Anvendelse af pyrimidinanalogen, 5-Iodo-2′-deoxyuridin (IdU) med cellecyklusmarkører til at etablere cellecyklusfaser i en massecytometriplatform

Summary

Denne protokol tilpasser cellecyklusmålinger til brug i en massecytometriplatform. Med multiparameterfunktionerne i massecytometri muliggør direkte måling af jodinkorporering identifikation af celler i S-fase, mens intracellulære cykelmarkører muliggør karakterisering af hver cellecyklustilstand under en række eksperimentelle betingelser.

Abstract

Reguleringen af cellecyklusfase er et vigtigt aspekt af cellulær proliferation og homeostase. Forstyrrelse af de reguleringsmekanismer, der styrer cellecyklussen, er et træk ved en række sygdomme, herunder kræft. Undersøgelse af cellecyklussen kræver evnen til at definere antallet af celler i hver del af cellecyklusprogressionen samt klart at afgrænse mellem hver cellecyklusfase. Fremkomsten af massecytometri (MCM) giver et enormt potentiale for enkeltcelleanalyse med høj kapacitet gennem direkte målinger af elementære isotoper, og udviklingen af en metode til måling af cellecyklustilstanden ved MCM udvider yderligere nytten af MCM. Her beskriver vi en metode, der direkte måler 5-iodo-2′-deoxyuridin (IdU), svarende til 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU), i et MCM-system. Brug af denne IdU-baserede MCM giver flere fordele. For det første inkorporeres IdU hurtigt i DNA under dets syntese, hvilket muliggør pålidelig måling af celler i S-fasen med inkubationer så korte som 10-15 minutter. For det andet måles IdU uden behov for sekundære antistoffer eller behov for DNA-nedbrydning. For det tredje kan IdU-farvning let kombineres med måling af cyclin B1, phosphoryleret retinoblastomprotein (pRb) og phosphoryleret histon H3 (pHH3), som samlet giver klar afgrænsning af de fem cellecyklusfaser. Kombination af disse cellecyklusmarkører med det høje antal parametre, der er mulige med MCM, tillader kombination med mange andre målinger.

Introduction

Massecytometri muliggør detektion af ca. 40 parametre ved at drage fordel af massespektroskopiens høje opløsning og kvantitative karakter. Metalmærkede antistoffer anvendes i stedet for fluoroforkonjugerede antistoffer, der giver mulighed for et højere antal kanaler og producerer minimal afsmitning ^1,2. MCM har fordele og ulemper med hensyn til cellecyklusanalyse sammenlignet med flowcytometri. En stor fordel ved MCM er, at det store antal parametre muliggør samtidig måling af cellecyklustilstand på tværs af et stort antal immunofænotypisk forskellige T-celletyper i meget heterogene prøver. MCM er med succes blevet anvendt til at måle cellecyklustilstanden under normal hæmatopoiesis i humant knoglemarv³ og transgene murinmodeller af telomerasemangel⁴. Analyse af cellecyklustilstand ved akut myeloid leukæmi (AML) viste, at cellecyklus korrelerede med kendte reaktioner på kliniske terapier, hvilket giver en in vivo-indsigt i funktionelle egenskaber, der kan informere behandlingsvalg⁵. En anden fordel ved massecytometrisk cellecyklusanalyse er evnen til at måle et stort antal andre funktionelle markører, der kan korreleres med cellecyklustilstand. Nyligt arbejde har været i stand til at korrelere protein- og RNA-syntese med cellecyklustilstand ved brug af IdU og metalmærkede antistoffer mod BRU og rRNA⁶. Denne form for meget parametrisk analyse, der måler cellecyklustilstand på tværs af adskillige populationer i et kontinuum af differentiering, ville være næsten umuligt med den nuværende flowcytometriteknologi. Den største ulempe ved MCM er manglen på DNA- eller RNA-pletter, der kan sammenlignes med dem, der anvendes i fluorescerende flowcytometri (f.eks. DAPI, Hoechst, Pyronin Y osv.). Fluorescerende farvestoffer kan give relativt præcise målinger af DNA- og RNA-indhold, men denne præcision er kun mulig på grund af ændringerne i disse farvestoffers fluorescerende egenskaber, der opstår ved interkalering mellem nukleotidbaser. MCM-analyse er således ikke i stand til at måle DNA- eller RNA-indhold med tilsvarende præcision. I stedet er massecytometrisk cellecyklusanalyse afhængig af målinger af proteiner relateret til cellecyklustilstand, såsom cyclin B1, phosphoryleret retinoblastomprotein (pRb) og phosphoryleret Histone H3 (pHH3) kombineret med direkte måling af jodatomet fra IdU-inkorporering i S-faseceller. Disse to målemetoder giver meget ens resultater under normal cellulær proliferation, men kan potentielt være uoverensstemmende, når cellecyklusprogression forstyrres.

Måling af antallet af celler i hver cellecyklusfase er vigtig for at forstå normal cellecyklusudvikling samt cellecyklusforstyrrelse, som almindeligvis observeres i kræft og immunologiske sygdomme. MCM giver pålidelig måling af ekstracellulære og intracellulære faktorer ved hjælp af metalmærkede antistoffer; Måling af S-fasen var imidlertid begrænset, da den iridiumbaserede DNA-interkalator ikke var i stand til at skelne mellem 2N- og 4N-DNA. For at definere cellecyklusfaser udviklede Behbehani en metode, der anvender IdU med en masse på 127, hvilket falder inden for massecytometerets område og tillader direkte måling af celler i S-fase³. Denne direkte måling omgår behovet for sekundære antistoffer eller brug af DNA-denatureringsmidler såsom syre eller DNase. I forbindelse med intracellulære cykelmarkører tillader det høj opløsning af cellecyklusfordeling i eksperimentelle modeller.

Denne protokol tilpasser cellecyklusmålinger fra almindelige flowcytometriprotokoller til MCM. Vores metoder giver en bekvem og enkel måde at inkludere cellecyklusparametre på. Inkorporering af in vitro-prøver kræver kun 10 til 15 minutters inkubation ved 37 °C, hvilket er kortere end de fleste BrdU-farvningsprotokoller, der anbefaler inkubationstider på flere timer ^3,7. IdU- og BrdU-inkorporerede prøver kan fastgøres ved hjælp af en proteomisk stabilisator og derefter opbevares i nogen tid i en fryser på -80 °C. Dette gør det muligt at arkivere et stort antal IdU-farvede prøver til batchanalyse uden at reducere prøvekvaliteten.

Protocol

1. Forberedelse af IDU-lagre

1. 5-iodo-2'-deoxyuridin (IdU) opløses i DMSO i en koncentration på 50 mM. Sterilt filter, alikvote i 10-50 μL reagensglas og opbevares ved -80 °C
2. Fjern IdU fra fryseren, og tø op ved stuetemperatur. Fortynd IdU i RPMI-1640 for at lave en arbejdsløsning ved en slutkoncentration på 1 mM. Pipette op og ned eller hvirvel for at blande.
   1. Fortynd typisk den koncentrerede IdU i det medie, hvori cellerne dyrkes (f.eks. DMEM, IMDM osv.), eller fortynd den til PBS til tilsætning direkte til perifere blod- eller knoglemarvsaspirationsprøver. Dette forfortyndingstrin letter blanding af DMSO med de vandige medier i de relevante celler.
      BEMÆRK: Den endelige koncentration af IdU under inkubation skal være 10 μM; en opløsning på 1 mM vil kan tilsættes i et forhold på 10 μL til hver 1 ml medie.

2. IdU-inkubation og prøveopbevaring

1. Prøverne opbevares i en befugtet inkubator på 37 °C. Fjern prøven fra inkubatoren og flyt prøven ind i en biosikkerhedshætte.
2. Der tilsættes 10 μL 1 mM IdU for hver 1 ml prøve.
   1. For en plade med 6 huller tilsættes 30 μL 1 mM IdU til de 3 ml kulturmedier i hvert hul. IdU kan også anvendes direkte i knoglemarvsaspirater samt murine undersøgelser⁴.
3. Prøven anbringes tilbage i inkubatoren ved 37 °C i 10-15 minutter. Oprethold celler under de optimale vækstbetingelser af interesse under IdU-eksponering for at få den mest nøjagtige måling af S-fase.
4. Efter IdU-inkubationen fjernes prøven og overføres til et konisk rør.
5. Drej prøven ved 400 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
6. Supernatanten suges til syn, og opslæmmes i 200 μl PBS.
   1. Udfør om nødvendigt en levende / død plet (ved hjælp af cisplatin) på dette trin for at markere døde celler før fiksering og frysning.
      BEMÆRK: Rhodium levende / død farvning fungerer ikke godt efter methanolpermeabilisering, så det anbefales ikke til brug i cellecyklusanalyser.
7. Der tilsættes 18,75 μL 16% paraformaldehyd (PFA) til PBS for en slutkoncentration på 1,5% PFA. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min. Drej prøven ned ved 400 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
8. PBS/PFA-opløsningen suges op, og prøven opslæmmes igen i 500 μL cellefarvningsmedier (CSM; 1x PBS med 0,5 % BSA og 0,02 % natriumazid) + 10 % DMSO inden frysning.
   1. Hvis der anvendes kommerciel proteomisk stabilisator, tilsættes 280 μL proteomisk stabilisator til prøven opslæmmet i 200 μL PBS (1:1.4). Prøverne inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter og anbringes derefter direkte i -80 °C.
      BEMÆRK: IdU har vist sig at inkorporere effektivt inden for 10-15 min inkubation ved 37 °C. IdU-inkubationer længere end 10-15 minutter vil gradvist reducere opløsningen af S- og G2-fasepopulationerne, efterhånden som IdU-mærkede celler forlader S-fasen og går videre til G2- eller M-fasen. Vi har også observeret, at langvarig inkubation med IdU kan forårsage celledød og cellecyklusartefakter. Den efterfølgende cellebehandling og antistoffarvning efter IdU-inkorporering er tilstrækkelig til at vaske resterende IdU, der ikke blev inkorporeret i S-faseceller, væk. Vi har ikke observeret signifikant jodbaggrund ved brug af in vitro-protokollen beskrevet her; Vi har dog meget sjældent observeret jodkontaminering i kliniske prøver. Dette kan forekomme fra medicinske procedurer, såsom jodkontrast i en CT-scanning, eller fra jodholdige lægemidler. Hvis der observeres store mængder IdU-baggrund, bør prøven ikke køres for at undgå beskadigelse af massecytometerets detektor.

3. Farvningsprøver til massecytometri

1. Prøverne fjernes fra -80 °C, og lad dem tø op inden overfladefarvning.
   1. Hvis du bruger SmartTube-fikseringsmetoden, skal prøverne tøs op ved 0-4 °C for at undgå yderligere fiksering, når prøverne varmes op.
2. Når prøverne er optøet, overføres ca. 1-2 millioner celler til et 5 ml FACS-rør.
3. Centrifuger FACS-røret ved 600 x g i 5 minutter, og fyld FACS-røret med cellefarvningsmedier (CSM) for at vaske cellerne. Gentag endnu en gang.
   1. Hvis celler vides at klæbe sammen, tilsættes 400 U / ml heparin til CSM-vask for at forhindre celle til cellekontakt, men dette er ikke strengt nødvendigt.
4. Inkuber cellerne med FC-blokerende middel, 5 μL af midlet pr. 100 μL celler, i 10 minutter ved stuetemperatur.
5. Forbered en blanding af antistoffer, der vil plette overfladen eller den ekstracellulære del af cellerne. Den samlede farvningsblanding vil udgøre 100 μL pr. 1-2 millioner celler i hver test. Farvningsblandingen afbalanceres i overensstemmelse hermed med CSM og heparin i cocktailen og FACS-røret.
   BEMÆRK: Tilføjelse af CSM på dette trin reducerer også uspecifikke farvningsartefakter⁸. Denne farvningsblanding er helt afhængig af mål af interesse og overfladefænotype (f.eks. En undersøgelse, der involverer T-celler, vil bruge en overfladeblanding af CD45, CD3, CD4, CD8 osv.). En detaljeret protokol for prøvebehandling og farvning findes i Behbehani og McCarthy et al.9,10.
6. Tilsæt overfladefarvningsblandingen til cellerne og inkuber ved stuetemperatur med kontinuerlig omrystning i 30-60 min.
7. Efter farvning fyldes FACS-røret med CSM, og centrifugeres ned ved 600 x g i 5 minutter.
8. Vask to gange mere med CSM, drej prøven ved 600 x g i 5 minutter og opsug hver CSM-vask.
9. Fastgør de ekstracellulære antistoffer ved at tilføje 1 ml PBS med 10% CSM og 1,5% PFA.
10. FACS-røret indeholdende PBS/CSM/PFA-blandingen fyldes med CSM. Spin ned ved 600 x g i 5 min og sug supernatanten op.
11. Der tilsættes methanol ved -20 °C.
12. Vortex prøven i 1-2 minutter for at opnå en enkelt cellesuspension og kontroller, at alle celleklumper er blevet resuspenderet.
13. Mens prøven hvirvler langsomt, tilsættes hurtigt 1 ml iskold methanol ved hjælp af en 1.000 μL pipette med en filterspids.
14. Hold FACs-røret op mod lyset, og sørg for, at der ikke er synlige klumper; Uklarhed kan forventes. Eventuelle klumper vil gøre prøven ubrugelig til efterfølgende MCM-analyse.
15. Opbevar prøven ved -20 °C i 10-20 min.
16. Forbered den intracellulære farvningsblanding i løbet af denne tid. Den intracellulære farvningsblanding vil være afhængig af mål af interesse. Til cellecyklusanalyse inkluderer CyclinB1, pRb, Ki67 og pHH3 i denne farvningsblanding, men andre intracellulære markører kan tilføjes efter behov.
17. Efter 10-20 minutter ved -20 °C fjernes prøven, tilsættes 1,5 ml PBS, og resten fyldes med CSM.
18. Prøven centrifugeres 600 x g i 5 min, og supernatanten suges op.
19. Der vaskes yderligere to gange med CSM, centrifugeres prøven 600 x g ned i 5 minutter, og supernatanten suges til hver gang.
20. Efter den sidste CSM-vask centrifugeres prøven, og der efterlades et restvolumen på ca. 50 μL.
21. Tilsæt den tilberedte antistofblanding (tilsæt typisk 50 μL antistoffarvningscocktail for at opnå et endeligt farvningsvolumen på 100 μL) til prøven og inkuber på en rysteplatform i 30 til 60 minutter ved stuetemperatur.
22. Efter farvning tilsættes CSM og centrifugeres ved 600 x g i 5 min.
23. Opsug CSM'en, vask igen med CSM, drej ved 600 x g i 5 minutter, opsug CSM'en, og tilsæt derefter PBS.
24. Efter afslutningen af intracellulær farvning placeres celler i en interkalatoropløsning, der fikserer antistofferne til cellerne og pletter DNA'et i hver celle for at muliggøre identifikation. Interkalatoropløsningen indeholder ikke-isotopisk ren iridiumintercalator (pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazin) tilsat fra producentens stamopløsning i en koncentration på 500 μM. Iridiumstammen fortyndes 1:4000 i en opløsning af PBS og 1,5 % PFA. Tilsæt iridiuminterkalatoropløsningen ved 100-200 μL pr. Million celler for at plette jævnt og forhindre overfarvning.
    BEMÆRK: Iridium i denne interkalatoropløsning er beregnet til at identificere celler til singlet gating, det bør ikke bruges til levende / døde pletter. Hvis der ønskes levende/døde pletter, skal de udføres før fiksering som nævnt ovenfor og i McCarthy et ^al.9.
25. Prøverne opbevares i interkalatoropløsning i køleskab ved 4 °C i op til to uger før prøvetagning på CyTOF.

4. Massecytometer drift

BEMÆRK: Massecytometridrift kan være maskinspecifik. Det anbefales altid at kontrollere CyTOF brugervejledning inden betjening. Derudover er der i øjeblikket to JoVE-artikler, der beskæftiger sig med maskinstart og vedligeholdelse ^9,11.

1. Kontroller forstøveren for eventuelle tilstopninger, revner og andre uregelmæssigheder, inden massecytometeret betjenes.
2. Tilslut forstøveren til cytometeret og start opvarmningsproceduren. Start ikke massecytometeret uden forstøveren på plads.
3. Kør vand gennem prøvelinjerne, når massecytometeret er færdig med opvarmning. Sprøjtekammeret skal nå ca. 200 °C, før der udføres tuning eller prøveanalyse.
4. Kør vand i 5-10 min. Efter 5-10 minutter skal du indlæse tuningopløsningen og vælge tuning manager. Tuningsopløsningen er en opløsning, der indeholder faste koncentrationer af metaller og bruges til at optimere massecytometeret før prøvetagning
5. I tuningstyringen skal du vælge Eksempel , når tuningløsningen har nået en steady state-hitrekord for at starte den automatiserede indstillingsproces.
6. Når tuningen er færdig, fyldes prøveudtageren med vand, og vand lades løbe gennem prøvelinjerne under prøvebehandlingen. Detaljeret protokol til daglig cytometerdrift og tuning findes på Leipold¹¹.
7. Lejlighedsvis vil den automatiske tuning ikke indstille sig til optimal maskinydelse. Gentag indstillingsproceduren for at rette op på dette.
8. Prøven vaskes med CSM én gang og med rent deioniseret vand to gange før prøvetagning. Vask med vand er vigtigt for at fjerne resterende salt fra PBS / CSM.
9. Kontroller følsomheden og prøvestrømmen ved hjælp af producentleverede ligevægtsperler, polystyrenperler fyldt med kendte metalkoncentrationer.
10. Skift anskaffelsestilstand fra tuning til hændelsesoptagelsestilstand. Indstil tidsgrænsen for at stoppe anskaffelsen ved 120 sek. Vent 45 sek., før du vælger Optag.
11. Massecytometeret stopper prøveoptagelsen automatisk efter 120 sekunder. Brug regnplotfremviseren til at kontrollere intensiteten af Eu151 og Eu153.
12. Fortynd ligevægtsperler i rent deioniseret vand i forholdet 1:20.
13. Før prøveanskaffelse skal du kontrollere eksperimentadministratoren. Brug eksperimentadministratoren til at tildele navne til kanaler og til at tilføje kanaler, der skal registreres.
    1. Sørg for, at 127-I-kanalen er tilføjet, hvis du bruger IdU.
    2. Bemærk, at det er vigtigt at indstille massecytometeret til at måle de nødvendige parametre (f.eks. IdU) inden prøvetagning. Hvis kanaler ikke er valgt på forhånd, indsamles der ikke data fra nogen ikke-valgt kanal og kan ikke gendannes.
14. Cellerne fortyndes til en koncentration på ca. 1-2 x 10⁶/ml ved hjælp af 1:20 rent deioniseret vand og ligevægtsperleblandingen. Før cellerne gennem det filtrerede FACS-rør for at fjerne eventuelle resterende klumper.
15. Indlæs prøven, og skift anskaffelsestidspunktet.
16. Tryk på Eksempel, og vent på , at antallet af hændelser pr. sekund stabiliseres.
    1. Kør ikke begivenheder på over 400 begivenheder i sekundet, dette vil føre til betydelige mængder dubletter og snavs. Vi indsamler typisk mindst 20.000 til 50.000 cellehændelser, men det optimale antal afhænger af det eksperimentelle design. Farvning af op til 2 millioner celler vil typisk give 300.000 til 400.000 cellehændelser. Bemærk, at ikke alle hændelser vil være celler (der vil være snavs og perlehændelser inkluderet i hændelsesantallet).
17. Når prøvetagningen er færdig, lægges der en vaskeopløsning, startes prøveinduktion og køres i 5-10 minutter. Efter 5-10 minutter stopper prøveinduktion og løber vand i 10-20 minutter. Vaskeopløsning er en svag opløsning af flussyre designet til at fjerne resterende metal fra prøvelinjerne.
18. Luk massecytometeret og fjern forstøveren. Forstøveren vil være varm, pas på under håndtering.

5. Analyse af data

1. For at fjerne perler og også for at korrigere for signaldrift under prøveopkøb skal du normalisere FCS-filerne ved hjælp af Fluidigm-software eller applikationen udviklet af Finck¹².
2. Upload FCS til Cytobank eller anden flowcytometrianalysesoftware. FCS-filer kan bruges i enhver kompatibel software, med henblik på denne protokol er al gating og yderligere analyse udført i Cytobank¹³.
3. Før cellecyklusporte kan tegnes, skal du udelukke dubletter eller cellerester fra nedstrømsanalyse, dette kan gøres ved at bruge det biaksiale plot af begivenhedslængde vs 191-Ir (figur 1a). Celler vil danne en tydelig, lys population Ir^høj , der kan bruges til at udelukke dubletter og snavs. Dette er singlet gate. Denne gating-metode fjerner typisk ca. 50-60% af dobbeltcellehændelser, så yderligere strategier kan være nødvendige for at fjerne resterende dobbeltcellehændelser.
   1. Skift skalaen for hændelseslængde (minimum og maksimum) for at få cellerne til at fremstå mere fremtrædende for at hjælpe med singlet gating.
   2. Fjern yderligere dubletter og snavs ved hjælp af gaussiske parametre, Rest og Forskydning. En højere rest med lavere forskydning er også affald og dubletter, og gating omkring denne population kan yderligere fjerne dubletter og snavs (figur 1b,c).
4. S-fase gating - S-fase er den nemmeste port at tegne, men også den vigtigste. Tegn denne port ved hjælp af et biaksialt plot af IdU vs pRb, Ki67 eller cyclinB1. S-fase IdU ⁺ celler vil danne en særskilt population, når man ser på disse biaxiale plots (figur 2b).
5. G0/G1-fase, G2/M-fasegating – Etabler G0/G1- og G2/M-faseportene på IdU vs CyclinB1-plottet, og brugen af IdU-inkorporering er afgørende for at etablere grænsen mellem G0/G1- og G2/M-faseportene. G0/G1-fase vil være CyclinB1^lav/IdU^- og G2/M-fase vil være CyclinB1^høj/IdU^-. God CyclinB1-farvning viser en naturlig population mellem G0-G1- og G2-M-populationerne; Dette vil dog variere på tværs af prøve- og celletyper under eksperimentelle forhold. Under eksperimentelle forhold, hvor cellecyklusfordelingen kan blive påvirket, og der er mindre adskillelse mellem CyclinB1, G0 / G1-fase og G2 / M-fase ved anvendelse af S-fasen, vil det muliggøre konsistent gating for bestemte celletyper i hvert specifikt eksperiment. Denne metode er beskrevet nedenfor.
   1. Afbild kun S-fasecellerne på CyclinB1 vs IdU for at hjælpe med at etablere adskillelsen mellem G0 / G1-fase og G2 / M-fase. Tegn en port på CyclinB1^høj befolkning og juster, indtil ca. de øverste 5% af S-fasepopulationen er inde i porten (figur 2c). Dette fastlægger brudpunktet mellem G0/G1- og G2/M-faseportene (figur 2e,f). Den erhvervsaktive befolkning vil blive ændret til den relevante befolkning, og den del, der bor inden for den foregående gate, vil være befolkningen i G2/M-fasen, mens resten vil være befolkningen i G0/G1-fasen.
6. G0-fase gating - Opret G0-fasen på pRb vs IdU-plottet. G0-fasen vil blive repræsenteret af en pRb^lav/^{IdU-population} . Den aktive cykelpopulation vil have et højt udtryk for pRb og IdU-inkorporering, G0-faseporten kan tegnes på denne grænse, da den typisk udtrykker sig ved to forskellige populationer (figur 2g,i).
   1. Definer G0-fasen ved at gøre den tidligere tegnede S-fasepopulation (figur 2b) til den erhvervsaktive befolkning og tegne en port, der omfatter de øverste 90-100% af den^høje pRb-befolkning. Dette er pRb + cykelpopulationen (figur 2i), den^{pRb lave} befolkning uden for denne port er G0-befolkningen (figur 2j).
   2. Hvis pRb ikke er tilgængelig eller ikke kan registreres, skal du bruge Ki67 vs IdU til at bestemme G0-fasepopulationen. Ved at tegne en port, der repræsenterer størstedelen af S-fasepopulationen og bruge denne port som grænse for Ki67 vs IdU, vil resten af befolkningen være G0-fasen (figur 3a).
7. M-fase gating - Etabler M-fasen i IdU vs pH3 biaxial plot. M-fasen repræsenterer en meget lille brøkdel af celler og er lukket på pH3-højpopulationen (figur 2d).
8. IdU-inkorporering mislykkedes eller var ikke mulig - Hvis IdU ikke er tilgængelig, skal du definere cellecykling og ikke cykelfraktioner ved hjælp af Ki67 og pRb. Ki67 og pRb danner under normale forhold to forskellige populationer: en Ki67 høj/pRb^høj og en Ki67 lav/pRb^lav. Den dobbelt positive population repræsenterer den aktive cykelbefolkning, korreleret med G1-fase, S-fase, G2-fase og M-fase. Den dobbelte lave befolkning repræsenterer den ikke-cyklende befolkning, korreleret med G0-fasen (figur 3b).
   BEMÆRK: Det er ikke muligt at afgrænse hver enkelt fase ved hjælp af Ki67 vs pRb, men eksperimentelle effekter på de relative cyklende / ikke cyklende populationer kan bestemmes.
9. Cellecyklusanalyse - Når portene er etableret, skal du eksportere de numeriske værdier fra portene til yderligere analyse. Procentdelene i hver cyklus kan opnås ved at trække de enkelte populationer fra de kombinerede populationer. G0-fasen, trukket på pRb lav IdU lav, gate procent kan trækkes fra G0 / G1-fasen, trukket på CyclinB1^lavIdU^neg, for at finde G1-fase procent. Tilsvarende er G2-faseprocenten afledt af subtraktionen af M-faseporten fra G2/M-faseporten. Dette genererer numeriske værdier for hver enkelt cellecyklusfase; G0, G1, S, G2 og M. De numeriske værdier, der genereres for hver enkelt cellecyklusfase, kan bruges til yderligere analyse, såsom graftegning og statistisk analyse.

Representative Results

Ved hjælp af HL-60-celler og et humant knoglemarvsaspirat er det muligt at vise, hvordan eksperimentelle forhold kan påvirke cellecyklusfordeling og analyse. For det første skal gating-strategien etableres for at demonstrere, hvordan cellecyklusfaserne er afledt. I figur 1 viser vi etableringen af singletporten, som er vigtig for at adskille cellulært affald og dubletter, etablere en enkelt cellepopulation. For cellelinjer er singletporten alt, hvad der er nødvendigt for at gå videre til cellecyklusanalyse (figur 2a). For humane prøver skal immunofænotypiske populationer typisk etableres før cellecyklusanalyse, da de nøjagtige grænser for hver cellecyklusport kan variere på tværs af forskellige celletyper. Når populationerne er etableret (normalt ved at gating på overflademarkører, der definerer denne population), skal cellecyklusportene derefter etableres. Figur 2b viser etableringen af S-fasen på det biaksiale plot IdU vs CyclinB1. Dette plot bruges også til at fastlægge grænsen for G2/M-faseporten (figur 2f). Når G2/M-fasen er etableret, er resten G0/G1-faseporten (figur 2f). IdU vs pRb bruges til først at etablere pRb ⁺ -cykelpopulationen ved at etablere en port på IdU, der inkorporerer celler (figur 2g,i). pRb⁺/IdU^{neg-populationen} uden for denne gate er G0-fasen (figur 2j). M-fase er etableret på IdU vs pHH3, hvor M-faseceller udtrykker høje niveauer af pHH3 og udviser ingen IdU-inkorporering (figur 2k). I tilfælde af at pRb ikke er inkluderet, kan G0-fasen replikeres ved hjælp af Ki67 på samme måde som metoden beskrevet ovenfor (figur 3a). Hvis IdU-inkorporering mislykkedes eller ikke blev udført, er det stadig muligt at bestemme relative cykelfraktioner ved hjælp af Ki67 og pRb. Ved at bruge Ki67 og pRb biaxial dannes to forskellige populationer, en pRb ⁺ / Ki67 ⁺ dobbelt positiv og en pRb lav / Ki67^lav population. Den dobbelte positive population repræsenterer celler i cyklus, mens den lave repræsenterer celler, der ikke er i cyklus (figur 3b). Ved hjælp af IdU-inkorporering af celler og pRb^lave celler uden IdU-inkorporering viser vi, at S-fasen primært er i pRb ⁺ / Ki67⁺ populationen, mens G0-fasen primært er i pRb lav / Ki67^lav befolkning.

Cellecyklusanalyse er afhængig af god eksperimentel teknik, især under IdU-inkubationstrinnet. Mens IdU-inkorporering er fleksibel (anvendelig i cellekultur, knoglemarvsaspirationer og endda murinundersøgelser), er det nødvendigt at udføre IdU-inkorporering og fiksering uden at forstyrre cellecyklustilstanden af eksperimentel interesse. IdU-mærkning og dermed nedstrøms cellecyklusanalyse kan påvirkes betydeligt af tid og temperatur som angivet i figur 4. Celler, der forbliver for længe i lukkede beholdere, eller som kan forekomme i prøveforsendelse eller prøvetransport mellem steder, vil have reduceret S-fasefraktion og ikke være nøjagtige til cellecyklusanalyse (figur 4a). Korte tidsperioder, dem under en time i alt, vil dog have normal cellecyklusfordeling, hvilket indikerer, at hurtig transport muligvis ikke påvirker cellecyklusanalysen negativt (figur 4b). En anden vigtig modifikator er kryopræservering, der rutinemæssigt anvendes i de fleste laboratorier. Ved undersøgelse af cellecyklustilstand i kryopræserverede celler kan det være nødvendigt med en lang ligevægtsperiode, før cellerne vender tilbage til aktiv cellecyklus, hvilket muligvis stadig ikke afspejler den præcyrokonserverede cellecyklustilstand (figur 4c).

Primære humane prøver er ofte sammensætninger af flere forskellige celletyper, disse forskellige celletyper kan have forskellige følsomheder over for behandling, hvilket fører til forskellige cellecyklusgating. I to knoglemarvsaspirater, der blev IdU-mærket straks, opbevaret i 30 minutter før IdU-mærkning eller kryogent opbevaret efter Ficoll-adskillelse, er der forskelle mellem hver prøve og population (figur 5a, b). To immunofænotypiske populationer blev undersøgt for forskelle i IdU-inkorporering; T-celler (CD45 høj/CD3^høj) og monoblaster (CD33+, HLADR⁺, CD11b^lav, CD14^neg). Med den korrekte kombination af overflademærker er det muligt at undersøge yderligere immunofænotypiske populationer. I marv #2 var der en mærkbar T-celleaktiveringseffekt efter 30 minutters opbevaring, som ikke sås i monoblasterne fra den samme patient (figur 5b). Ligesom dyrkede celler var der mærkbare ændringer i IdU-mærkning efter kryogen opbevaring, der også var afhængig af befolkningen. Marv #1 havde reduktion i T-cellepopulationen, men stigning i monoblaster IdU-mærkede fraktioner sammenlignet med baseline (figur 5 a, b), marv # 2 viste reduktion i både T-celler og monoblaster sammenlignet med baseline (figur 5a, b). Frosne celler kræver derefter en bemærkelsesværdig inkubationsperiode, før de vender tilbage til normal cellecyklustilstand, og dette kan påvirke undersøgelser, der er afhængige af at ændre cellecyklustilstand eller cellecyklustilstand som en metrisk lægemiddel- eller eksperimentel effekt.

En anden fordel ved MCM er evnen til at skelne celler i cellecyklusstop, eller som har unormal cellecyklusfordeling. Mens DNA-farvestoffer, der almindeligvis anvendes i flowcytometri, er i stand til at skelne mellem 2N- og 4N-DNA-indhold, er de meget lyse, hvilket i høj grad kan komplicere måling af andre parametre fra den laser. Idu tager dog kun en massekanal og har minimal afsmitning, hvilket gør det muligt at bruge andre markører til bestemmelse af cellecyklus. MOLM13-celler, der blev bestrålet, viser nedsat IdU-inkorporering og fald i M-fase sammenlignet med kontrolceller (figur 6). Forstyrrelse af de normale cellecykluskontrolpunkter kan ændre MCM's tilsyneladende cellecyklustilstand. Ser man på pH2AX- og cPARP-populationer i de ikke-bestrålede celler, viser pH2AX lav og cPARP^lav population normal cellecyklusfordeling, mens celler, der udtrykker højere niveauer af pH2AX eller cPARP, hovedsageligt lokaliseres i G0/G1-fasen, hvilket forventes (figur 6a). I de bestrålede celler er pH2AX lav og cPARP^lav, men cellerne er næsten helt lokaliseret i G0-fasen, mens pH2AX^høje og cPARP^lave celler viser en cellecyklus arrestfænotype med IdU-inkorporering og lokalisering til G0 / G1-fase og G2-fase med fravær af M-fase. pH2AX høje og cPARP^høje celler viser også celler, der inkorporerer noget IdU og lokaliserer til G0 / G1-fasen, der indikerer strålingsskader (figur 6b).

Figur 1: Etablering af singlet-porte ved hjælp af 191-Ir efter begivenhedslængde og også gaussiske parametre, resterende og forskydning.
Forskellene i T-celle (CD45+/CD3+) og S-fase (IdU⁺) mellem en ungated sample (a), en begivenhedslængde vs 191-Ir singlet gate (b) eller en singlet gate kombineret med Gaussiske parametre, residual og offset (c). Singlet gating fjerner snavs, dubletter og perler vist i tabet af pRb^høj population i højre hjørne af biaxial. Denne singlet gate kan optimeres yderligere ved at inkludere gaussiske parametre som rest og forskydning, hvilket fjerner mere snavs. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Gating-skemaet til etablering af cellecyklusporte for G0-, G1-, S-, G2- og M-faser ved hjælp af IdU, CyclinB1, pRb og pHH3.
Singletporten er etableret for at fjerne dubletter og snavs (a). S-fasen skal etableres (b), når S-fasen er etableret, kan IdU⁺-populationen bruges til at fastlægge G2/M-fasegrænsen (c,d). Fastsættelsen af G2/M-fasegrænsen fastlægger grænserne for populationen i G0/G1-fasen (f). Den pRb ⁺ og G0-fase population er etableret på IdU vs pRb biaxial. IdU+-cellerne (h) bruges til at fastlægge grænsen for pRb⁺-populationen (i). Grænsen for pRb⁺-populationen fastlægger grænsen for G0-fasepopulationen (j). M-fasen er etableret på pHH3⁺ celler, der er IdU^- (k). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Etablering af cellecyklusporte uden brug af pRb eller uden brug af IdU-inkorporering.
Tegning af G0-fasen kan også udføres ved hjælp af Ki-67 efter den samme gating-strategi, der blev brugt med pRb, hvis pRb ikke er inkluderet i eksperimentet (a). Hvis IdU-inkorporering mislykkedes eller ikke blev udført, er det muligt stadig at genvinde de relative cellecyklusfraktioner ved brug af Ki67 og pRb. Ki67 og pRb dobbelt positiv ekspression er korreleret med celler i cyklus, som det fremgår af at demonstrere, at IdU ⁺ cellerne primært findes i den dobbelt positive population (b). Ki67 og pRb lav befolkning korrelerer med G0-fase eller ikke cyklende befolkning demonstreret ved pRb lav / IdU^neg celler fundet i Ki67 og pRb^lav population. Denne metode kan ikke skelne individuelle cellecyklusfaser, men kan stadig bruges til at bestemme relative cykelfraktioner under eksperimentelle forhold. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Repræsentative tal for effekten af forskellige opbevaringsforhold på cellecyklusfordelingen af HL-60-celler.
Cellerne blev inkuberet i en time efterfulgt af en times hvile ved de angivne temperaturforhold i forseglede rør (a). Der er mærkbare effekter på cellecyklusfordeling sammenlignet med kontrollen. HL60-celler blev opbevaret i forseglede rør ved stuetemperatur i 30 minutter, en situation, der kan opstå i kliniske omgivelser, før IdU-inkorporering (b). Forseglede rør, der blev opbevaret ved stuetemperatur i 30 minutter, viste ikke mærkbare cellecyklusforskelle. Effekten af kryogen opbevaring blev undersøgt på cellecyklus i HL60-celler, hvor en prøve blev taget før kryogen opbevaring og en prøve taget efter en times hvile efter en uge i kryogen opbevaring (c). En time efter optøning påvirkes cellecyklusfordelingen, og cellecyklusfordelingen vender ikke tilbage til normal før ca. en uge efter optøning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Behandling kan have en effekt på patientprøver, og der vises repræsentative billeder mellem to forskellige patienter, der viser (a) T-celler (CD45 høj/CD3^høj) og (b) monoblaster (CD33+, HLADR⁺, CD11b^lav, CD14^neg).
Mellem marv et og marv to er det klart, at der i marv 2 var en T-celleaktiveringseffekt under 30 minutters hvile, mens marv en ikke havde en sådan effekt. Marv et viste mulig aktiveringseffekt i monoblastpopulationen efter 30 minutter, mens marv to ikke gjorde det. I begge marv var det imidlertid klart, at kryogen opbevaring påvirkede cellecyklusfordelingen uanset celletype. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: MOLM13-celler blev enten efterladt som kontrolpersoner eller bestrålet ved hjælp af en røntgenbestråler ved 10Gy.
MOLM13-celler viser cellecyklusfordelingen i fire forskellige populationer af pH2AX- og cPARP-ekspression. Kontrolceller viser minimal pH2AX- og cPARP-farvning, hvor normale cellecyklusegenskaber vises i pH2AX lav og cPARP^lav population (a). Mens de bestrålede celler viser en unormal cellecyklusfordeling, hvor størstedelen af cykelcellerne er placeret i pH2AX høj og cPARP^høj, hvilket indikerer cellecyklusforstyrrelse (b). De ikke-beskadigede, pH2AX lave og cPARP^lave, celler viser mangel på cykelegenskaber findes primært i G0-fasen. Uden disse markører ville disse celler fremstå som 4N- og 2N-celler i normal flowcytometri, muligvis forvirrende nedstrøms cellecyklusanalyse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

De eksempler, der præsenteres her, viser, hvordan man bruger en MCM-platform til at analysere cellecyklusfordeling. Det er også blevet påvist, at cellecyklusanalyse er følsom over for eksperimentelle forhold som tid og temperatur, hvilket er en vigtig overvejelse, som forskere skal tage, når de overvejer MCM til deres cellecyklusanalyse¹⁴. Prøver, der opbevares i en kort periode, ikke længere end en time, vil have IdU-inkorporering, der kan sammenlignes med deres normale tilstand. Prøver i et lukket system i lange perioder, ca. 2 timer, vil have reduceret IdU-inkorporering, men de relative cykel- og ikke-cykliske fraktioner ændres ikke, hvilket muliggør grov cellecyklusanalyse. Kryogen opbevaring og efterfølgende optøning er forstyrrende for normal cellecyklusfordeling i en betydelig periode. Kryogen lagring er tidligere blevet bemærket at forstyrre protein- og RNA-distributionen, men har først for nylig vist sig at forstyrre cellecyklus^14,15,16,17. Samlet set indikerer disse, at hvis der forventes lange opbevaringstider eller kryogen konservering af prøver, ville det være bedre at plette cellerne med IdU før opbevaring eller kryogen opbevaring, fikse cellerne og opbevare dem, indtil analysen kan udføres. Da cellecyklusanalyse af MCM ikke kræver levende celler, ville dette gøre det muligt for forskere at banke dyrebare prøver og udføre nøjagtig nedstrøms cellecyklusanalyse.

Cellecyklusanalyse ved MCM er et robust system, der er i stand til dyb forhør af eksperimentelle modeller. På grund af MCM højt parameterantal, ca. 40-50 massekanaler, kan cellecyklusanalyse blandes med andre intracellulære eller ekstracellulære markører, der omgår behovet for sortering af celler baseret på immunofænotype, hvilket kan medføre, at signifikante cellecykluseffekter går tabt. MCM's høje parameterkarakter egner sig til at undersøge effekter i højdimensionelle kortlægningsapplikationer som SPADE og viSNE. Mens SPADE og viSNE typisk bruges til at definere immunofænotypiske populationer, som derefter kan undersøges for cellecyklusændringer, ville det også være muligt at kortlægge på cellecyklusmarkører. Afhængigt af eksperimentelle forhold kan kortlægning af cellecyklusmarkører i et højdimensionelt rum vise cellecykluskorrelation med lægemiddeleffekt eller hvilke immunofænotypiske populationer der kan lokaliseres til hver cyklustilstand ^3,5. Mens MCM kan være begrænset af manglen på DNA-bindende fluorescerende farvestoffer, kompenseres dette ved direkte IdU-inkorporering under S-faseceller, og intracellulære cellecyklusproteiner kan bruges til at bestemme cellecyklustilstand. Disse cellecyklusproteiner kan også hjælpe med at skelne mellem stadier af cellecyklusstop, der ellers ville fremstå som 3N eller 4N i traditionel strømning ved hjælp af DNA-bindende farvestoffer. Sådanne meget parametriske systemer er dog ikke uden ulemper, og det er følsomt over for forstyrrelser i cellecyklussen. Vi har vist, at lange opbevaringstider og kryogen opbevaring kan påvirke cellecyklusfordelingen betydeligt. Dette er især vigtigt, når man forsøger at rationalisere eksperimentelle virkninger for lægemidler, der kan påvirke cellecyklusfordeling. Behandling af lægemidler, der er designet til at påvirke cellecyklussen på frosne primære prøver, kan give falske data om cellecykluseffekten, når de anvendes umiddelbart efter optøning fra kryogen opbevaring. MCM er en alsidig teknologi til cellecyklusanalyse, der kan anvendes på en række eksperimentelle modeller og er især velegnet til dyb profilering af heterogene systemer. Som med andre meget parametriske metoder er det nødvendigt at have et omhyggeligt designet eksperiment med passende overvejelser om, hvordan behandling og eksperimentelle effekter vil påvirke cellecyklusanalyse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3059	Component of CSM
Centrifuge	Thermo Scientific	75-217-420	Sample centrifugation
Cleaved-PARP (D214)	BD Biosciences	F21-852	Identification of apoptotic cells
Cyclin B1	BD Biosciences	GNS-1	G2 Resolution
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650	Cryopreservative
EQ Four Element Calibration Beads	Fluidigm	201078	Internal metal standard for CyTOF performance
FACS Tube w/ mesh strainer	Corning	08-771-23	Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	97068-085	Cell culture growth supplement
Helios	Fluidigm		CyTOF System/Platform
Heparin	Sigma	H3393	Staining additive to prevent non-specific staining
IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine)	Sigma	I7125	Incorporates in S-phase
Ki-67	eBiosciences	SolA15	Confirmation of G0/G1
MaxPar Multi Label Kit	Fluidigm	201300	Metal labeling kit, attaches metals to antibodies
Microplate Shaker	Thermo Scientific	88880023	Mixing samples during staining
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Services	15710	Fixative
pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine	Fluidigm	201192	Cell identification during CyTOF acquisition
p-H2AX (S139)	Millipore	JBW301	Detection of DNA damage
p-HH3 (S28)	Biolegend	HTA28	M-phase Resolution
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Wash solution for cell culture and component of fixative solution
p-Rb (S807/811)	BD Biosciences	J112906	G0/G1 Resolution
Proteomic Stabilizer	SmartTube Inc	PROT1	Sample fixative
RPMI 1640	Gibco	21870-076	Cell culture growth medium
Sodium Azide	Acros Organics	AC447810250	Component of CSM/Antibody buffer, biocide