de vandige mediene i cellene av interesse.
      MERK: Den endelige konsentrasjonen av IdU under inkubasjon skal være 10 μM; en løsning på 1 mM vil kan tilsettes i et forhold på 10 μL til hver 1 ml media.

2. IdU-inkubasjon og prøvebevaring

1. Oppbevar prøvene i en fuktet 37 °C inkubator. Fjern prøven fra inkubatoren og flytt prøven inn i en biosikkerhetshette.
2. Tilsett 10 μL av 1 mM IdU til hver 1 ml prøve.
   1. For en 6-brønnsplate, tilsett 30 μL 1 mM IdU til 3 ml kulturmedier i hver brønn. IdU kan også brukes direkte i benmargsaspirater samt murine studier⁴.
3. Sett prøven tilbake i inkubatoren ved 37 °C i 10-15 minutter. Opprettholde celler under de optimale vekstforholdene av interesse under IdU-eksponering for å få den mest nøyaktige målingen av S-fase.
4. Etter IdU-inkubasjonen, fjern prøven og overfør til et konisk rør.
5. Spinn prøven ved 400 x g i 10 minutter ved romtemperatur.
6. Aspirer supernatanten og resuspender i 200 mikrol PBS.
   1. Hvis nødvendig, utfør en levende / død flekk (ved bruk av cisplatin) på dette trinnet for å markere døde celler før fiksering og frysing.
      MERK: Rhodium levende / død farging fungerer ikke bra etter metanol permeabilisering, så det anbefales ikke for bruk i cellesyklusanalyser.
7. Tilsett 18,75 μL 16% paraformaldehyd (PFA) til PBS for en endelig konsentrasjon på 1,5% PFA. Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter. Spinn prøven ned ved 400 x g i 10 minutter ved romtemperatur.
8. Aspirer PBS/PFA-oppløsningen og resuspender prøven i 500 μL cellefargemedier (CSM; 1x PBS med 0,5 % BSA og 0,02 % natriumazid) + 10 % DMSO før frysing.
   1. Hvis du bruker kommersiell proteomisk stabilisator, tilsett 280 μL proteomisk stabilisator til prøven som er suspendert på nytt i 200 μL PBS (1: 1.4). Inkuber prøvene ved romtemperatur i 10 minutter og sett deretter direkte inn i -80 °C.
      MERK: IdU har vist seg å inkorporere effektivt innen 10-15 min inkubasjon ved 37 ° C. IdU-inkubasjoner lengre enn 10-15 minutter vil gradvis redusere oppløsningen av S- og G2-fasepopulasjonene, ettersom IdU-merkede celler forlater S-fasen og går videre til G2- eller M-fase. Vi har også observert at langvarig inkubasjon med IdU kan forårsake celledød og cellesyklusartefakter. Den påfølgende cellebehandlingen og antistofffargingen etter IdU-inkorporering er tilstrekkelig til å vaske bort gjenværende IdU som ikke ble innlemmet i S-faseceller. Vi har ikke observert signifikant jodbakgrunn ved bruk av in vitro-protokollen beskrevet her; Vi har imidlertid svært sjelden observert jodforurensning i kliniske prøver. Dette kan oppstå fra medisinske prosedyrer, for eksempel jodkontrast i en CT-skanning, eller fra jodholdige legemidler. Skulle store mengder IdU-bakgrunn observeres, bør prøven ikke kjøres for å unngå skade på massecytometerets detektor.

3. Farging av prøver for massecytometri

1. Fjern prøvene fra -80 °C og la dem tine før overflatefarging.
   1. Hvis du bruker SmartTube-fikseringsmetoden, tine prøvene ved 0-4 °C for å unngå ytterligere fiksering når prøvene varmes opp.
2. Etter at prøvene er tint, overfør ca. 1-2 millioner celler til et 5 ml FACS-rør.
3. Sentrifuger FACS-røret ved 600 x g i 5 minutter, og fyll FACS-røret med cellefargemedier (CSM) for å vaske cellene. Gjenta en gang til.
   1. Hvis celler er kjent for å holde sammen, tilsett 400 U / ml heparin til CSM-vasker for å forhindre celle til cellekontakt, men dette er ikke strengt nødvendig.
4. Inkuber cellene med FC-blokkeringsmiddel, 5 μL av midlet per 100 μL celler, i 10 minutter ved romtemperatur.
5. Forbered en blanding av antistoffer som vil flekke overflaten, eller ekstracellulær del, av cellene. Den totale fargeblandingen vil utgjøre 100 μL per 1-2 millioner celler i hver test. Fargeblandingen vil bli balansert tilsvarende med CSM og heparin i cocktailen og FACS-røret.
   MERK: Tilsetning av CSM på dette trinnet vil også redusere uspesifikke fargeartefakter⁸. Denne fargeblandingen er helt avhengig av mål av interesse og overflatefenotype (f.eks. vil en studie som involverer T-celler bruke en overflateblanding av CD45, CD3, CD4, CD8, etc.). En detaljert protokoll for prøvebehandling og farging finnes i Behbehani og McCarthy et ^al.9,10.
6. Tilsett overflatefargeblandingen i cellene og inkuber ved romtemperatur med kontinuerlig risting i 30-60 minutter.
7. Etter farging, fyll FACS-røret med CSM, og spinn ned ved 600 x g i 5 minutter.
8. Vask to ganger til med CSM, spinn prøven på 600 x g i 5 minutter og aspirer hver CSM-vask.
9. Fikser de ekstracellulære antistoffene ved å tilsette 1 ml PBS med 10% CSM og 1,5% PFA.
10. Fyll FACS-røret som inneholder PBS / CSM / PFA-blandingen med CSM. Spinn ned ved 600 x g i 5 min og aspirer supernatanten.
11. Tilsett metanol ved -20 °C.
12. Vortex prøven i 1-2 min for å oppnå en enkelt celle suspensjon og verifisere at alle celleklumper har blitt suspendert igjen.
13. Mens prøven virvler sakte, tilsett raskt 1 ml iskald metanol ved hjelp av en 1000 μL pipette med filterspiss.
14. Hold FAC-røret opp mot lyset og sørg for at det ikke er synlige klumper; Skyighet er å forvente. Eventuelle klumper vil gjøre prøven ubrukelig for senere MCM-analyse.
15. Oppbevar prøven ved -20 °C i 10-20 minutter.
16. Forbered den intracellulære fargeblandingen i løpet av denne tiden. Den intracellulære fargeblandingen vil være avhengig av mål av interesse. For cellesyklusanalyse, inkluder CyclinB1, pRb, Ki67 og pHH3 i denne fargeblandingen, men andre intracellulære markører kan tilsettes etter behov.
17. Etter 10-20 min ved -20 °C, fjern prøven, tilsett 1,5 ml PBS og fyll resten med CSM.
18. Sentrifuger prøven 600 x g i 5 minutter, og aspirer supernatanten.
19. Vask to ganger til med CSM, spinn prøven ned ved 600 x g i 5 minutter og aspirer supernatanten hver gang.
20. Etter siste CSM-vask, sentrifuger prøven og etterlater et restvolum på ca. 50 μL.
21. Tilsett den tilberedte antistoffblandingen (tilsett vanligvis 50 μL antistofffargingscocktail for å oppnå et endelig fargevolum på 100 μL) til prøven og inkuber på en risteplattform i 30 til 60 minutter ved romtemperatur.
22. Etter farging tilsett CSM og sentrifuge ved 600 x g i 5 minutter.
23. Aspirer CSM, vask igjen med CSM, spinn ved 600 x g i 5 minutter, aspirer CSM, og tilsett deretter PBS.
24. Etter ferdigstillelse av intracellulær farging, plasser celler i en interkalatorløsning som fikserer antistoffene mot cellene og flekker DNA fra hver celle for å muliggjøre identifikasjon. Interkalatorløsningen inneholder ikke-isotopisk ren iridiuminterkalator (pentametylcyklopentadienyl-Ir(III)-dipyridofenazin) tilsatt fra produsentens stamløsning i en konsentrasjon på 500 μM. Fortynn Iridium-bestanden 1:4000 i en løsning av PBS og 1,5% PFA. Tilsett iridiuminterkalatorløsningen ved 100-200 μL per million celler for å flekke jevnt og forhindre overfarging.
    MERK: Iridiumet i denne interkalatorløsningen er ment å identifisere celler for singletgating, det skal ikke brukes til levende/døde flekker. Hvis levende/døde flekker ønskes, må de utføres før fiksering som nevnt ovenfor og i McCarthy et ^al.9.
25. Oppbevar prøvene i interkalatoroppløsning i kjøleskap på 4 °C i opptil to uker før prøvetaking på CyTOF.

4. Masse cytometer drift

MERK: Massecytometrioperasjon kan være maskinspesifikk. Det anbefales alltid å sjekke CyTOF brukerhåndboken før bruk. I tillegg er det for tiden to JoVE-artikler som omhandler maskinoppstart og vedlikehold ^9,11.

1. Kontroller forstøveren for eventuelle tresko, sprekker og andre uregelmessigheter før du bruker massecytometeret.
2. Koble forstøveren til cytometeret og start oppvarmingsprosedyren. Ikke start massecytometeret uten at forstøveren er på plass.
3. Kjør vann gjennom prøvelinjene når massecytometeret er ferdig oppvarming. Sprøytekammeret må nå ca. 200 °C før justering eller prøveanalyse utføres.
4. Kjør vann i 5-10 min. Etter 5-10 min, last innstillingsløsningen og velg innstillingslederen. Tuningløsningen er en løsning som inneholder faste konsentrasjoner av metaller og brukes til å optimalisere massecytometeret før prøvetaking
5. I justeringsbehandling velger du Forhåndsvisning når innstillingsløsningen har nådd en treffrekord i jevn tilstand for å starte den automatiserte innstillingsprosessen.
6. Når tuningen er ferdig, fyll prøvetakeren med vann og la vann renne gjennom prøvelinjene under prøvebehandling. Detaljert protokoll for daglig cytometerdrift og tuning finner du hos Leipold¹¹.
7. Noen ganger vil den automatiserte innstillingen ikke stille inn optimal maskinytelse. Gjenta innstillingsprosedyren for å rette opp dette.
8. Vask prøven med CSM én gang og med rent avionisert vann to ganger før prøvetaking. Vask med vann er viktig for å fjerne restsalt fra PBS/CSM.
9. Kontroller følsomheten og prøvestrømmen ved hjelp av produsentleverte likevektsperler, polystyrenperler lastet med kjente metallkonsentrasjoner.
10. Endre anskaffelsesmodus fra innstilling til hendelsesopptaksmodus. Sett tidsgrensen for å stoppe oppkjøpet på 120 s. Vent 45 s før du velger Record.
11. Massecytometeret stopper prøvetakingen automatisk etter 120 sekunder. Bruk regnplottviseren til å sjekke intensiteten på Eu151 og Eu153.
12. Fortynn likevektsperler i rent avionisert vann i forholdet 1:20.
13. Før prøveinnsamling må du sjekke eksperimentadministratoren. Bruk eksperimentadministratoren til å tilordne navn til kanaler og legge til kanaler som skal registreres.
    1. Kontroller at 127-I-kanalen er lagt til hvis du bruker IdU.
    2. Merk at det er viktig å stille inn massecytometeret til å måle de nødvendige parametrene (f.eks. IdU) før prøvetaking. Hvis kanaler ikke er valgt på forhånd, blir ikke data samlet inn fra noen ikke-valgt kanal og kan ikke gjenopprettes.
14. Fortynn cellene til en konsentrasjon på ca. 1-2 x 10⁶ / ml ved bruk av 1:20 rent avionisert vann og likevektsperleblanding. Før cellene gjennom filtertoppet FACS-rør for å fjerne eventuelle gjenværende klumper.
15. Last inn prøven og endre innsamlingstiden.
16. Trykk på Forhåndsvisning og vent til antall hendelser per sekund stabiliserer seg.
    1. Ikke kjør hendelser over 400 hendelser per sekund, dette vil føre til betydelige mengder dubletter og rusk. Vi samler vanligvis minst 20 000 til 50 000 cellehendelser, men det optimale antallet vil avhenge av det eksperimentelle designet. Farging av opptil 2 millioner celler vil typisk gi 300 000 til 400 000 cellehendelser. Vær oppmerksom på at ikke alle hendelser vil være celler (det vil være rusk og perlehendelser inkludert i hendelsesantallet).
17. Når prøveinnsamlingen er ferdig, legg inn en vaskeløsning, start prøveinduksjonen og kjør i 5-10 minutter. Etter 5-10 minutter stopp prøveinduksjonen og kjør vann i 10-20 minutter. Vaskeoppløsning er en svak løsning av flussyre designet for å fjerne gjenværende metall fra prøvelinjene.
18. Slå av massecytometeret og fjern forstøveren. Nebulisatoren vil være varm, vær forsiktig under håndtering.

5. Dataanalyse

1. For å fjerne perler og også korrigere for signaldrift under prøveinnsamling, normaliser FCS-filene ved hjelp av Fluidigm-programvare eller applikasjonen utviklet av Finck¹².
2. Last opp FCS til Cytobank eller annen programvare for flowcytometrianalyse. FCS-filer kan brukes i hvilken som helst kompatibel programvare, i forbindelse med denne protokollen er all gating og videre analyse gjort i Cytobank¹³.
3. Før cellesyklusporter kan tegnes, ekskludere dubletter eller cellerester fra nedstrømsanalyse, kan dette gjøres ved å bruke det biaksiale plottet av hendelseslengde vs 191-Ir (figur 1a). Celler vil danne en distinkt, lys populasjon Ir^høy som kan brukes til å utelukke dubletter og rusk. Dette er singletporten. Denne gating-metoden fjerner vanligvis omtrent 50–60 % av dublettcellehendelsene, så det kan være nødvendig med ytterligere strategier for å fjerne gjenværende dublettcellehendelser.
   1. Endre skalaen for hendelseslengde (minimum og maksimum) for å gjøre cellene mer fremtredende for å hjelpe til med singlet gating.
   2. Fjern dubletter og rusk ytterligere ved å bruke Gaussiske parametere, Residual og Offset. En høyere rest med lavere forskyvning er også rusk og dubletter, og gating rundt denne populasjonen kan ytterligere fjerne dubletter og rusk (figur 1b,c).
4. S-fase gating - S-fase er den enkleste porten å tegne, men også den viktigste. Tegn denne porten ved hjelp av et biaksialt plott av IdU vs pRb, Ki67 eller cyclinB1. IdU⁺ -celler i S-fase vil danne en distinkt populasjon når man ser på disse biaksiale plottene (figur 2b).
5. G0 / G1-fase, G2 / M-fase gating - Etablere G0 / G1 og G2 / M faseportene på IdU vs CyclinB1-plottet, og bruken av IdU-inkorporering er avgjørende for å etablere grensen mellom G0 / G1 og G2 / M faseportene. G0/G1-fasen vil være CyclinB1^lav/IdU^- og G2/M-fasen vil være CyclinB1^high/IdU^-. God CyclinB1-farging vil vise en naturlig populasjon mellom G0-G1- og G2-M-populasjonene; Dette vil imidlertid variere på tvers av prøve- og celletyper under eksperimentelle forhold. Under eksperimentelle forhold hvor cellesyklusfordelingen kan påvirkes og det er mindre separasjon mellom CyclinB1, G0 / G1-fase og G2 / M-fase, vil bruk av S-fasen tillate konsistent gating for bestemte celletyper i hvert enkelt eksperiment. Denne metoden er beskrevet nedenfor.
   1. Plott bare S-fasecellene på CyclinB1 vs IdU for å bidra til å etablere separasjonen mellom G0 / G1-fase og G2 / M-fase. Tegn en port^på CyclinB1-populasjonen og juster til omtrent de øverste 5% av S-fasepopulasjonen er inne i porten (figur 2c). Dette etablerer brytningspunktet mellom faseportene G0/G1 og G2/M (figur 2e,f). Den aktive populasjonen vil bli endret til populasjonen av interesse og den delen som bor innenfor den forrige porten vil være G2/M-fasepopulasjonen, mens resten vil være G0/G1-fasepopulasjonen.
6. G0-fase gating - Etablere G0-fasen på pRb vs IdU-plottet. G0-fasen vil være representert av en pRb^lav/^{IdU-populasjon} . Den aktive syklingspopulasjonen vil ha høyt uttrykk for pRb- og IdU-inkorporering, G0-faseporten kan tegnes på denne grensen slik den vanligvis uttrykkes ved to distinkte populasjoner (figur 2g,i).
   1. Definer G0-fasen ved å gjøre populasjonen i S-fase tegnet tidligere (figur 2b) til den aktive populasjonen og tegne en port som inkluderer de øverste 90-100% av den^{pRb høye} populasjonen. Dette er pRb+-syklingspopulasjonen (figur 2i), den^lave pRb-populasjonen utenfor denne porten er G0-populasjonen (figur 2j).
   2. Hvis pRb ikke er tilgjengelig eller ikke kan registreres, bruk Ki67 vs IdU for å etablere G0-fasepopulasjonen. Ved å tegne en port som representerer majoriteten av S-fasepopulasjonen og bruke denne porten som grense for Ki67 vs IdU, vil resten av populasjonen være G0-fasen (figur 3a).
7. M-fase gating - Etablere M-fasen i IdU vs pH3 biaxial plot. M-fasen representerer en svært liten brøkdel av cellene og er styrt på den^{pH3 høye} populasjonen (figur 2d).
8. IdU-innlemmelse mislyktes eller var ikke mulig - Hvis IdU ikke er tilgjengelig, definer cellesykling og ikke sykkelbrøker ved hjelp av Ki67 og pRb. Ki67 og pRb danner under normale forhold to distinkte populasjoner, en Ki67 høy/pRb^høy og en Ki67 lav/pRb^lav. Den doble positive populasjonen representerer den aktive sykkelpopulasjonen, korrelert til G1-fase, S-fase, G2-fase og M-fase. Den doble lave populasjonen representerer den ikke-syklende befolkningen, korrelert med G0-fasen (figur 3b).
   MERK: Det er ikke mulig å avgrense hver enkelt fase ved hjelp av Ki67 vs pRb, men eksperimentelle effekter på de relative sykling / ikke sykling populasjoner kan bestemmes.
9. Cellesyklusanalyse - Når portene er etablert, eksporter de numeriske verdiene fra portene for videre analyse. Prosentandelene i hver syklus kan oppnås ved å trekke de enkelte populasjonene fra de kombinerte populasjonene. G0-fasen, tegnet på pRb lav IdU lav, portprosent kan trekkes fra G0/G1-fasen, tegnet på CyclinB1^lavIdU^neg, for åfinne G1-faseprosenten. Tilsvarende er G2-faseprosenten avledet fra subtraksjonen av M-faseporten fra G2 / M-faseporten. Dette vil generere numeriske verdier for hver enkelt cellesyklusfase; G0, G1, S, G2 og M. De numeriske verdiene som genereres for hver enkelt cellesyklusfase kan brukes til videre analyse som grafer og statistisk analyse.

Representative Results

Ved hjelp av HL-60-celler og et humant benmargsaspirat er det mulig å vise hvordan eksperimentelle forhold kan påvirke cellesyklusfordeling og analyse. Først må gating-strategien etableres for å demonstrere hvordan cellesyklusfasene er avledet. I figur 1 viser vi etableringen av singletporten, som er viktig for å separere cellulært rusk og dubletter, og etablere en enkeltcellepopulasjon. For cellelinjer er singletporten alt som trengs for å gå videre til cellesyklusanalyse (figur 2a). For humane prøver må immunfenotypiske populasjoner vanligvis etableres før cellesyklusanalyse, siden de nøyaktige grensene for hver cellesyklusport kan variere mellom forskjellige celletyper. Når populasjonene er etablert (vanligvis ved å gå på overflatemarkører som definerer populasjonen), må cellesyklusportene etableres. Figur 2b viser etableringen av S-fasen på IdU vs CyclinB1 biaxial plot. Dette plottet brukes også til å etablere grensen for G2/M-faseporten (figur 2f). Når G2/M-fasen er etablert, er resten G0/G1-faseporten (figur 2f). IdU vs pRb brukes til å etablere pRb ⁺ -syklingspopulasjonen først ved å etablere en port på IdU som inneholder celler (figur 2g,i). pRb⁺/IdU^{neg-populasjonen} utenfor denne porten er G0-fasen (figur 2j). M-fase etableres på IdU vs pHH3 hvor M-faseceller uttrykker høye nivåer av pHH3 og ikke viser noen IdU-inkorporering (figur 2k). I tilfelle pRb ikke er inkludert, kan G0-fasen replikeres ved hjelp av Ki67 på samme måte som metoden beskrevet ovenfor (figur 3a). Hvis IdU-inkorporering mislyktes eller ikke ble utført, er det fortsatt mulig å bestemme relative sykkelfraksjoner ved bruk av Ki67 og pRb. Ved å bruke Ki67 og pRb biaxial dannes to distinkte populasjoner, en pRb + / Ki67 ⁺ dobbel positiv og en pRb lav / Ki67^lav populasjon. Den doble positive populasjonen representerer celler i syklus, mens den lave representerer celler som ikke er i syklus (figur 3b). Ved å bruke IdU som inkorporerer celler og pRb^lave celler uten IdU-inkorporering, viser vi at S-fasen primært er i pRb+/Ki67⁺-populasjonen, mens G0-fasen primært er i den^lave pRb^-/Ki67-populasjonen.

Cellesyklusanalyse er avhengig av god eksperimentell teknikk, spesielt under IdU-inkubasjonstrinnet. Mens IdU-inkorporering er fleksibel (som er anvendelig i cellekultur, benmargsaspirater og til og med murine studier), er det nødvendig å utføre IdU-inkorporering og fiksering uten å forstyrre cellesyklustilstanden av eksperimentell interesse. IdU-merking og dermed nedstrøms cellesyklusanalyse kan påvirkes betydelig av tid og temperatur som indikert i figur 4. Celler som blir liggende for lenge i lukkede kar eller som kan oppstå i prøveforsendelse eller prøvetransport mellom steder, vil ha redusert S-fasefraksjon og ikke være nøyaktige for cellesyklusanalyse (figur 4a). Korte tidsperioder, de under en time totalt, vil imidlertid ha normal cellesyklusfordeling, noe som indikerer at rask transport kanskje ikke er negativt cellesyklusanalyse (figur 4b). En annen viktig modifikator er kryopreservering som rutinemessig brukes i de fleste laboratorier. Ved undersøkelse av cellesyklustilstand i kryopreserverte celler kan det være nødvendig med en lang likevektsperiode før cellene går tilbake til aktiv cellesyklus, noe som fortsatt ikke kan gjenspeile cellesyklustilstanden før cyropreservering (figur 4c).

Primære menneskelige prøver er ofte sammensatt av flere forskjellige celletyper, disse forskjellige celletyper kan ha forskjellige følsomheter for behandling som fører til forskjellig cellesyklusgating. I to benmargsaspirater som ble IdU-merket umiddelbart, lagret i 30 minutter før IdU-merking, eller kryogenisk lagret etter Ficoll-separasjon, er det forskjeller mellom hver prøve og populasjon (figur 5a,b). To immunfenotypiske populasjoner ble undersøkt for forskjeller i IdU-inkorporering; T-celler (CD45 høy/CD3^høy) og monoblaster (CD33+, HLADR⁺, CD11b^lav, CD14^neg). Med riktig kombinasjon av overflatemerker er det mulig å undersøke ytterligere immunfenotypiske populasjoner. I marg #2 var det en merkbar T-celleaktiveringseffekt etter 30 minutters lagring som ikke ble sett i monoblastene fra samme pasient (figur 5b). Som dyrkede celler var det merkbare endringer i IdU-merking etter kryogen lagring som også var avhengig av populasjon. Marg #1 hadde reduksjon i T-cellepopulasjonen, men økning i monoblaster IdU-merkede fraksjoner sammenlignet med baseline (figur 5 a,b), marg #2 viste reduksjon i både T-celler og monoblaster sammenlignet med baseline (figur 5a,b). Frosne celler krever deretter en bemerkelsesverdig inkubasjonsperiode før de går tilbake til normal cellesyklustilstand, og dette kan påvirke studier som er avhengige av å endre cellesyklustilstand eller cellesyklustilstand som en metrisk medikamentell eller eksperimentell effekt.

En annen fordel med MCM er evnen til å diskriminere celler i cellesyklusarrest eller som har unormal cellesyklusfordeling. Mens DNA-fargestoffer som vanligvis brukes i flowcytometri, er i stand til å diskriminere mellom 2N og 4N DNA-innhold, er de veldig lyse, noe som i stor grad kan komplisere måling av andre parametere fra den laseren. IdU tar imidlertid bare en massekanal og har minimal spill over, slik at andre markører kan brukes i cellesyklusbestemmelse. MOLM13-celler som ble bestrålt, viser redusert IdU-inkorporering og reduksjon i M-fase sammenlignet med kontrollceller (figur 6). Forstyrrelse av de normale cellesykluskontrollpunktene kan endre den tilsynelatende cellesyklustilstanden av MCM. Ser man på pH2AX- og cPARP-populasjoner i de ikke-bestrålte cellene, viser den^lave pH2AX- og cPARP-populasjonen normal cellesyklusfordeling, mens celler som uttrykker høyere nivåer av pH2AX eller cPARP lokaliseres hovedsakelig i G0/G1-fasen, som forventes (figur 6a). I de bestrålte cellene pH2AX lav og cPARP^lav, er cellene imidlertid nesten helt lokalisert i G0-fasen, mens pH2AX^høye og cPARP^lave celler viser cellesyklusarrestfenotype med IdU-inkorporering og lokalisering til G0/G1-fase og G2-fase med fravær av M-fase. De høye cellene i pH2AX og cPARP^viser også celler som inkorporerer noe IdU^og lokaliserer til G0/G1-fasen som indikerer strålingsskade (figur 6b).

Figur 1: Etablering av singletportene ved bruk av 191-Ir etter hendelseslengde og også gaussiske parametere, Residual og Offset.
Forskjellene i T-celle (CD45+/CD3+) og S-fase (IdU⁺) mellom en ungert prøve (a), en hendelseslengde vs 191-Ir singletport (b), eller en singletport kombinert med gaussiske parametere, residual og offset (c). Singlet gating fjerner rusk, dubletter og perler vist i tap av pRb^høy populasjon på høyre hjørne av biaxial. Denne singletporten kan optimaliseres ytterligere ved å inkludere Gaussiske parametere som gjenværende og offset, og fjerne mer rusk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Gatingskjemaet for etablering av cellesyklusporter for G0-, G1-, S-, G2- og M-faser ved bruk av IdU, CyclinB1, pRb og pHH3.
Singletporten er etablert for å fjerne dubletter og rusk (a). S-fasen må etableres (b), når S-fasen er etablert kan IdU⁺-populasjonen brukes til å etablere G2/M-fasegrensen (c,d). Etableringen av G2/M-fasegrensen fastsetter grensene for populasjonen G0/G1-fase (f). Populasjonen i pRb⁺ og G0-fase er etablert på IdU vs pRb biaxial. IdU+-cellene (h) brukes til å etablere grensen for pRb⁺-populasjonen (i). Grensen for pRb⁺-populasjonen etablerer grensen for G0-fasepopulasjonen (j). M-fasen etableres på pHH3⁺-celler som er IdU^- (k). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Etablering av cellesyklusporter uten bruk av pRb eller uten bruk av IdU-inkorporering.
Tegning av G0-fasen kan også gjøres ved hjelp av Ki-67 etter samme gatingstrategi som ble brukt med pRb, hvis pRb ikke er inkludert i forsøket (a). Hvis IdU-inkorporering mislyktes eller ikke ble utført, er det mulig å fortsatt gjenopprette de relative cellesyklingsfraksjonene ved bruk av Ki67 og pRb. Ki67 og pRb dobbelt positivt uttrykk er korrelativert til celler i syklus, som vist ved å demonstrere at IdU ⁺ -cellene hovedsakelig finnes i den dobbelt positive populasjonen (b). Ki67 og pRb lav populasjon korrelerer med G0-fase eller ikke sykling populasjonen demonstrert av pRb lav / IdU^neg celler som finnes i Ki67 og pRb^lav populasjon. Denne metoden kan ikke diskriminere individuelle cellesyklusfaser, men kan fortsatt brukes til å bestemme relative syklingsfraksjoner under eksperimentelle forhold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Representative tall for effekten av forskjellige lagringsbetingelser på cellesyklusfordelingen av HL-60-celler.
Cellene ble inkubert i en time etterfulgt av en times hvile ved de angitte temperaturforholdene i forseglede rør (a). Det er merkbare effekter på cellesyklusfordelingen sammenlignet med kontrollen. HL60-celler ble holdt i forseglede rør ved romtemperatur i 30 minutter, en situasjon som kan oppstå i en klinisk setting, før IdU-inkorporering (b). Forseglede rør holdt ved romtemperatur i 30 minutter viste ikke nevneverdige cellesyklusforskjeller. Effekten av kryogen lagring ble undersøkt på cellesyklus i HL60-celler, hvor en prøve ble tatt før kryogen lagring og en prøve tatt etter en times hvile etter en uke i kryogen lagring (c). Én time etter tining påvirkes cellesyklusfordelingen, og cellesyklusdistribusjonen går ikke tilbake til normalt før omtrent en uke etter tining. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Prosessering kan påvirke pasientprøver og representative bilder vises mellom to ulike pasienter som viser (a) T-celler (CD45 høy/CD3 ^høy) og (b) monoblaster (CD33+, HLADR⁺, CD11b^lav, CD14^neg).
Mellom marg en og marg to er det klart at i marg 2 var det en T-celle aktiveringseffekt i løpet av 30 minutters hvile, mens marg en ikke hadde noen slik effekt. Marg én viste mulig aktiveringseffekt i monoblastpopulasjonen etter 30 minutter, mens marg to ikke gjorde det. I begge margene var det imidlertid klart at kryogen lagring påvirket cellesyklusfordelingen uavhengig av celletype. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: MOLM13-celler ble enten stående som kontroller eller bestrålt med røntgenbestråler ved 10Gy.
MOLM13-celler viser cellesyklusfordelingen i fire forskjellige populasjoner av pH2AX og cPARP-uttrykk. Kontrollceller viser minimal farging av pH2AX og cPARP, med normale cellesyklusegenskaper vist i pH2AX^lav og cPARP^lav populasjon (a). Mens de bestrålte cellene viser en unormal cellesyklusfordeling med flertallet av syklingscellene lokalisert i pH2AX høy og cPARP^høy, noe som indikerer cellesyklusforstyrrelse (b). De ikke-skadede, pH2AX^lave og cPARP^lave, cellene viser mangel på syklusegenskaper finnes først og fremst i G0-fasen. Uten disse markørene ville disse cellene fremstå som 4N- og 2N-celler i normal flowcytometri, noe som muligens forvirrer nedstrøms cellesyklusanalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Eksemplene som presenteres her viser hvordan man bruker en MCM-plattform til å analysere cellesyklusfordeling. Det har også blitt påvist at cellesyklusanalyse er følsom for eksperimentelle forhold som tid og temperatur, noe som er en viktig vurdering forskere må ta når de vurderer MCM for deres cellesyklusanalyse¹⁴. Prøver som er lagret i en kort periode, ikke lenger enn en time, vil ha IdU-inkorporering som kan sammenlignes med deres normale tilstand. Prøver i et lukket system i lange perioder, ca. 2 timer, vil ha redusert IdU-inkorporering, men de relative syklings- og ikke-syklingsfraksjonene vil ikke endres slik at grovcellesyklusanalyse. Kryogen lagring og påfølgende tining forstyrrer normal cellesyklusfordeling i en betydelig tidsperiode. Kryogen lagring har tidligere blitt observert å forstyrre protein- og RNA-distribusjon, men har bare nylig vist seg å forstyrre cellesyklusen^14,15,16,17. Samlet indikerer disse at hvis det forventes lange lagringstider eller kryogen konservering av prøver, vil det være bedre å flekke cellene med IdU før lagring eller kryogen lagring, fikse cellene og lagre dem til analysen kan gjøres. Siden cellesyklusanalyse av MCM ikke krever levende celler, vil dette gjøre det mulig for forskere å banke dyrebare prøver og utføre nøyaktig nedstrøms cellesyklusanalyse.

Cellesyklusanalyse ved MCM er et robust system som er i stand til dyp undersøkelse av eksperimentelle modeller. På grunn av MCMs høye parameterantall, ca. 40-50 massekanaler, kan cellesyklusanalyse forbindes med andre intracellulære eller ekstracellulære markører som omgår behovet for sortering av celler basert på immunfenotype, noe som kan føre til at betydelige cellesykluseffekter går tapt. Den høye parameternaturen til MCM egner seg til å undersøke effekter i høydimensjonale kartleggingsapplikasjoner som SPADE og viSNE. Mens SPADE og viSNE vanligvis brukes til å definere immunfenotypiske populasjoner, som deretter kan undersøkes for cellesyklusendringer, vil det også være mulig å kartlegge på cellesyklusmarkører. Avhengig av eksperimentelle forhold kan kartlegging av cellesyklusmarkører i et høydimensjonalt rom vise cellesykluskorrelasjon med legemiddeleffekt eller hvilke immunfenotypiske populasjoner som kan lokaliseres til hver syklustilstand ^3,5. Mens MCM kan være begrenset av mangel på DNA-bindende fluorescerende fargestoffer, kompenseres dette ved direkte IdU-inkorporering under S-faseceller og intracellulære cellesyklusproteiner kan brukes til å bestemme cellesyklustilstand. Disse cellesyklusproteinene kan også bidra til å diskriminere mellom stadier av cellesyklusarrest som ellers ville vises som 3N eller 4N i tradisjonell strømning ved bruk av DNA-bindende fargestoffer. Slike svært parametriske systemer er imidlertid ikke uten ulemper, og det er følsomt for forstyrrelser i cellesyklusen. Vi har vist at lange lagringstider og kryogen lagring kan påvirke cellesyklusfordelingen betydelig. Dette er spesielt viktig når man prøver å rasjonalisere eksperimentelle effekter for legemidler som kan påvirke cellesyklusfordelingen. Behandling av legemidler designet for å påvirke cellesyklusen på frosne primærprøver kan gi falske data om cellesykluseffekt når de brukes umiddelbart etter tining fra kryogen lagring. MCM er en allsidig teknologi for cellesyklusanalyse som kan brukes på en rekke eksperimentelle modeller og er spesielt egnet til dyp profilering av heterogene systemer. Som med andre svært parametriske metoder er det nødvendig å ha et nøye utformet eksperiment med passende hensyn til hvordan prosessering og eksperimentelle effekter vil påvirke cellesyklusanalyse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3059	Component of CSM
Centrifuge	Thermo Scientific	75-217-420	Sample centrifugation
Cleaved-PARP (D214)	BD Biosciences	F21-852	Identification of apoptotic cells
Cyclin B1	BD Biosciences	GNS-1	G2 Resolution
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650	Cryopreservative
EQ Four Element Calibration Beads	Fluidigm	201078	Internal metal standard for CyTOF performance
FACS Tube w/ mesh strainer	Corning	08-771-23	Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	97068-085	Cell culture growth supplement
Helios	Fluidigm		CyTOF System/Platform
Heparin	Sigma	H3393	Staining additive to prevent non-specific staining
IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine)	Sigma	I7125	Incorporates in S-phase
Ki-67	eBiosciences	SolA15	Confirmation of G0/G1
MaxPar Multi Label Kit	Fluidigm	201300	Metal labeling kit, attaches metals to antibodies
Microplate Shaker	Thermo Scientific	88880023	Mixing samples during staining
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Services	15710	Fixative
pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine	Fluidigm	201192	Cell identification during CyTOF acquisition
p-H2AX (S139)	Millipore	JBW301	Detection of DNA damage
p-HH3 (S28)	Biolegend	HTA28	M-phase Resolution
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Wash solution for cell culture and component of fixative solution
p-Rb (S807/811)	BD Biosciences	J112906	G0/G1 Resolution
Proteomic Stabilizer	SmartTube Inc	PROT1	Sample fixative
RPMI 1640	Gibco	21870-076	Cell culture growth medium
Sodium Azide	Acros Organics	AC447810250	Component of CSM/Antibody buffer, biocide